新型冠状病毒样颗粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种新型冠状病毒样颗粒及其制备方法和应用。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是一种带有包膜的RNA病毒，其正义单链RNA基因组长度大约为30kb。测序发现新型冠状病毒与非典型新冠病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS)同属与β冠状病毒属，其相似度分别达到80％和50％。研究报道显示，完整的病毒转录本含有两个大的开放阅读框：ORF1a及ORF1b。ORF1a会被翻译成一个450KD左右的多肽，这个多肽会被切割成11个非结构蛋白。在翻译过程中，由于在ORF1a终止密码子上游会迅速产生移码突变。因此，翻译可以顺利的过渡到ORF1b，允许获得一个更大的多肽，其大概为800KD左右，该多肽会被病毒蛋白酶水解成15个非结构蛋白。目前对于这些非结构蛋白功能尚不能完全确定。

组成新冠病毒的结构蛋白包括：棘突蛋白(spike protein，S蛋白)、膜蛋白(membrane protein，M蛋白)、包膜蛋白(envelope protein，E蛋白)、核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，N蛋白)。N蛋白是四个结构蛋白中唯一存在于核衣壳的蛋白，在其N端和C端含有两个独立的结构域，可以与RNA结合。除此之外，它还可以与M蛋白及其他酶相结合，有助于将病毒基因组结合在复制酶-转录酶复合物上。S蛋白位于病毒的最外侧，其主要功能在于识别并结合宿主细胞，介导病毒包膜与细胞膜的融合。值得注意的是，S蛋白上的RBD功能区域具有两种构象。只有当RBD处于“向上”构象的时候，才具有与宿主细胞结合的活性。另外S蛋白也已证明可以与人体多个器官中都有所表达的ACE2蛋白通过相互作用的方式，完成对宿主细胞的感染。

临床上对于SARS-CoV-2感染者的治疗药物主要包括RNA聚合酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、恢复期患者血浆和中药。然而，即使部分药物已体现出较好的治疗效果，但至今尚未确定对该病毒行之有效的特效药，更不存在标准化的治疗方法。正是在这样的背景下疫苗的概念应运而生，因为曾经肆虐全球的乙肝、天花等传染性疾病都是通过接种疫苗获得群体免疫而得到有效的控制。

目前，针对SARS-CoV-2的疫苗主要分为减毒活疫苗、灭活疫苗、减毒流感病毒载体疫苗、腺病毒载体疫苗和核酸疫苗。

减毒活疫苗是SARS-CoV-2进行减毒处理(利用体外传代或基因重组等方法)而得到的致病力减弱、免疫原性良好的一种由完整的病毒组成的疫苗。减毒活疫苗的免疫原性强，可引起更大范围的免疫反应，产生更持久的保护作用。但减毒活疫苗中含有活病原体，存在隐形感染隐患，且由于不同的活疫苗中病原体的致病能力各不相同，减毒活疫苗存在一定的毒力回升风险，总体的安全性并不高。

灭活疫苗是将SARS-CoV-2通过理化方法灭活研制，需要进行多次试验和筛选才能找到既失去致病能力又不至于完全丧失激活人体免疫反应的SARS-CoV-2。灭活疫苗保留了SARS-CoV-2原有的表面蛋白，抗原性与活病毒相似，但已经无法在宿主体内复制与引发感染，不存在毒力回升的问题。因此，与减毒活疫苗相比，灭活疫苗的安全性更高，不会导致人体感染。然而，灭活疫苗不能模拟SARS-CoV-2的自然感染，免疫原性不足，因此其效果低于减毒活疫苗。

减毒流感病毒载体疫苗以现有的流感病毒疫苗中的减毒的流感病毒作为载体，将编码SARS-CoV-2的S蛋白的基因转入到流感病毒载体的基因内，让流感病毒表面表达SARS-CoV-2的S蛋白。以流感病毒为载体的新型冠病毒疫苗可以同时预防新冠肺炎和流感，且流感病毒无DNA，没有将流感病毒DNA整合进宿主基因组的风险。但流感病毒的容量较小，限制了可插入外源基因的范围，且载体的靶向性不高。

