一种多糖类抗原-抗体复合物解离剂及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种多糖类抗原-抗体复合物解离剂及其应用。

背景技术

多糖类抗原进入机体后，与宿主的免疫抗体结合形成抗原抗体复合物，免疫抗体占据了抗原表位，限制了免疫学方法检测多糖类抗原的灵敏度。现有方法通常采用EDTA-2Na热处理血液样本，解离多糖类抗原-抗体复合物，再进行免疫学检测。以BioRad公司的曲霉半乳甘露聚糖检测产品为例，首先将样本与EDTA-2Na溶液按照3:1的比例混合，再100～120℃加热处理3～6min，4℃离心10～15min，吸取上清进行免疫学检测。该操作需要在不同温度下处理样本，较繁琐，对设备依赖性大，增加了操作成本、降低了检测效率。

CN1811444A公开了一种日本血吸虫压电质量免疫传感器，采用直接固定抗原法，将血吸虫优势诊断抗原分子31/32kDa共价结合于石英晶体表面，使用后的石英晶体置四氢呋喃(THF)中浸泡，THF能将抗原抗体复合物解离并从传感表面清洗下来，做到了不损害固相抗原的活性。然而，THF并不适用于解离多糖类抗原-抗体复合物。

CN101832999A公开了一种抗原抗体复合物解离液试剂盒及应用，由体积百分比浓度0.3％Triton-X100、1.5％十二烷基硫酸钠和1.5％3-[(3-胆烷酰胺丙基)-二甲铵]丙磺酸的试剂等量混合制成，所述试剂盒有效实现了待检测血清或血浆样本中病原抗原抗体复合物的迅速解离，提高了抗原和抗体的绝对浓度值，大大提高了待测样本的检测灵敏度。然而，该解离液需在56℃条件下处理样本30min，处理温度严格苛刻，且不适用于多糖类抗原-抗体复合物的解离。

因此，有必要针对多糖类抗原-抗体复合物，配制高效的解离液，在不破坏多糖类抗原的前提下，提高解离效率。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种多糖类抗原-抗体复合物解离剂及其应用，采用强酸溶液处理多糖类抗原-抗体复合物，在酸性条件下抗体已失活、而多糖类抗原仍然保持稳定的生物活性，实现了简单、高效解离多糖类抗原-抗体复合物的效果。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种多糖类抗原-抗体复合物解离剂，所述多糖类抗原-抗体复合物解离剂包括酸性解离液，所述酸性解离液包括氨基酸和强酸；

所述酸性解离液的pH为-1.0～3.0，例如可以是-1.0、0、1.0、2.0或3.0，优选为0。

本发明中，采用pH为-1.0～3.0的酸性解离液处理多糖类抗原-抗体复合物，多糖类抗原-抗体复合物在酸性条件下迅速解离，样本中的蛋白干扰物(如多糖类抗原的特异性抗体)快速失活，而多糖类抗原酸稳定性高、仍然保持生物活性，后续用中和液调节pH至5.0～9.0后，可以进一步进行多糖类抗原的免疫学检测。

本发明中，采用pH为-1.0～3.0的酸性解离液处理多糖类抗原-抗体复合物，由于多糖的耐酸性远高于蛋白，因此所述酸性解离液不仅增强了解离效果、提高了多糖类抗原的释放率，而且可以使多糖类抗原的特异性抗体不可逆失活，避免对后续免疫学检测的干扰；pH大于3.0的解离液虽然也可以实现多糖类抗原-抗体复合物的解离，但是会造成解离的特异性抗体仍然有活性，从而干扰后续的免疫学检测，降低检测结果的准确性、甚至造成假阴性。

优选地，所述氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、色氨酸、苏氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酸、组氨酸或亮氨酸中的任意一种或至少两种的组合，优选为甘氨酸和/或丙氨酸，进一步优选为甘氨酸。

