一种花椒叶黄酮和多糖同步提取方法

技术领域

本发明涉及植物有效成分提取技术领域，具体是一种花椒叶黄酮和多糖同步提取方法。

背景技术

目前，花椒叶中黄酮、多糖主要采用热水浸提法、超声波法、超临界萃取法和微波提取法等进行提取，但是提取率较低，且多集中在对单一成分的提取，资源利用率较低，成本较高，微生物发酵技术主要是利用微生物在生长代谢过程中分泌的各种生物酶类，破坏植物细胞的结构，使活性成分能够较大程度溶出，提高提取效率，里氏木霉、黑曲霉、放线菌和枯草芽孢杆菌等均可产纤维素酶、蛋白酶等酶类，能够破坏植物细胞壁，使营养物质大量溶出。

本发明通过黑曲霉和枯草芽孢杆菌混合发酵技术结合超声波提取技术从花椒叶中同步提取黄酮和多糖，并采用正交试验优化发酵提取条件，以实现花椒叶中黄酮和多糖最大程度的提取。

发明内容

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种花椒叶黄酮和多糖同步提取方法，其特征在于，包括以下工艺步骤：

①花椒叶预处理

将花椒叶于55-65℃恒温干燥箱中烘干，粉碎后过60目筛，制得花椒叶粉；

②发酵培养基的制备

称取适量的花椒叶粉，按照料液比加入超纯水，混匀后于110-130℃灭菌15-25min，冷却至室温后，按照相应的接种量和菌种比例接入经活化后的枯草芽孢杆菌和黑曲霉混合种子液，置于恒温振荡培养箱中，进行发酵培养，设置相应的温度和转速，进行发酵培养；

③黄酮的提取

发酵结束后，加入60％乙醇，置于超声波清洗机中，在超声功率100W、超声频率40kHz条件下提取30min，温度为60℃，过滤；

④多糖的提取

取步骤③的滤渣，加入4倍体积的超纯水，置于超声波清洗机中，在超声功率100W、超声频率40kHz条件下提取30min，温度为60℃，过滤浓缩。

进一步地，作为优选，所述料液比为1:20(g:mL)。

进一步地，作为优选，所述接种量为5％。

进一步地，作为优选，所述黑曲霉和枯草芽孢杆菌混合种子液菌种比例为1:2。

进一步地，作为优选，所述发酵培养的温度为31℃、转速为150r/min，发酵时间为3d。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)首次采用黑曲霉和枯草芽孢杆菌混合发酵花椒叶，通过黑曲霉和枯草芽孢杆菌生长代谢产生的纤维素酶，破坏花椒叶的细胞壁，促进黄酮和多糖的溶出，提高了提取率；

(2)采用微生物发酵技术与超声波提取结合的新型提取方法，从花椒叶中同步获得黄酮和多糖，减少了时间和能源的消耗，节约了成本。

附图说明

图1为料液比对花椒叶黄酮和多糖含量的影响；

图2为接种量对花椒叶黄酮和多糖含量的影响；

图3为菌种比例对花椒叶黄酮和多糖含量的影响；

图4为发酵温度对花椒叶黄酮和多糖含量的影响；

图5为发酵时间对花椒叶黄酮和多糖含量的影响

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

1材料与方法

1.1实验方法

1.1.1花椒叶预处理

选用新鲜花椒叶，去除烂叶、枯叶，流水洗去表面杂质，于60℃恒温干燥箱中烘干，粉碎后过60目筛，得花椒叶粉。该花椒叶粉保存于室温、避光、干燥的环境中。

1.1.2发酵培养基的制备

称取适量的花椒叶粉，按照料液比加入超纯水，混匀后于121℃灭菌20min，冷却至室温，按照相应的接种量和菌种比例接入经活化后的枯草芽孢杆菌和黑曲霉混合种子液，置于恒温振荡培养箱中，设置相应的温度和转速，进行发酵培养。

1.1.3黄酮的提取

发酵结束后，加入60％乙醇，置于超声波清洗机中，在超声功率100W、超声频率40kHz条件下提取30min，温度为60℃。过滤，测定溶液中黄酮含量。

1.1.4多糖的提取

取1.3.3的滤渣，加入4倍体积的超纯水，置于超声波清洗机中，在超声功率100W、超声频率40kHz条件下提取30min，温度为60℃。过滤浓缩，取5.0mL浓缩液定容至50mL，测定溶液中的多糖含量。

1.1.5多糖含量的测定

采用苯酚硫酸法测定总糖含量：分别移取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL标准溶液和1.0mL样品溶液置于10mL的具塞试管中，加超纯水补至1mL。加入1.0mL 5％的重蒸苯酚，摇匀后加入5.0mL浓硫酸，涡旋混匀，于水浴锅100℃加热15min，流水冷却至室温于波长490nm测吸光度值。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，得标准方程为：y＝4.4461x+0.0323(R