腺病毒载体疫苗是以改造后无害的腺病毒为载体，将S蛋白的基因转入腺病毒的基因内(与流感病毒载体不同的是，腺病毒表面并不会表达S蛋白)。接种该疫苗后，腺病毒载体会进入细胞，由于基因缺陷，腺病毒本身无法复制，但其基因内的S蛋白基因会转录翻译表达S蛋白，这种S蛋白会从细胞内转移到细胞外，从而引动人体的免疫应答，效果较好。然而，对于被腺病毒感染过的个体(腺病毒抗体阳性的个体)，当腺病毒再次进入体内，身体内的腺病毒抗体会攻击载体而非它表达的S蛋白，从而令疫苗失效。

核酸疫苗包括DNA疫苗和mRNA疫苗。DNA疫苗直接将编码病毒抗原基因片段的DNA序列(常用质粒)注入宿主，使病毒的抗原蛋白在宿主体内表达，进而激活体液免疫和细胞免疫。该类疫苗能模仿活病毒感染方式合成内源性抗原，并被呈递给MHC I类分子诱导CD8+T细胞产生杀伤作用。然而，DNA疫苗的缺点在于这种外来的DNA可能会与细胞自身的DNA整合，因此DNA疫苗尤其需要关注安全性。RNA疫苗与DNA疫苗的技术路线类似，mRNA疫苗的原理是将病毒抗原的mRNA制为疫苗，注入宿主的mRNA可以表达病毒的抗原蛋白，从而诱发机体产生免疫应答。直接用mRNA做疫苗，无需像DNA疫苗一样需先进入细胞核完成转录过程再在胞浆进行蛋白质的翻译表达，mRNA疫苗可以直接在细胞浆内合成蛋白，比DNA疫苗省了一步。mRNA疫苗的步骤简化，不用担心病毒DNA整合到宿主DNA上。但是，mRNA不如DNA或蛋白质稳定，其最大的缺陷就是容易降解。

发明内容

基于此，有必要提供一种新型冠状病毒样颗粒的制备方法，采用该制备方法制得的新型冠状病毒样颗粒制备新型冠状病毒疫苗，可以提高新型冠状病毒疫苗的安全性、稳定性和有效性。

一种新型冠状病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：

构建用于表达新型冠状病毒的S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白的表达载体，所述S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述E蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述M蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，所述N蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；

将所述表达载体转染到宿主中，并培养转染有所述表达载体的宿主，所述宿主为植物；及

从转染有所述表达载体的宿主中提取新型冠状病毒样颗粒。

上述新型冠状病毒样颗粒的制备方法制得的新型冠状病毒样颗粒是由新型冠状病毒的结构蛋白(S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白)组装而成的大颗粒，与具有活性的新型冠状病毒相比不存在遗传物质。因此，与传统的减毒活疫苗、灭活疫苗、减毒流感病毒载体疫苗、腺病毒载体疫苗和核酸疫苗相比，采用新型冠状病毒样颗粒制得的疫苗，安全性高、稳定性好且有效性高。

在其中一个实施例中，编码所述S蛋白的核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，编码所述E蛋白的核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，编码所述M蛋白的核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，编码所述N蛋白的核酸片段的核苷酸序列如SEQ IDNo.8所示。

在其中一个实施例中，在所述表达载体中，所述S蛋白、所述E蛋白、所述M蛋白和N蛋白各自独立表达。

在其中一个实施例中，所述用于表达新型冠状病毒的S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白的表达载体包括用于表达所述S蛋白和所述E蛋白的第一重组表达载体和用于表达所述M蛋白和所述N蛋白的第二重组表达载体，所述第一重组表达载体和所述第二重组表达载体通过共转染进入所述宿主中。

在其中一个实施例中，所述第一重组表达载体通过将编码所述S蛋白的核酸片段和编码所述E蛋白的核酸片段插入pHREAC载体而得，所述第二重组表达载体通过将编码所述M蛋白和编码所述N蛋白的核酸片段插入pHREAC载体而得。

在其中一个实施例中，所述宿主为烟草。

在其中一个实施例中，所述表达载体由编码所述S蛋白的核酸片段、编码所述E蛋白的核酸片段、编码所述M蛋白的核酸片段和编码所述N蛋白的核酸片段插入同一个空载体上而制得。

一种新型冠状病毒样颗粒，由上述的新型冠状病毒样颗粒的制备方法制得。

一种表达载体，所述表达载体用于表达新型冠状病毒的S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白，所述S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述E蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述M蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，所述N蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