优选地，所述强酸包括盐酸、硝酸或硫酸中的任意一种或至少两种的组合，优选为盐酸。

优选地，所述氨基酸在所述酸性解离液中的浓度为0.1～2M，例如可以是0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1M、1.1M、1.2M、1.3M、1.4M、1.5M、1.6M、1.7M、1.8M、1.9M或2M。

优选地，所述强酸在所述酸性解离液中的浓度为0.1～5M，例如可以是0.1M、0.5M、1M、1.5M、2M、2.5M、3M、3.5M、4M、4.5M或5M。

本发明中，采用0.1～2M氨基酸-强酸溶液、优选为0.1～2M甘氨酸和0.1～5M盐酸、或0.1～2M丙氨酸和0.1～5M硝酸、进一步优选为0.1M甘氨酸和1M盐酸溶液作为酸性解离液，解离效果好，不仅使蛋白类干扰物失活、而且保证多糖类抗原仍然具有活性，处理后的样本用于多糖类抗原的检测，检测结果准确性高。

优选地，所述多糖类抗原-抗体复合物解离剂还包括中和液，用于将含有多糖类抗原-抗体复合物的样本调节至中性pH。

优选地，所述中和液的pH为7.0～15.0，例如可以是7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0或15.0，优选为12.0～15.0。

本发明中，采用pH为7.0～15.0的中和液调节样本pH，可以快速中和酸性解离液，使样本pH达到5.0～9.0，利于后续进行多糖类抗原的免疫检测。

优选地，所述中和液为碱性或中性偏碱溶液，包括磷酸三钾溶液、磷酸三钠溶液、磷酸氢二钾溶液、磷酸氢二钠溶液、碳酸钾溶液、碳酸钠溶液、碳酸氢钾溶液、碳酸氢钠溶液或Tris碱溶液、磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述中和液为磷酸三钾溶液，磷酸三钾为强碱弱酸盐，具有较强的碱性和缓冲能力，能防止过量或不足而导致的强碱性或强酸性，所述磷酸三钾溶液的浓度为0.1～5M，例如可以是0.1M、0.5M、1M、1.5M、2M、2.5M、3M、3.5M、4M、4.5M或5M，优选为1.5M。

第二方面，本发明提供了一种多糖类抗原-抗体复合物解离方法，所述方法采用第一方面所述的多糖类抗原-抗体复合物解离剂处理样本。

优选地，所述方法包括以下步骤：

(1)向含有多糖类抗原-抗体复合物的样本中加入酸性解离液，孵育解离；

(2)向解离后的样本中加入中和液，将含有多糖类抗原-抗体复合物的样本调节至中性pH。

优选地，步骤(1)所述样本包括血液样本。

优选地，步骤(1)所述酸性解离液与所述样本的体积比为1:(0.2～10)，例如可以是1:0.2、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10，优选为1:3。

优选地，步骤(1)所述孵育解离的温度为2～40℃，例如可以是2℃、5℃、8℃、10℃、12℃、15℃、18℃、20℃、22℃、25℃、28℃、30℃、32℃、35℃、38℃或40℃，优选为37℃。

优选地，步骤(1)所述孵育解离的时间为2～20min，例如可以是2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min或20min，优选为2min。

本发明中，酸性解离液与样本按照体积比为1:(0.2～10)混合，2～40℃孵育2～20min，即实现了高效解离效果，较现有解离方法操作简便、条件可控、解离时间显著缩短。

优选地，步骤(2)所述中和液与所述样本的体积比为1:(0.2～10)，例如可以是1:0.2、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10，优选为1:4。

优选地，步骤(2)加入中和液后还包括混合均匀的步骤，优选为旋涡混匀，将中和液和样本高效快速混合。

优选地，所述旋涡混匀的转速为50～400转/min，例如可以是50转/min、100转/min、150转/min、200转/min、250转/min、300转/min、350转/min或400转/min，优选为200转/min。

优选地，所述旋涡混匀的时间为5～600s，例如可以是5s、50s、100s、150s、200s、250s、300s、350s、400s、450s、500s、550s或600s，优选为120s。

