一种子宫内膜间充质干细胞的分离培养方法及应用

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种子宫内膜间充质干细胞的分离培养方法及应用。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)最早发现于骨髓中，现已证实存在脐带血、脐带、脂肪、胎盘等多种组织中，它一种具有较强的自我更新能力和多向分化能力的成体干细胞。具有很强的免疫调节作用、具有造血支持作用以及促进组织修复作用。子宫内膜来源的间充质干细胞在治疗卵巢早衰、宫腔黏连以及子宫内膜薄引起的不孕症等的妇科疾病中也已经开展了广泛的研究。

一般采用女性经期脱落的子宫内膜组织作为一种优质的间充质干细胞的来源。专利CN201811226089.8提供了一种提取子宫内膜间充质干细胞的方法及其应用，采用的是通过过滤分离将收集脱落的子宫内膜组织，然后剪碎、离心、进行组织贴壁培养出间充质干细胞。此方法的缺点在于，子宫内膜中绝大多数细胞是子宫内膜细胞，贴壁培养时会有大量的子宫内膜细胞贴于瓶底，不利于间充质干细胞的增值，同时使得到的间充质干细胞纯度不高，影响后续使用的效果。

发明内容

针对现有技术中所存在的不足，本发明的目的之一在于提供了一种子宫内膜间充质干细胞的分离培养方法，解决了现有培养方法中贴壁培养时会有大量的子宫内膜细胞贴于瓶底，不利于间充质干细胞的增值，同时使得到的间充质干细胞纯度不高，影响后续使用的效果的技术问题。

为实现上述目的，本发明采用以下方案：

一种子宫内膜间充质干细胞的分离培养方法，所述方法包括以下步骤：

1)子宫内膜的采集：月经期内，采集经血，经过滤并用等渗溶液冲洗后将得到的组织块转移至保护液中；

2)子宫内膜的清洁：将子宫内膜组织用等渗溶液冲洗，剩下白色的子宫内膜组织后再进行杀菌消毒和冲洗；

3)子宫内膜组织的培养：将子宫内膜组织剪成碎块，放入装有完全培养基的培养瓶中悬浮培养，并定时摇晃培养瓶；

4)细胞收集培养：当子宫内膜组织碎块长成光滑的球形时，消化子宫内膜组织并收集细胞进行培养。

进一步，步骤1)，采学时间为月经周期的第二天，所述保护液为含有质量浓度为300～600mg/L青霉素和质量浓度为400～800mg/L链霉素的DMEN/F12培养基。

进一步，组织块转移至保护液中后在4～8℃的条件下12小时内送至实验室进行操作。

进一步，步骤2)，将子宫内膜组织浸泡于75％酒精中20～40秒，进行杀菌消毒，再用生理盐水冲洗子宫内膜组织。

进一步，所述等渗溶液包括生理盐水、D-Hank'S液或PBS。

进一步，步骤3)，所述子宫内膜组织碎块的面积为1mm

进一步，所述方法还包括以下步骤：

5)消化收集步骤4)培养的细胞为第一代细胞并培养；

6)消化收集步骤5)培养的细胞为第二代细胞并培养；

7)将步骤6)得到的细胞进行传代培养后进行细胞表型鉴定。

进一步，消化采用质量浓度为0.125％～0.25％的胰蛋白酶。

进一步，所述传代培养的细胞接种浓度为0.5×10

本发明的目的之二在于提供所述子宫内膜间充质干细胞的分离培养方法的一种应用。

为实现上述目的，本发明采用以下方案：

所述的一种子宫内膜间充质干细胞的分离培养方法在获取子宫内膜间充质干细胞中的应用。

本发明的技术原理为：

子宫内膜中大部分为子宫内膜细胞，间充质干细胞比例较小。组织块悬浮培养的的时候，由于间充质干细胞增值能力的优势，加上组织表面直接接触培养基，营养丰富，至其在组织表面大量增殖，使组织趋向于球形。经悬浮培养后，组织中间充质干细胞的比例大幅度增加。由于间充质干细胞长在组织表面，用胰蛋白酶消化组织的时候，只能将表面的间充质干细胞消化下来，组织内部的子宫内膜细胞难以被消化下来，所以消化后收集到的间充质干细胞的纯度就会很高。

