一种茶叶中赤霉素含量的检测方法

技术领域

本发明涉及一种含量检测方法，特别涉及一种茶叶中赤霉素含量的检测方法。

背景技术

生长调节剂是一类能对植物生长起调节作用的活性物质。赤霉素是较常见的一种植物生长调节剂，在植物生长和发育中发挥着重要的调节作用。茶树是一种以收获幼嫩叶芽为主的多年生经济作物，茶树春梢萌动越早，春茶生产时段越长，产生的经济效益就越大。赤霉素可以打破嫩芽冬眠，促进新梢萌发及嫩芽生长，提高茶叶产量。目前茶园中广泛使用赤霉素，但存在选择盲目性及滥用赤霉素等问题。尽管赤霉素毒性不大，但长期、大量、不合理使用也会在人体器官中蓄积，造成慢性中毒。因此，茶叶质量安全问题备受关注。欧盟规定赤霉素的最高残留限量值(MRL)为5mg/kg。我国目前尚未制定茶叶中赤霉素的最大残留限量。

目前国内外检测赤霉素的方法有毛细管气相色谱法、高效液相色谱法、气质联用法、酶联免疫法、高效液相色谱-串联质谱法等。有些方法其前处理过程较为繁琐，有些方法则灵敏度低，存在操作复杂、环境不友好等缺点。且茶叶中赤霉素检测方法也未见相关文献报道。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种茶叶中赤霉素含量的检测方法，该方法利用超高压液相色谱－串联质谱法检测分析茶叶中赤霉素的含量，操作简单、快速、可靠、准确，基质干扰小，灵敏度高，且线性关系、回收率良好，精密度和准确度也高，具有较高的实际应用价值，可以为开展赤霉素的安全性研究提供参考。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种茶叶中赤霉素含量的检测方法，采用超高压液相色谱-串联质谱法对茶叶中赤霉素含量进行检测，该检测方法包括如下步骤：

(1)制样及提取

准确称取一定量的经粉碎后的茶叶样品，向该茶叶样品中加入提取溶剂，超声提取后离心；

(2)供试品溶液制备

取离心后的上清液，加入净化剂进行净化，再经高速离心后，取上清液于水浴中经氮气吹干后，再进行定容，制得供试品溶液；

(3)确定HPLC-MS-MS条件

HPLC色谱条件：

流动相：流动相A为乙酸铵溶液，流动相B为乙腈；

梯度洗脱条件：

0min时，流动相A为95％，流动相B为5％；2min时，流动相A为95％，流动相B为5％；2.1min时，流动相A为90％，流动相B为10％；8.0min时，流动相A为20％，流动相B为80％；10.0min时，流动相A为20％，流动相B为80％；10.1min时，流动相A为95％，流动相B为5％；12min时，流动相A为95％，流动相B为5％；流速：0.20mL/min；进样量：10μL；柱温40℃；

质谱条件：电喷雾ESI离子源，离子源温度:550℃；采用负离子采集模式，多反应监测方法测定；离子喷雾电压4.5kV；雾化气、气帘气、碰撞气均为高纯氮气；

(3)绘制标准曲线

利用赤霉素标准品制得多个浓度点的标准工作液，将每个浓度点的标准工作液分别进样10μL，进行HPLC-MS-MS检测分析，并根据检测结果绘制标准曲线；

(4)样品检测

将供试品溶液进样10μL，进行HPLC-MS-MS检测分析，并将检测结果与标准曲线进行对照，得到供试品溶液中的赤霉素浓度。

进一步的，步骤(1)中采用的提取溶剂以及步骤(2)中的定容过程采用的溶剂均为甲酸乙腈溶液。

进一步的，步骤(1)中的超声提取次数为2-4次。

进一步的，步骤(2)中采用的净化剂包括无水硫酸镁和HC-C18型吸附剂；无水硫酸镁和HC-C18型吸附剂的配比为400：100-150。

进一步的，流动相A为含0.1-0.3％甲酸的浓度为5～10mmol/L的乙酸铵水溶液。

进一步的，质谱条件中，定量离子对为m/z 345.1＞239.0，定性离子对为m/z345.1＞239.0，m/z 345.1＞143.0。

进一步的，该方法对茶叶中赤霉素的定量限为该方法对茶叶中赤霉素的定量限为0.73μg/kg-1.47μg/kg。

本发明的有益效果是：

本发明利用适当的提取溶剂对茶叶样品进行超声提取后，选择合适的吸附净化剂进行净化，以提取出茶叶中的赤霉素，再选择适当的流动相并确定合适的液相色谱条件和质谱条件，利用超高压液相色谱－串联质谱法进行检测分析，通过多反应监测模式进行定型，并通过基质外标法进行定量，即可获得茶叶中赤霉素的准确含量。