本发明中，中和液与样本按照体积比为1:(0.2～10)混合，50～400转/min旋涡5～600s，即实现了快速中和酸性解离液的效果。

作为优选技术方案，所述多糖类抗原-抗体复合物解离方法包括以下步骤：

(1)向含有多糖类抗原-抗体复合物的血液样本中加入酸性解离液，所述酸性解离液与所述样本的体积比为1:(0.2～10)，2～40℃孵育2～20min，进行孵育解离；

(2)向解离后的样本中加入中和液，所述中和液与所述样本的体积比为1:(0.2～10)，50～400转/min旋涡混匀5～600s，将含有多糖类抗原-抗体复合物的样本调节至中性pH。

第三方面，本发明提供了第一方面所述的多糖类抗原-抗体复合物解离剂在制备多糖类抗原检测试剂盒中的应用。

优选地，所述多糖类抗原包括曲霉菌半乳甘露聚糖、念珠菌甘露聚糖、隐球菌荚膜多糖或真菌1,3-β-D葡聚糖中的任意一种或至少两种的组合。

第四方面，本发明提供了一种真菌多糖检测试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的多糖类抗原-抗体复合物解离剂。

优选地，所述试剂盒还包括多糖类抗原特异性检测抗体。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明采用pH为-1.0～3.0的酸性解离液在2～40℃下处理含有多糖类抗原-抗体复合物的样本，抗原-抗体复合物迅速解离，抗体在酸性条件下失活、而多糖类抗原仍然保持生物活性，配合碱性或弱碱性中和液调节样本pH至中性后，实现了基于免疫学方法灵敏、准确检测多糖类抗原的效果；

(2)本发明的酸性解离液解离效果佳，在37℃下处理样本2min，抗原-抗体复合物即发生解离，相较于现有技术显著缩短了处理时间，且条件简单、操作简便、在常规实验条件下即可完成，易于实现自动化操作；

(3)本发明的解离剂和解离方法应用范围广泛，在检测曲霉菌半乳甘露聚糖、念珠菌甘露聚糖、隐球菌荚膜多糖和真菌1,3-β-D葡聚糖等多种多糖类抗原领域具有广阔的应用前景。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1酸性解离液的配方对检测结果的影响

本实施例配制不同浓度的甘氨酸-盐酸溶液和丙氨酸-硝酸溶液，处理血清样本，分析酸性解离液的配方对曲霉菌半乳甘露聚糖抗原的免疫学检测结果的影响。

如表1所示，甘氨酸浓度为0.1～2M、盐酸浓度为0.1～5M，或丙氨酸浓度为0.1～2M、硝酸浓度为0.1～5M，配制的酸性解离液均具有解离效果，其中，0.1M甘氨酸-1M盐酸溶液的解离效果最佳，处理后的样本用于检测曲霉菌半乳甘露聚糖抗原，得到的检测结果(曲霉菌半乳甘露聚糖抗原检测I值，I≥0.5为阳性)与传统EDTA方法的检测结果一致。

表1

实施例2酸性解离液的pH对检测结果的影响

本实施例采用甘氨酸和盐酸的组合配制不同pH的酸性解离液，处理血清样本，分析酸性解离液的pH对曲霉菌半乳甘露聚糖抗原的免疫学检测结果的影响。

如表2所示为曲霉菌半乳甘露聚糖抗原检测I值(I≥0.5为阳性)，酸性解离液在pH为-1.0～3.0的条件下、尤其在pH为0的条件下，使得抗原抗体复合物迅速解离，并使抗体快速失活，降低了抗体对曲霉菌半乳甘露聚糖抗原的免疫学检测结果的影响，处理后的样本用于检测曲霉菌半乳甘露聚糖抗原，得到的检测结果与传统EDTA方法的检测结果一致。

表2

本实施例进一步检测了酸性解离液pH对抗体活性的影响，如表3所示为曲霉菌半乳甘露聚糖IgG检测值(活性≥120AU/mL为阳性)，采用pH为-1.0～3.0的酸性解离液处理样本后，样本中抗体的检测结果低，说明抗体已基本失活。