上述的新型冠状病毒样颗粒或上述的表达载体在制备预防或治疗新型冠状病毒感染的药物中的应用。

一种新型冠状病毒疫苗，包括上述的新型冠状病毒样颗粒。

附图说明

图1为pHREAC-S-E质粒的结构示意图；

图2为pHREAC-N-M质粒的结构示意图；

图3为注射有表达载体的烟草中N蛋白的表达情况；

图4为注射有表达载体的烟草中S蛋白在表达情况；

图5为在注射有表达载体的烟草中培养4天后及野生型烟草中的N蛋白的表达情况；

图6为在注射有表达载体的烟草中培养4天后及野生型烟草中的S蛋白表达情况；

图7为25％及70％蔗糖垫底粗提的结果；

图8为氯化铯连续密度精纯后的SDS-PAGE图；

图9为以N蛋白抗体检测图8中编号40～64的样品中新冠病毒样颗粒的分布情况的结果；

图10为以S蛋白抗体检测图8中编号40～64的样品中新冠病毒样颗粒的分布情况的结果；

图11为新冠病毒样颗粒的电镜图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。术语解释：病毒样颗粒(VLPs)是由病毒结构蛋白组装而成的大颗粒，与具有活性的病毒相比不存在遗传物质。

本发明一实施方式提供了一种新型冠状病毒样颗粒的制备方法，该制备方法包括步骤a～步骤c：

步骤a：构建用于表达新型冠状病毒的S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白的表达载体。

具体地，S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，E蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示，M蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，N蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

在本实施方式中，宿主为植物。与其他宿主相比较，以植物作为表达新型冠状病毒样颗粒的表达载体的宿主，其优势在于成本较低且更易规模化生产。在获得稳定遗传的材料后即可规模化种植，操作门槛较低无需发酵厂房等投入。另外，种子的运输及储存环境也比较容易达到，几乎无温度、湿度等苛刻的外部环境要求。更重要的是，以植物作为宿主的更大优势在于可制备口服疫苗，这样将极大的降低生产成本，更容易做到全球化新冠疫苗的普及。进一步地，宿主为本氏烟草(N.benthiamina)。可以理解的是，在其他实施方式中，宿主不限于烟草，还可以是其他植物。当然，宿主也不限于植物，还可以其他能生产重组蛋白的宿主，例如工程菌。

可选地，编码S蛋白的核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，编码E蛋白的核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，编码M蛋白的核酸片段的核苷酸序列如SEQ IDNo.7所示，编码N蛋白的核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。SEQ ID No.5～SEQ IDNo.8所示的核苷酸序列所对应的核酸片段是根据S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白的氨基酸序列进行了密码子优化的核酸片段，能够使得编码S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白的核酸片段在植物中高效表达。可以理解的是，在其他实施方式中，编码S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白的核酸片段不限于上述，还可以是其他能够编码上述氨基酸序列的核酸片段。

具体地，S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白在表达载体中各自独立表达。编码S蛋白的核酸片段、编码E蛋白的核酸片段、编码M蛋白的核酸片段和编码N蛋白的核酸片段在表达载体中均独立地存在于一个完整的基因表达框(包含启动子、终止子、5’UTR和3’UTR)中。

在本实施方式中，一个完整的基因表达框包括35S启动子、NOS终止子、35S增强子、目的表达片段(也即是与各蛋白对应的核酸片段)、5’UTR和3’UTR。通过采用35S启动子、NOS终止子和35S增强子，使得目的表达片段高效表达。可以理解的是，在其他实施方式中，启动子、终止子及增强子的种类不限于上述，还可以是其他启动子、终止子及/或增强子。

在本实施方式中，用于表达新型冠状病毒的S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白的表达载体包括用于表达S蛋白和E蛋白的第一重组表达载体和用于表达M蛋白和N蛋白的第二重组表达载体。具体地，第一重组表达载体通过将编码S蛋白的核酸片段和编码E蛋白的核酸片段插入pHREAC载体而得，第二重组表达载体通过将编码M蛋白和编码N蛋白的核酸片段插入pHREAC载体而得。pHREAC载体由于对5’UTR及3’UTR的长度进行调节，可以实现重组蛋白在植物中高瞬时表达。

当然，在其他实施方式中，也可以将编码S蛋白的核酸片段、编码E蛋白的核酸片段、编码M蛋白的核酸片段和N蛋白的核酸片段置于同一个空载体上进行表达，或者将编码S蛋白的核酸片段、编码E蛋白的核酸片段、编码M蛋白的核酸片段和N蛋白的核酸片段分别插入不同的空载体上形成表达载体后共转染到宿主中，只要能使得宿主表达S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白即可。