该方法操作简单、快速、可靠、准确，可快速、低成本检测茶叶中赤霉素残留情况；该方法经过考察，基质干扰小，灵敏度高，且线性关系、回收率良好，精密度和准确度也高，具有较高的实际应用价值，可以为开展赤霉素的安全性研究提供参考。

附图说明

图1为本发明方法中赤霉素浓度为100ng/mL的标准工作液的MRM色谱图。

图2为本发明方法的实施例1中的供试品溶液的MRM色谱图。

图3为本发明方法的实施例2中的供试品溶液的MRM色谱图。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种茶叶中赤霉素含量的检测方法，其采用超高压液相色谱-串联质谱法对茶叶中赤霉素含量进行检测，该检测方法包括如下步骤：

(1)制样及提取

准确称取一定量的经粉碎后的茶叶样品，向该茶叶样品中加入提取溶剂，超声提取后离心；在该步骤(1)中，提取溶剂为20～40mL体积分数为0.5～1.5％甲酸乙腈溶液；超声提取次数为2-4次，每次15min；离心速度为10000rp m，离心时间为5min；超声提取并离心后，合并上清液，并于上清液中加入一定量的无水硫酸钠和无水乙酸钠进行干燥，然后再经过一次离心处理，取上清液；

(2)供试品溶液制备

取离心后的上清液，加入净化剂(400mg无水硫酸镁，100-150mg HC-C 18型吸附剂)进行净化，再经高速离心(10000rpm，离心5min)后，取上清液于45℃水浴中经氮气吹干后，再利用甲酸乙腈溶液进行定容，制得供试品溶液；

(3)确定HPLC-MS-MS条件

HPLC色谱条件：

流动相：流动相A为5～10mmol/L的乙酸铵水溶液(含0.1～0.3％甲酸)，流动相B为乙腈；

梯度洗脱条件：

0min时，流动相A为95％，流动相B为5％；2min时，流动相A为95％，流动相B为5％；2.1min时，流动相A为90％，流动相B为10％；8.0min时，流动相A为20％，流动相B为80％；10.0min时，流动相A为20％，流动相B为80％；10.1min时，流动相A为95％，流动相B为5％；12min时，流动相A为95％，流动相B为5％；流速：0.20mL/min；进样量：10μL；柱温40℃；

质谱条件：电喷雾ESI离子源，离子源温度:550℃；采用负离子采集模式，多反应监测方法测定；离子喷雾电压4.5kV；雾化气、气帘气、碰撞气均为高纯氮气；定量离子对为m/z345.1＞239.0，定性离子对为m/z 345.1＞2 39.0，m/z 345.1＞143.0；

(3)绘制标准曲线

利用赤霉素标准品制得多个浓度点的标准工作液，将每个浓度点的标准工作液分别进样10μL，进行HPLC-MS-MS检测分析，以峰面积为纵坐标，标准工作液浓度为横坐标绘制标准曲线；赤霉素在10.0～200ng/mL浓度范围内线性关系良好，线性方程为y＝2070x-0.0045，相关系数为0.9998；图1为赤霉素浓度为100ng/mL的标准工作液的MRM色谱图；

(4)样品检测

将供试品溶液进样10μL，进行HPLC-MS-MS检测分析，并将检测结果与标准曲线进行对照，得到供试品溶液中的赤霉素浓度，并根据供试品溶液中的赤霉素浓度、供试品溶液体积及供试品溶液中的样品量，最终确定茶叶样品中的赤霉素含量；

此外，在该方法中，还可以设计基质空白溶液，作为参照。

利用上述步骤，确定该方法对茶叶中赤霉素的定量限为0.73μg/kg-1.47μg/kg。

实施例1

一种茶叶中赤霉素含量的检测方法，包括如下步骤：

(1)制样及提取

取一茶叶样品经粉碎后备用。准确称取10g粉碎后的茶叶样品，加入20mL体积分数为1.0％的甲酸乙腈溶液，涡旋2min，超声提取15min，10000rp m离心5min，取上清液转移至离心管中，再分别加入10mL甲酸乙腈溶液提取2次，合并上清液。向上清液中加入4g无水硫酸镁和1g无水乙酸钠，立即涡旋混合1min，10000rpm离心5min；

(2)供试品溶液制备

量取上清液8mL置于15mL含净化剂(400mg无水硫酸镁，120mg HC-C18型吸附剂)的离心管中，涡旋2min，10000rpm离心5min。取上清液于15mL试管中，于45℃水浴中氮吹至近干，加入1.00mL体积分数为0.1％的甲酸-乙腈溶液(1:1)定容，得到供试品溶液；

