一种基于SPR生物传感器的流感病毒快速检测方法

技术领域

本申请属于病毒检测技术领域，涉及一种基于SPR生物传感器的流感病毒快速检测方法。

背景技术

流感病毒是一种重要的人兽共患传染病病原，其宿主广泛，传播能力强，曾引起数次全球大流行，每年不定期引起区域性暴发流行，给人类健康和畜牧养殖业带来严重损失。传统的流感病毒检测方法采用PCR检测或ELISA方法。但这些方法耗时耗力，无法满足现场原位检测的需求。

SPR生物传感器在环境监测、病原诊断和食品安全方面应用广泛，同时也是研究生物分子间相互作用的首选方法。由于SPR技术极大缩短了亲和力检测所需时间，因此该方法还被广泛应用到疫苗筛选与设计的相关研究。利用SPR生物传感器研究分子间相互作用，需要将检测物特异性抗体偶联到传感器芯片表面，一般分为如下几步：偶联pH筛选、抗体偶联、亲和力常数测定及结合力分析等过程。在进行相关检测之前，需要筛选适用于检测物的抗体。抗体质量、检测物所处缓冲环境是决定检测结果的两个重要因素。

发明内容

本发明提供了一种基于SPR生物传感器的流感病毒快速检测方法，并且从检测方法的简便性、灵敏度和特异性等方面对该方法进行评价，为流感病毒的快速检测提供新手段。

本发明的技术方案如下：

一种基于SPR生物传感器的流感病毒快速检测方法，包括以下步骤：

步骤1：准备设备、材料与试剂，包括SPR生物传感器，CM5芯片，pH值分别为4.0、4.5、5.0和5.5的10mmol/L乙酸钠溶液，50mmol/L NaOH，pH 7.4的HBS-EP缓冲液，氨基偶联试剂盒，流感病毒特异性抗体以及流感病毒等。

步骤2：筛选流感病毒抗体最佳偶联pH

利用pH分别为4.0、4.5、5.0和5.5的10mmol/L乙酸钠溶液将流感病毒抗体稀释至10μg/ml。将CM5芯片插入SPR生物传感器，运行SPR生物传感器抗体筛选程序，将稀释后的抗体放入进样槽，设置进样流速10μL/min，运行时间2min，待分析程序结束后，用25μL的50mmol/L NaOH清洗CM5芯片，然后进行下一抗体样品的分析。所有四种稀释抗体分析完毕后，选择反应值不低于8000pg/mm

步骤3：流感病毒抗体偶联芯片

确定最佳偶联pH后，将该pH值的10mmol/L乙酸钠溶液作为偶联缓冲液，并将流感抗体稀释至10μg/mL。将CM5芯片插入SPR生物传感器，采用氨基偶联试剂盒和SPR生物传感器自动化程序将抗体偶联在芯片表面。CM5芯片F2通道偶联流感特异性抗体，F1通道作为空白参照，偶联目标为反应值8000pg/mm

步骤4：待测样品与抗体的亲和动力学常数分析

利用pH 7.4的HBS-EP缓冲液将待检测样品按照1:5，1:10，1:20，1:40，1:80的比例稀释，分别进样检测。利用SPR生物传感器亲和动力学分析程序进行分析，每次检测流程后，利用10mmol/L glycine-HCL(pH 2.5)对芯片进行再生(20μL/min，30s)，整个过程温度为25℃。利用SPR生物传感器软件程序对结合常数(K

步骤5：待测样品与抗体的结合力分析

利用pH 7.4的HBS-EP缓冲液将待检测样品按照1:5，1:10，1:20，1:40，1:80，1:160，1:320，1:640，1:1280，1:2560，1:5120，1:10240的比例稀释，分别进样检测。利用SPR生物传感器结合力分析程序进行分析。每次检测流程后，利用10mmol/L glycine-HCL(pH2.5)对芯片进行再生(20μL/min，30s)，整个过程温度为25℃。

步骤6：阳性结果判定。若待测样品进样后，响应曲线呈抛物线持续上升形态，10mmol/L glycine-HCL(pH 2.5)进样后，响应曲线呈抛物线持续下降形态，且响应值与样品浓度呈现明显的梯度效应，则判定待测样品为流感病毒阳性，否则为阴性。