步骤b：将表达载体转染到宿主中后，培养转染有表达载体的宿主。

本实施方式中，宿主为植物。因此，采用农杆菌将表达载体转染到宿主。可选地，农杆菌为根癌农杆菌GV3101。在一个可选地具体示例中，将第一重组表达载体、第二重组表达载体和P19载体共转染入农杆菌感受态细胞中，然后将含有第一重组表达载体、第二重组表达载体和P19载体的农杆菌注射到烟草叶片中，使得农杆菌侵染植物。P19载体可以防止外源基因在烟草体内沉默。可以理解的是，在其他实施方式中，可以根据宿主选择适宜的转染方法。

步骤c：从转染有表达载体的宿主中提取新型冠状病毒样颗粒。

在本实施方式中，将烟草培养2天～7天后，收集烟草叶片，并提取烟草叶片中的新型冠状病毒样颗粒。优选地，选用培养2天～4天后的烟草提取新型冠状病毒样颗粒。具体地，提取烟草叶片中的新型冠状病毒样颗粒的步骤包括步骤c1～步骤c4：

步骤c1：研磨烟草叶片，并将研磨后的烟草叶片与蛋白提取液混合，制得混合液。

具体地，为防止已形成的新冠病毒样颗粒在研磨中出现破损，因此提取时，研磨的时候不加入液氮，但是蛋白提取液、研钵及研杵提前预冷，或用预冷的搅拌器，另外蛋白提取液中应避免含有可以使得蛋白变性的化学物质。可选地，蛋白提取液为0.1M磷酸钠缓冲液pH＝5～8(添加蛋白酶抑制剂)。蛋白提取液与烟草叶片的质量之比为(2～4)：1。

步骤c2：去除植物组织碎片。

具体地，将混合液采用0.22μm滤膜过滤后，离心，以去除植物组织碎片。新型冠状病毒样颗粒的直径约为80nm，因此，可以采用0.22μm滤膜将新型冠状病毒样颗粒与植物的大部分组织分离。可选地，将混合液在4℃10000g条件下离心30min，保留上清。

步骤c3：对步骤c2得到的滤液进行初步纯化。

具体地，采用25％(w/v)蔗糖及70％(w/v)蔗糖垫底的方式初步纯化步骤c2得到的滤液中的新型冠状病毒样颗粒，得到初级纯化的产物。

可选地，在超速离心管中加入步骤c2得到的滤液，然后采用1mL注射器加长针头依次将500μL 70％蔗糖溶液和1mL 25％蔗糖注入超速离心管底部(先加25％蔗糖，然后加70％蔗糖)，接着，4℃30000g离心3小时；离心结束后，蔗糖梯度间出现绿色条带，将该位置的溶液用剪口枪头吸出，并通过浓缩管将所得溶液进行浓缩，离心的同时不断加入磷酸钠缓冲液从而将蔗糖溶液置换为磷酸钠缓冲液，最后通过0.22μm滤膜进行过滤，得到初级纯化的产物。

步骤c4：采用密度梯度离心初步纯化的产物进行精纯，制备高纯度的新型冠状病毒样颗粒。

具体地，密度梯度离心包括连续密度梯度离心和不连续密度梯度离心，离心介质可选择蔗糖、氯化铯、甘油等。在一个具体示例中，采用氯化铯连续密度离心的方法对初步纯化的产物进行精纯。

上述新型冠状病毒样颗粒的制备方法通过构建用于表达新型冠状病毒的S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白的表达载体，并将该表达载体转染到宿主中，使得宿主生产新型冠状病毒样颗粒，从而可以从宿主中提取新型冠状病毒样颗粒。按照上述新型冠状病毒样颗粒的制备方法制得的新型冠状病毒样颗粒不含病毒核酸，因此安全性高，并且按照上述新型冠状病毒样颗粒的制备方法制得的新型冠状病毒样颗粒具有与天然新型冠状病毒相同的外壳结构，具有与天然新型冠状病毒相同的免疫原性，因此，该新型冠状病毒样颗粒是制备预防或治疗新型冠状病毒的良好材料。

基于上述，本发明一实施方式还提供了一种新型冠状病毒样颗粒，该新型冠状病毒样颗粒由上述新型冠状病毒样颗粒的制备方法制得，该新型冠状病毒样颗粒不含新型冠状病毒的核酸，是由S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白形成立体结构，其中，S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，E蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，M蛋白的氨基酸序列如SEQID No.3所示，N蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