表3

实施例3解离条件对检测结果的影响

(1)酸性解离液与血清样本的体积比

向血清样本中加入不同体积的酸性解离液(0.1M甘氨酸-1M盐酸溶液，pH＝0)，分析酸性解离液与血清样本的体积比对曲霉菌半乳甘露聚糖抗原的免疫学检测结果的影响。

如表4所示为曲霉菌半乳甘露聚糖抗原检测I值(I≥0.5为阳性)，在酸性解离液与血清样本的体积比为5:1、2:1、1:1、1:3和1:10的条件下、尤其在体积比为1:3的条件下，酸性解离液可以使得血清样本中的抗原抗体复合物迅速解离，处理后的样本用于检测曲霉菌半乳甘露聚糖抗原，得到的检测结果与传统EDTA方法的检测结果一致。

表4

(2)解离温度

如表5所示为曲霉菌半乳甘露聚糖抗原检测I值(I≥0.5为阳性)，按体积比为1:3加入酸性解离液(0.1M甘氨酸-1M盐酸溶液，pH＝0)的样本在2～40℃(2～8℃、16±8℃、25±5℃、35±5℃)条件下、尤其是37℃条件下孵育一段时间，酸性解离液可以使得血清样本中的抗原抗体复合物迅速解离，处理后的样本用于检测曲霉菌半乳甘露聚糖抗原，得到的检测结果与传统EDTA方法的检测结果一致。

表5

(3)解离时间

在37℃解离温度下解离2～20min，曲霉菌半乳甘露聚糖抗原检测I值(I≥0.5为阳性)如表6所示，发现37℃解离2min，即可实现抗原抗体复合物的迅速解离，处理后的样本用于检测曲霉菌半乳甘露聚糖抗原，得到的检测结果与传统EDTA方法的检测结果一致。

表6

实施例4中和液的配方和pH值对检测结果的影响

本实施例配制不同配方、不同pH的中和液，分析中和液对曲霉菌半乳甘露聚糖抗原的免疫学检测结果的影响。

如表7所示为曲霉菌半乳甘露聚糖抗原检测I值(I≥0.5为阳性)，不同中和液在pH为7.0～15.0的范围内均可以起到中和作用。

表7

实施例5中和条件对检测结果的影响

向酸性解离液处理的样本中加入中和液后，为快速中和酸性解离液、避免中和液对多糖类抗原的影响，采用旋涡方式进行混合处理，避免中和液沉入样本底部，旋涡的最适转速为50～400转/min，最适时间为5～600s，结果的重复性较好(CV<10％)，如表8所示。

表8

实施例6自动化检测

本实施例根据实施例1～5确定的最优条件、采用自动化设备处理样本，并进行曲霉菌半乳甘露聚糖抗原检测，步骤如下：

(1)向血清样本中按体积比为1:3加入酸性解离液(0.1M甘氨酸-1M盐酸溶液，pH＝0)，37℃孵育2min，解离抗原抗体复合物；

(2)向解离后的样本中按体积比为1:4加入1.5M磷酸三钾溶液，200转/min旋涡混匀120s，将样本调节至中性pH，利用免疫试剂盒检测样本中的曲霉菌半乳甘露聚糖抗原。

如表9所示为曲霉菌半乳甘露聚糖抗原检测I值(I≥0.5为阳性)，该方法可以实现自动化操作。

表9

本实施例进一步利用以上方法处理含有不同多糖类抗原的样本，分析酸性解离液和中和液对其他糖类及其衍生物抗原的影响。

如表10所示，酸性解离液和中和液可以保证多种多糖类抗原曲霉菌半乳甘露聚糖、念珠菌甘露聚糖、隐球菌荚膜多糖和真菌1,3-β-D葡聚糖的生物稳定性。

表10

综上所述，本发明的酸性解离液和中和液相互配合，实现了快速解离有多糖类抗原-抗体复合物的效果，处理时间短、操作简单、易于实现自动化操作，在多种多糖类抗原检测领域具有广阔的应用前景。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。