式中：C，提取液中总糖浓度，mg/mL；V，提取液体积；n，稀释倍数；m，花椒叶质量，g。

采用DNS法测定还原糖的含量：分别取0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL标准溶液和1.0mL样品溶液置于10mL的具塞试管中，补加蒸馏水至2mL。分别加入1.5mL DNS试剂，于水浴锅中100℃加热5min，流水冷却至室温，用超纯水补至10mL，混匀。在波长540nm处测定吸光度值。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，得标准方程为：y＝5.2487x+0.0588(R

式中：C，提取液中还原糖浓度，mg/mL；V，提取液体积；n，稀释倍数；m，花椒叶质量，g。

多糖含量＝总糖含量-还原糖含量

1.1.6总黄酮含量的测定

采用紫外分光光度法测定总黄酮含量：准确称取10.0mg芦丁标准品，用60％乙醇溶解，定容至100mL，制得0.1mg/mL的芦丁标准溶液。

分别取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL芦丁标准溶液和2.0mL样品溶液于10mL具塞试管中，加60％乙醇溶液补足至5mL，加入0.3mL 5％亚硝酸钠溶液，摇匀后静置6min，加入0.3mL 10％硝酸铝溶液，摇匀后静置6min，加入4mL 5％氢氧化钠溶液摇匀，静置15min。于波长510nm测定吸光度值。以芦丁浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，得标准方程为：y＝12.518x-0.0048(R

式中：C，提取液中黄酮浓度，mg/mL；V，提取液体积；n，稀释倍数；m，花椒叶质量，g。

1.1.7微生物发酵提取花椒叶黄酮和多糖单因素试验

1.1.7.1料液比的选择

称取适量的花椒叶粉，分别按照料液比1:5、1:10、1:15、1:20、1:25(g:mL)加入水，121℃灭菌20min，冷却至室温后按照5％的总接种量同时接入菌种比例为1:3的黑曲霉和枯草芽孢杆菌混合种子液，于150r/min、31℃发酵3d。

1.1.7.2接种量的选择

称取适量的花椒叶粉，按照料液比1:15加入水，121℃灭菌20min，冷却至室温后分别以1％、3％、5％、7％、9％的总接种量同时接入菌种比例为1:3的黑曲霉和枯草芽孢杆菌混合种子液，于150r/min、31℃发酵3d。

1.1.7.3菌种比例的选择

称取适量的花椒叶粉，按照料液比1:15加入水，121℃灭菌20min，冷却至室温后按照5％的总接种量分别同时接入菌种比例为1:1、1:2、1:3、2:1、3:1的黑曲霉和枯草芽孢杆菌混合种子液，于150r/min、31℃发酵3d。

1.1.7.4发酵温度的选择

称取适量的花椒叶粉，按照料液比1:15加入水，121℃灭菌20min，冷却至室温后按照5％的总接种量同时接入菌种比例为1:3的黑曲霉和枯草芽孢杆菌混合种子液，分别在25℃、28℃、31℃、34℃、37℃以150r/min发酵3d。

1.3.7.5发酵时间的选择

称取适量的花椒叶粉，按照料液比1:15加入水，121℃灭菌20min，冷却至室温后按照5％的总接种量同时接入菌种比例为1:3的黑曲霉和枯草芽孢杆菌混合种子液，于150r/min、31℃分别发酵1d、2d、3d、4d、5d。

1.1.8微生物发酵提取花椒叶黄酮和多糖正交试验

在单因素试验的基础上，选取料液比、接种量、发酵温度3个因素，以花椒叶黄酮和多糖的含量为响应值。其他试验条件为菌种比例1:2、发酵时间3d、转速150r/min、pH自然，按照正交设计表进行试验。

表1正交试验设计

1.1.9体外抗氧化活性测定

DPPH·清除活性：根据Blois

·OH清除活性：方法根据Ma

还原能力：方法根据Chen等人

1.2数据统计分析

采用SPSS 22.0软件进行数据统计分析。实验数据采用平均值±标准差表示，以P<0.05表示有显著统计学意义。

2结果与分析

2.1微生物发酵提取单因素试验结果

2.1.1料液比对花椒叶黄酮和多糖含量的影响

由图1可知，料液比在一定范围内对黄酮和多糖的含量有显著的影响(P<0.05)，在料液比小于1:15(g:mL)时，随着料液比的增大，两者的含量也增加，可能是因为料液比增大，原料与溶液之间的浓度差增大，促使花椒叶中黄酮和多糖溶出；当料液比为1:15时，黄酮和多糖的含量均达到最大值，分别为19.26mg/g、16.10mg/g；但继续增大料液比，两者的含量均呈现逐渐下降的趋势，因为料液比过大，营养物质的浓度变小，影响微生物的生长代谢，从而不利于黄酮和多糖的发酵提取。