(3)确定HPLC-MS-MS条件

HPLC色谱条件：

流动相：流动相A为5mmol/L的乙酸铵水溶液(含0.1％甲酸)，流动相B为乙腈；

梯度洗脱条件：

0min时，流动相A为95％，流动相B为5％；2min时，流动相A为95％，流动相B为5％；2.1min时，流动相A为90％，流动相B为10％；8.0min时，流动相A为20％，流动相B为80％；10.0min时，流动相A为20％，流动相B为80％；10.1min时，流动相A为95％，流动相B为5％；12min时，流动相A为95％，流动相B为5％；流速：0.20mL/min；进样量：10μL；柱温40℃；

质谱条件：电喷雾ESI离子源，离子源温度:550℃；采用负离子采集模式，多反应监测(MRM)方法测定；离子喷雾电压4.5kV；雾化气、气帘气、碰撞气均为高纯氮气；定量离子对为m/z 345.1＞239.0，定性离子对为m/z 3 45.1＞239.0，m/z 345.1＞143.0；

(3)绘制标准曲线

利用赤霉素标准品制得多个浓度的标准工作液，将每个浓度点的标准工作液分别进样10μL，进行HPLC-MS-MS检测分析，并根据检测结果绘制标准曲线；

(4)样品检测

将供试品溶液进样10μL，进行HPLC-MS-MS检测分析，并将检测结果与标准曲线进行对照，得到供试品溶液中的赤霉素浓度，利用以下的含量计算公式最终确定待测茶叶样品中的赤霉素含量；

含量计算公式：

式中：X-待测茶叶样品中的赤霉素含量(μg/kg)；

c-供试品溶液中赤霉素浓度(ng/mL)；

c

v-供试品溶液最终定容体积(mL)；

m-称样量(g)。

经测定，该实施例1的茶叶样品中赤霉素的含量为17.95μg/kg。

实施例2

一种茶叶中赤霉素含量的检测方法，包括如下步骤：

(1)制样及提取

取一茶叶样品经粉碎后备用。准确称取10g粉碎后的茶叶样品，加入20mL体积分数为1.0％的甲酸乙腈溶液，涡旋2min，超声提取15min，10000rp m离心5min，取上清液转移至离心管中；再加入10mL甲酸乙腈溶液提取1次，合并上清液。向上清液中加入4g无水硫酸镁和1g无水乙酸钠，立即涡旋混合1min，10000rpm离心5min；

(2)供试品溶液制备

量取上清液6mL置于15mL含净化剂(400mg无水硫酸镁，100mg HC-C18型吸附剂)的离心管中，涡旋2min，10000rpm离心5min。取上清液于15mL试管中，于45℃水浴中氮吹至近干，加入1.00mL甲酸-乙腈溶液(1:1)定容，得到供试品溶液；

(3)确定HPLC-MS-MS条件

HPLC色谱条件：

流动相：流动相A为10mmol/L的乙酸铵水溶液(含0.1％甲酸)，流动相B为乙腈；

梯度洗脱条件：

0min时，流动相A为95％，流动相B为5％；2min时，流动相A为95％，流动相B为5％；2.1min时，流动相A为90％，流动相B为10％；8.0min时，流动相A为20％，流动相B为80％；10.0min时，流动相A为20％，流动相B为80％；10.1min时，流动相A为95％，流动相B为5％；12min时，流动相A为95％，流动相B为5％；流速：0.20mL/min；进样量：10μL；柱温40℃；

质谱条件：电喷雾ESI离子源，离子源温度:550℃；采用负离子采集模式，多反应监测(MRM)方法测定；离子喷雾电压4.5kV；雾化气、气帘气、碰撞气均为高纯氮气；定量离子对为m/z 345.1＞239.0，定性离子对为m/z 3 45.1＞239.0，m/z 345.1＞143.0；

(3)绘制标准曲线

利用赤霉素标准品制得多个浓度的标准工作液，将每个浓度点的标准工作液分别进样10μL，进行HPLC-MS-MS检测分析，并根据检测结果绘制标准曲线；

(4)样品检测

将供试品溶液进样10μL，进行HPLC-MS-MS检测分析，并将检测结果与标准曲线进行对照，得到供试品溶液中的赤霉素浓度，利用实施例1的含量计算公式最终确定茶叶样品中的赤霉素含量；

经测定，该实施例2的茶叶样品中赤霉素的含量为9.95μg/kg。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。