此外，本发明一实施方式还提供了一种表达载体，表达载体用于表达新型冠状病毒的S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白，S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，E蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，M蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，N蛋白氨基酸序列如SEQID No.4所示。

另外，本发明一实施方式还提供了一种上述新型冠状病毒样颗粒或上述表达载体在制备预防或治疗新型冠状病毒感染的药物中的应用。例如，以上述新型冠状病毒样颗粒模拟新型冠状病毒，研发治疗新型冠状病毒感染的药物。将上述新型冠状病毒样病毒作为新型冠状病毒疫苗的有效成分制备新型冠状病毒疫苗。

基于此，本发明一实施方式还提供了一种新型冠状病毒疫苗，该新型冠状病毒疫苗的有效成分包括上述新型冠状病毒样颗粒。

上述新型冠状病毒疫苗以上述新型冠状病毒样颗粒为有效成分，该新型冠状病毒疫苗的安全性高、稳定性高且有效性好。

具体实施例

以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。

实施例1

(1)人工合成编码新型冠状病毒的S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白的核酸片段，其中，编码S蛋白的核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，编码E蛋白的核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，编码M蛋白的核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，编码N蛋白的核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

(2)将合成的四种结构蛋白的编码序列通过Bsa I酶切位点连入pHREAC载体，获得重组质粒pHREAC-N、pHREAC-M、pHREAC-S和pHREAC-E。在重组质粒中，每一个编码序列都含有一个完整的基因表达框，包含35S启动子，35S增强子，NOS终止子以及5’UTR和3’UTR。

(3)在质粒pHREAC-M和质粒pHREAC-E上设计引物(如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示)，扩增M蛋白和E蛋白完整的基因表达框(包括35S启动子、35S增强子、5’UTR、M蛋白和E蛋白编码序列、3’UTR和NOS终止子)，纯化回收M蛋白和E蛋白完整的基因表达框，并通过pHREAC-N质粒和pHREAC-S质粒上的KpnI酶切位点连入，最终获得pHREAC-S-E质粒及pHREAC-N-M质粒。pHREAC-S-E质粒的结构示意图如图1所示，pHREAC-N-M质粒的结构示意图如图2所示。

(4)将pHREAC-S-E质粒、pHREAC-N-M质粒和P19载体分别转入根癌农杆菌GV3101感受态中，制得含有pHREAC-S-E质粒的根癌农杆菌、含有pHREAC-N-M质粒根癌农杆菌和含有P19载体的根癌农杆菌，然后将这三种根癌农杆菌与本氏烟草共培养，进而获得型冠状病毒样颗粒。具体地：

a.将pHREAC-S-E质粒、pHREAC-N-M质粒和P19载体分别转入根癌农杆菌GV3101感受态，并在添加了50ng/mL卡那霉素和50ng/mL利福平的LB培养基中分别培养含有pHREAC-S-E质粒的根癌农杆菌、含有pHREAC-N-M质粒根癌农杆菌和含有P19载体的根癌农杆菌，28℃220rpm摇晃培养。

b.培养24小时后，培养物的OD600为0.6，3000rpm，10min分别收集三种农杆菌(有pHREAC-S-E质粒的根癌农杆菌、含有pHREAC-N-M质粒根癌农杆菌和含有P19载体的根癌农杆菌)。然后分别添加4mL MgCl

c.在将步骤b的烟草培养1天、2天、3天、4天、5天、6天、及7天后，分别收集转化pHREAC-S-E质粒、pHREAC-N-M质粒和P19载体的烟草叶片，并提取该烟草叶片中的总蛋白，并利用S蛋白抗体和N蛋白抗体(S蛋白抗体：GTX632604，N蛋白抗体：GTX635712，下同)，通过Western blot进行检测不同培养时间后新型冠状病毒的结构蛋白在烟草中的表达情况，结果如图3～图6所示。图3～图4是培养1～7天后转化有表达载体的烟草中N蛋白和S蛋白的表达情况，图3和图4中，泳道编号“M”对应maker，泳道编号“1～7”对应培养时间1天～7天；图5和图6是培养4天后的转化有表达载体的烟草和野生型烟草中N蛋白和S蛋白的表达情况。