2.1.2接种量对花椒叶黄酮和多糖含量的影响

由图2可知，当接种量低于5％时，黄酮和多糖的含量随着接种量的增加而增加，可能是由于接种量加大，微生物的发酵作用有效的提高了花椒叶中黄酮和多糖的溶出。发酵接种量为5％时，黄酮和多糖的含量达到峰值，为19.39mg/g和17.31mg/g。但随着接种量的继续增加，黄酮和多糖的含量均降低，可能是由于微生物数量出现过饱和状态，黄酮和多糖被分解利用，从而降低了含量。2.1.3菌种比例对花椒叶黄酮和多糖含量的影响

由图3可知，当黑曲霉和枯草芽孢杆菌的比例为1:2时，黄酮和多糖的含量达到最大值，为16.45mg/g和15.38mg/g，表明在此菌种比例下，黑曲霉和枯草芽孢杆菌达到了一种较好的共生状态，能够最大程度促进黄酮和多糖的溶出。但是继续增加枯草芽孢杆菌的比例，黄酮和多糖的含量呈下降趋势，这可能是因为当黑曲霉较少时，其生长缓慢；此外，过多的枯草芽孢杆菌对黑曲霉的生长繁殖产生抑制作用，从而不利于花椒叶中黄酮和多糖的释放。

2.1.4发酵温度对花椒叶黄酮和多糖含量的影响

发酵温度对黄酮和多糖的含量有显著的影响(P<0.05)，温度会通过影响微生物的活性以及生长代谢，从而对花椒叶黄酮和多糖的发酵提取产生影响。由图4可知，在25℃-31℃范围内，黄酮和多糖的含量随着温度的增加而增加，当发酵温度为31℃时，黄酮和多糖的含量达到峰值为19.03mg/g、16.82mg/g。在31℃-37℃范围内，随着温度的增加，黄酮和多糖的含量降低，这是由于温度过低或者过高，菌种活性降低，代谢能力下降，对微生物的发酵作用产生不利影响。

2.1.5发酵时间对花椒叶黄酮和多糖含量的影响

由图5可知，随着发酵时间的增加，黄酮和多糖的含量逐渐增加，在发酵3d时达到最大值，分别为15.95mg/g和13.55mg/g，随着发酵时间的延长，多糖和黄酮的含量均逐渐降低。这是因为在发酵开始时，营养物质充足，微生物生长代谢较快，花椒叶中的黄酮和多糖随着微生物的发酵而大量溶出；但随着发酵的继续，发酵体系中的营养物质被耗尽，且部分溶出的黄酮和多糖被分解利用，使其含量减低。

2.2微生物发酵提取正交试验结果

根据单因素试验的结果，料液比、接种量和发酵温度对花椒叶黄酮、多糖的含量影响显著，因此对这三个因素进行正交试验优化，分别以黄酮含量、多糖含量为响应值进行无交互作用的正交试验，正交试验设计及试验结果见表2。

表2正交优化试验结果与分析

注：X、Y分别以黄酮含量、多糖含量为响应值；

从表2可知，影响花椒叶黄酮含量的各因素主要关系为：B(接种量)>A(料液比)>C(发酵温度)；影响花椒叶黄酮含量的各因素主要关系为：B(接种量)>C(发酵温度)>A(料液比)。因此，黄酮的最优发酵条件为A

2.3最优工艺的验证试验

综合黄酮、多糖的正交试验结果，选择最优发酵条件为A

2.4体外抗氧化活性

考察最优组黄酮和多糖的体外抗氧化活性，结果如表3所示。可见，花椒叶黄酮和多糖具有一定的清除DPPH·、·OH的能力其还原力(0.79)高于相同浓度下阳性对照VC的还原力(0.71)。综上，花椒叶黄酮和多糖具有很好的体外抗氧化活性。

3结论

本文采用微生物发酵提取技术对花椒叶中的黄酮和多糖进行同步提取，在单因素试验的基础上采用正交试验对发酵提取条件进行优化，得出最佳发酵条件：花椒叶粉以1:20(g:mL)的料液比与水混合，以5％总接种量接入比例为1:2的黑曲霉和枯草芽孢杆菌混合种子液，在150r/min条件下以31℃发酵提取3d，得到的花椒叶黄酮和多糖的含量最大，分别为19.15mg/g和17.62mg/g，相比于未使用微生物发酵技术的对照组，提取量分别提高62.29％和52.03％。为花椒叶的综合开发利用提供了有价值的理论参考。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。