进一步特征，抗体偶联目标值为8000pg/mm

进一步特征，进样前，待测样品应12000rpm，4℃离心5min，以去除杂质。

进一步特征，可采用已知浓度的流感样品梯度稀释后进行检测，获得该方法的检测极限。

本申请的基于SPR生物传感器的流感病毒快速检测方法，可在18分钟内获得样品的检测结果，与传统核酸PCR检测和ELISA检测方法相比，具有明显的优势。

附图说明

图1为在CM5芯片表面偶联H5N1流感病毒特异性抗体的最佳pH条件筛选图。

图2(a)为梯度稀释的H5N1(a)流感病毒与H5N1特异性抗体的亲和动力学分析图。

图2(b)为梯度稀释的H1N1(b)流感病毒与H5N1特异性抗体的亲和动力学分析图。

图3(a)为梯度稀释的H5N1流感病毒与芯片表面H5N1特异性抗体结合力分析曲线图。

图3(b)为梯度稀释的H5N1流感病毒与芯片表面H5N1特异性抗体的结合力检测值分析图。

具体实施方式

下面结合附图和技术方案对本发明做进一步的详细说明。

实施例1：

一种基于SPR生物传感器的H5N1流感病毒快速检测方法，包括以下步骤：

步骤1：准备设备、材料与试剂：SPR生物传感器选用瑞典Biacore公司Biacore3000生物传感器；CM5芯片，pH值分别为4.0、4.5、5.0和5.5的10mmol/L乙酸钠溶液，50mmol/L NaOH，pH 7.4的HBS-EP缓冲液，氨基偶联试剂盒购自瑞典Biacore公司；H5N1特异性抗体购自美国Santa Cruz生物技术公司；山羊抗鼠IgG-HRP抗体购自上海Abmart生物医药有限公司；TMB底物购自北京索莱宝科技有限公司；H5N1、H1N1流感病毒为军事兽医研究所保存，病毒滴度均为分别为10

步骤2：筛选流感病毒抗体最佳偶联pH

利用pH分别为4.0、4.5、5.0和5.5的10mmol/L乙酸钠溶液将H5N1特异性抗体稀释至10μg/ml。将CM5芯片插入Biacore 3000生物传感器，运行Biacore 3000生物传感器抗体筛选程序，将稀释后的抗体放入进样槽，设置进样流速10μL/min，运行时间2min，待分析程序结束后，用25μL的50mmol/L NaOH清洗CM5芯片，然后进行下一抗体样品的分析。所有四种稀释抗体分析完毕后，选择反应值不低于8000pg/mm

步骤3：H5N1特异性抗体偶联芯片

采用pH5.0的10mmol/L乙酸钠溶液作为偶联缓冲液，并将流感抗体稀释至10μg/mL。将CM5芯片插入Biacore 3000生物传感器，采用氨基偶联试剂盒和Biacore 3000生物传感器自动化程序将抗体偶联在芯片表面。CM5芯片F2通道偶联流感特异性抗体，F1通道作为空白参照，偶联目标为反应值8000pg/mm

步骤4：H5N1和H1N1流感病毒与H5N1特异性抗体的亲和动力学常数分析

利用pH 7.4的HBS-EP缓冲液将H5N1和H1N1流感病毒分别按照1:5，1:10，1:20，1:40，1:80的比例稀释，分别进样检测。利用Biacore 3000生物传感器亲和动力学分析程序进行分析，每次检测流程后，利用10mmol/L glycine-HCL(pH 2.5)对芯片进行再生(20μL/min，30s)，整个过程温度为25℃。利用Biacore 3000生物传感器软件程序BIAevalutionSoftware 4.1对结合常数(K

表1为H5N1、H1N1流感病毒与H5N1单克隆抗体的亲和动力学分析

注：1：1Langmuir-binding模型用来测定动力学平衡常数K

步骤5：H5N1流感病毒与H5N1特异性抗体的结合力分析

利用pH 7.4的HBS-EP缓冲液将H5N1流感病毒按照1:5，1:10，1:20，1:40，1:80，1:160，1∶320，1∶640，1∶1280，1∶2560，1∶5120，1∶10240的比例稀释，分别进样检测。利用Biacore 3000生物传感器结合力分析程序进行分析。每次检测流程后，利用10mmol/Lglycine-HCL(pH 2.5)对芯片进行再生(20μL/min，30s)，整个过程温度为25℃。如图3(a)、图3(b)所示为H5N1流感病毒与H5N1特异性抗体的结合力分析。

步骤6：阳性结果判定。如图2(a)、图2(b)所示，H5N1流感病毒进样后，响应曲线呈抛物线持续上升形态，10mmol/L glycine-HCL(pH 2.5)进样后，响应曲线呈抛物线持续下降形态，且响应值与样品浓度呈现明显的梯度效应，因此检测结果为阳性。而H1N1流感病毒进样后，响应曲线并未呈抛物线持续上升，因此为阴性。

步骤7：检测灵敏度分析(与传统ELISA检测方法相比)

利用相同的H5N1流感病毒特异性抗体，分别进行SPR生物传感器检测和ELISA检测。检测结果如表2所示，SPR生物传感器检测方法检测限略高于ELISA检测方法，但是抗体使用量和检测时间方面，要明显优于ELISA检测。因此，SPR检测方法在面对大量待检样品时具有明显优势，适合快速初筛使用。

表2为SPR生物传感器检测方法与传统ELISA检测方法的比较。

注：H5N1检测样品为140μL。H5N1单克隆抗体在芯片上的偶联量为8000RU，而1RU对应1pg/mm