由图3～图6可知，N蛋白和S蛋白均能够在烟草的烟叶中表达。

d.将步骤c收集的烟草叶片称重，并加入到提前预冷的研钵及研杵中在4℃条件下研磨，然后将0.1M磷酸钠缓冲液pH 7.0(添加蛋白酶抑制剂)与烟草叶片按照质量比3：1的比例进行混合，混合均匀后冰浴静置15min。然后，将静置后的混合液过0.22μm滤膜，初步去除植物组织碎片。接着，将滤液在4℃10000g条件下离心30min，保留上清。

e.通过25％(w/v)及70％(w/v)蔗糖(以0.1M磷酸钠缓冲液pH 7.0配制的蔗糖溶液)垫底的方式对步骤d得到的上清进行第一步纯化：超速离心管中加入全部的步骤d得到的上清，然后用1mL注射器加长针头将500μL 70％蔗糖溶液和1mL 25％蔗糖依次注入超速离心管底部(先加25％蔗糖，然后加70％蔗糖)，接着，4℃30000g离心3小时。离心结束后，离心管的蔗糖梯度间出现绿色条带(如图7所示)。接着，将该位置的溶液用剪口枪头吸出，并通过浓缩管将所得的溶液进行浓缩，离心的同时不断加入磷酸钠缓冲液从而将蔗糖溶液置换为磷酸钠缓冲液，最后通过0.22μm滤膜过滤，得到初步纯化的新冠病毒样颗粒。

f.采用氯化铯连续密度离心的方法对初步纯化的新冠病毒样颗粒进行精纯：采用0.1M磷酸钠缓冲液pH 7.0配置11％(w/w)及33％(w/w)的CsCl溶液。超速离心管中加入等体积的11％CsCl及33％CsCl通过连续密度制备器获得从11％CsCl～33％CsCl的连续密度梯度溶液。小心的将初步纯化的新冠病毒样颗粒铺在CsCl溶液上，4℃30000g离心16小时，离心完成后自上至下以150μL为单位，剪口枪头取样，进行检测SDS-PAGE检测。SDS-PAGE检测的步骤包括：制备10％的分离胶和5％的浓缩胶，每150μL CsCl溶液中取20μL样品加入5μL5×上样缓冲液，混合均匀，98℃10min后迅速置于冰浴中，制备电泳样品，接着聚丙稀酰胺凝胶电泳，结束后银染，电泳如图8所示。

g.将SDS-PAGE胶，20V 60min转移到PVDF膜上，将膜放入PBS配制的5％脱脂牛奶封闭一小时，1：1000加入商业化的S蛋白抗体及N蛋白抗体，37℃孵育1h后PBST洗三次，每次十分钟。将膜转移至1：5000稀释的二抗(羊抗鼠)中，37℃孵育1h后PBST洗三次，每次十分钟，显影，结果如图9和图10所示。

h.对58号泳道样品负染及透射电镜(透射电镜图如图11所示)观察。

由图9可知，按照上述方法制备的新冠病毒样颗粒具有立体结构，直径在100nm左右并且含有S蛋白。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 南方科技大学

<120> 新型冠状病毒样颗粒及其制备方法和应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1273

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe

20 25 30

Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu

35 40 45

His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp

50 55 60

Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp

65 70 75 80

Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu

85 90 95

Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser

100 105 110

Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile

115 120 125

Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr

130 135 140

Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr

145 150 155 160

Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

165 170 175

Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe

180 185 190

Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr

195 200 205

Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu

210 215 220

Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr

225 230 235 240

Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser

245 250 255

Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro

260 265 270

Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala

275 280 285

Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys

290 295 300

Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val

305 310 315 320

Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys

325 330 335

Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala

340 345 350

Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu

355 360 365

Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro

370 375 380

Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

385 390 395 400

Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly

405 410 415

Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys

420 425 430

Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn

435 440 445

Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe

450 455 460

Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys

465 470 475 480

Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly

485 490 495

Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val

500 505 510

Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys

515 520 525

Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn

530 535 540

Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu

545 550 555 560

Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val

565 570 575

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580 585 590

Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val

595 600 605

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610 615 620

His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser

625 630 635 640

Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val

645 650 655

Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala

660 665 670

Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala

675 680 685

Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser

690 695 700

Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile

705 710 715 720

Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val

725 730 735

Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu

740 745 750

Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr

755 760 765

Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln

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Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe

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Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser

805 810 815

Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly

820 825 830

Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp

835 840 845

Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu

850 855 860

Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly

865 870 875 880

Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile

885 890 895

Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr

900 905 910

Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn

915 920 925

Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala

930 935 940

Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn

945 950 955 960

Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val

965 970 975

Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln

980 985 990

Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val

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Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu

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Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His

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Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val

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Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr

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Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu

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Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp

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Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp

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Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile

1220 1225 1230

Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys

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<210> 2

<211> 75

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Tyr Ser Phe Val Ser Glu Glu Thr Gly Thr Leu Ile Val Asn Ser

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Val Leu Leu Phe Leu Ala Phe Val Val Phe Leu Leu Val Thr Leu Ala

20 25 30

Ile Leu Thr Ala Leu Arg Leu Cys Ala Tyr Cys Cys Asn Ile Val Asn

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Val Ser Leu Val Lys Pro Ser Phe Tyr Val Tyr Ser Arg Val Lys Asn

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Leu Asn Ser Ser Arg Val Pro Asp Leu Leu Val

65 70 75

<210> 3

<211> 222

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ala Asp Ser Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu Glu Leu Lys Lys Leu

1 5 10 15

Leu Glu Gln Trp Asn Leu Val Ile Gly Phe Leu Phe Leu Thr Trp Ile

20 25 30

Cys Leu Leu Gln Phe Ala Tyr Ala Asn Arg Asn Arg Phe Leu Tyr Ile

35 40 45

Ile Lys Leu Ile Phe Leu Trp Leu Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys

50 55 60

Phe Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp Ile Thr Gly Gly Ile

65 70 75 80

Ala Ile Ala Met Ala Cys Leu Val Gly Leu Met Trp Leu Ser Tyr Phe

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100 105 110

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115 120 125

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Leu Arg Gly His Leu Arg Ile Ala Gly His His Leu Gly Arg Cys Asp

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

Asp His Ser Ser Ser Ser Asp Asn Ile Ala Leu Leu Val Gln

210 215 220

<210> 4

<211> 419

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr

1 5 10 15

Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg

20 25 30

Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn

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50 55 60

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65 70 75 80

Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly

85 90 95

Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr

100 105 110

Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp

115 120 125

Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp

130 135 140

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145 150 155 160

Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser

165 170 175

Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn

180 185 190

Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala

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210 215 220

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Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys

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305 310 315 320

Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala

325 330 335

Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu

340 345 350

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355 360 365

Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln

370 375 380

Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu

385 390 395 400

Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser

405 410 415

Thr Gln Ala

<210> 5

<211> 3822

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgtttgtgt tcctggtact tcttccactt gtttcatcac aatgcgttaa ccttacaaca 60

cggacccagt tgccgcctgc ttatacaaac tcatttacaa gaggtgtata ctacccggac 120

aaagtattcc gctcttcagt tcttcatagc acgcaggacc tattcctccc tttcttcagc 180

aatgttacat ggtttcatgc aatccatgtt tcaggaacaa acggaacaaa gcggttcgat 240

aacccagttc ttccatttaa cgatggagtt tatttcgctt ctacagagaa gtcgaatatc 300

atcagaggat ggatctttgg aacaacactt gattcaaaga cccagtcact tcttatcgtt 360

aacaacgcaa caaacgttgt tatcaaagtt tgcgagttcc agttctgtaa tgaccctttc 420

ttaggtgtat attatcataa gaacaacaag tcctggatgg aatcagaatt tagagtttat 480

tcatcagcaa acaactgcac atttgaatat gtttcacaac catttcttat ggacctcgag 540

ggtaaacaag gcaatttcaa gaatttgcgg gagttcgtct ttaagaatat cgacggttac 600

tttaagatat attcaaagca cactccaatc aaccttgtta gagatcttcc acaaggattc 660

tccgctcttg aaccacttgt tgatcttcca atcggaatca acatcacaag atttcaaaca 720

cttcttgcac ttcatagatc atatcttaca ccaggagatt catcatcagg atggacagca 780

ggagcagcag catattatgt tggatatctt caaccaagaa catttcttct taaatataac 840

gagaatggta caatcacaga tgcagttgat tgcgcacttg atccactttc cgagactaaa 900

tgcactttga agtctttcac cgtggagaag ggcatctatc aaacatcaaa ctttagagtt 960

caaccaacag aatcaatcgt tagatttcca aacatcacaa acctttgccc atttggagaa 1020

gtattcaatg ctacaagatt tgcatcagtt tatgcatgga acagaaagcg tatttcaaac 1080

tgcgttgcag attattcagt tctttataac tcagcatcat tctcgacgtt taaatgctat 1140

ggagtttcac caacaaagtt aaatgatctt tgctttacaa acgtttatgc agattcattt 1200

gttatcagag gagatgaagt tagacaaatc gcaccaggac aaacaggaaa gatagctgat 1260

tataactata aacttccaga tgatttcact ggctgcgtta tcgcatggaa ctcaaacaat 1320

ctggactcga aagttggcgg taattacaat tacctatacc gtctattcag gaaatccaac 1380

ctcaagccgt ttgaaagaga tatctcaaca gaaatctatc aagcaggatc aacaccatgc 1440

aacggagttg aaggatttaa ctgctatttc ccgttgcagt catatggatt tcaaccaaca 1500

aacggagttg gatatcaacc atatagagtt gttgttcttt catttgaact tcttcatgca 1560

ccagcaacag tttgcggacc aaagaagtct actaaccttg ttaagaataa gtgcgttaac 1620

tttaacttta acggacttac aggaacagga gttcttacag aatcaaacaa gaagttcttg 1680

ccatttcaac aatttggaag agatatcgca gatacaacag atgcagttag agatccacaa 1740

acacttgaaa tccttgatat cacaccatgc tcatttggag gagtttcagt tatcacacca 1800

ggaacaaaca catcaaacca agttgcagtt ctttatcaag atgttaactg cacagaagtt 1860

ccagttgcaa tccatgcaga tcaacttaca ccaacatgga gagtttattc aacaggatca 1920

aacgtgttcc agaccagagc aggatgcctt atcggagcag aacatgttaa caactcatat 1980

gaatgcgata tcccaatcgg agcaggaatc tgcgcatcat atcaaacaca aacaaactca 2040

ccaagaagag caagatcagt tgcatcacaa tcaatcatcg catatacaat gtcacttgga 2100

gcagagaata gcgttgcata ttcaaacaac tcaatcgcaa tcccaacaaa ctttacaatc 2160

tcagttacaa cagagatact cccagtcagt atgacaaaga cgagtgttga ttgcacaatg 2220

tatatctgcg gagattcaac agaatgctca aaccttcttc ttcaatatgg atcattctgt 2280

actcaactta acagagcact tacaggaatc gcagttgaac aagataagaa tacccaagaa 2340

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aatttctcac agatattgcc cgacccttca aagccctcca agcgtagctt tatcgaagat 2460

ctgttgttca acaaagttac acttgcagat gcaggattta tcaaacaata tggagattgc 2520

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cttccaccac ttcttacaga tgaaatgatc gcacaatata catcagcact tcttgcagga 2640

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acagcatcag cacttggaaa gttacaggat gttgttaacc agaatgccca agcacttaac 2880

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ctttcaagac ttgataaagt tgaagcagaa gttcagattg accgtctcat aactggaaga 3000

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cattggtttg ttacacaaag aaacttctac gagccacaaa tcatcacaac agataacaca 3360

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tcaccagatg ttgatctggg tgacataagc ggcatcaacg catcagttgt taacatccag 3540

aaggaaattg accgcctgaa tgaggttgca aagaatttga acgaatcact tatcgatctt 3600

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<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

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aacgttccac ttcatggaac aatccttaca agaccacttc ttgaatcaga actcgtcata 420

ggcgctgtga tccttagagg acatcttaga atcgcaggac atcatcttgg aagatgcgat 480

atcaaagatc ttccaaagga gattacagtt gcaacatcaa gaacactttc atattataaa 540

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atcggaaact ataaacttaa cacagatcat tcatcatcat cagataacat cgcacttctt 660

gttcaatga 669

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<211> 1260

<212> DNA

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<400> 8

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aaggaggacc ttaaatttcc aagaggacaa ggagttccaa tcaacacaaa ctcatcacca 240

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atgaaggatc tttcaccaag atggtatttc tactaccttg gaacaggacc agaagcagga 360

cttccatatg gagcaaacaa agatggaatc atctgggttg caacagaagg agcacttaac 420

acaccaaagg accacatcgg aacaagaaac ccagcaaaca acgcagcaat cgttcttcaa 480

cttccacaag gaacaacact tccaaagggt ttctatgccg aaggatcaag aggaggatca 540

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gacaaggacc caaactttaa ggaccaggta attctgctga ataagcatat cgatgcatat 1080

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<211> 25

<212> DNA

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