相比于现有技术，本发明具有如下有益效果

1.经血经过阴道时已被其中的大量细菌污染，而子宫内膜因为是组织，可以用酒精浸泡法来进行消毒杀菌，这样就避免了细胞培养时被污染的情况，大大提高了细胞培养的成功率；

2.利用子宫内膜组织块悬浮培养法，可以在间充质干细胞P1代的时候就能将其纯化到98％以上，得到较为原始的高纯度的间充质干细胞；

3.操作简单，成功率高，每个人都能进行多次的采集，能够得到数量充足的较原始的高纯度的自体间充质干细胞，能够解决临床研究使用中经常出现的自体干细胞细胞数量不足的弊端。

附图说明

图1为本发明实施例1的子宫内膜组织碎块长成光滑球形的显微镜观察图。

图2为本发明实施例1的P1代细胞融合显微镜观察图。

图3为本发明实施例4的子宫内膜间充质干细胞CD34、CD45和HLA-DR的流式表型检测结果图。

图4为本发明实施例4的子宫内膜间充质干细胞CD73、CD90和105的流式表型检测结果图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明中的技术方案进一步说明。

实施例1子宫内膜间充质干细胞的分离培养方法

(1)子宫内膜的采集：在月经的第二天，将月经杯置于阴道内3个小时取出，用无菌纱布过滤掉经血，用等渗溶液冲洗3次，然后再将纱布中的组织块转移至保护液中。在4℃的条件下12小时内送至实验室进行分离操作；

所述的保护液为含有质量浓度为300mg/L青霉素和质量浓度为400mg/L链霉素的DMEN/F12培养基；所述的等渗溶液为D-Hank'S液；

(2)将子宫内膜组织置于肾形盘中，用等渗溶液反复冲洗，将多余的红细胞和凝血块清洗干净，剩下白色的子宫内膜组织；所述的等渗溶液为生理盐水液；

(3)将子宫内膜组织浸泡于75％酒精中30秒，进行杀菌消毒，然后再用大量生理盐水冲洗子宫内膜组织；

(4)将子宫内膜组织剪成面积为1mm

(5)当子宫内膜组织碎块大部分长成光滑的球形时(见图1)，将组织块用胰蛋白酶消化15分钟，收集消化液置于离心管中，离心收集消化液中的细胞，弃上清液，加入完全培养基吹打重悬细胞，将细胞悬液接种到新培养瓶中，置于37℃，5％CO2浓度，饱和湿度的培养箱中培养，之后每4天更换一次完全培养基；所述的胰蛋白酶质量浓度为0.25％；

(6)当培养瓶底部原代细胞之间达到85％融合后(见图2)，用胰蛋白酶将培养瓶底部的细胞消化收集，然后进行传代培养，此细胞细胞为P1代；所述的胰蛋白酶质量浓度为0.25％；

(7)待P1代细胞长至95％融合后，用胰蛋白酶消化收集细胞并计数，然后将细胞进行传代培养，此细胞为P2代；所述的胰蛋白酶质量浓度为0.25％；所述将细胞进行传代培养，其接种细胞的浓度为0.8×10

(8)待P2代细胞长至95％融合后，用胰蛋白酶消化收集细胞，所述的胰蛋白酶质量浓度为0.25％。

实施例2子宫内膜间充质干细胞的分离培养方法

(1)子宫内膜的采集：在月经的第二天，将月经杯置于阴道内2个小时取出，用无菌纱布过滤掉经血，用等渗溶液冲洗3次，然后再将纱布中的组织块转移至保护液中，在8℃的条件下12小时内送至实验室进行分离操作；

所述的保护液为含有质量浓度为600mg/L青霉素和质量浓度为800mg/L链霉素的DMEN/F12培养基；所述的等渗溶液为生理盐水；

(2)将子宫内膜组织置于肾形盘中，用等渗溶液反复冲洗，将多余的红细胞和凝血块清洗干净，剩下白色的子宫内膜组织；所述的等渗溶液为D-Hank'S液；

(3)将子宫内膜组织浸泡于75％酒精中30秒，进行杀菌消毒，然后再用大量生理盐水冲洗子宫内膜组织；

(4)将子宫内膜组织剪成面积为1mm

(5)当子宫内膜组织碎块大部分长成光滑的球形时，将组织块用胰蛋白酶消化10分钟，收集消化液置于离心管中，离心收集消化液中的细胞，弃上清液，加入完全培养基吹打重悬细胞，将细胞悬液接种到新培养瓶中，置于37℃，5％CO2浓度，饱和湿度的培养箱中培养，之后每4天更换一次完全培养基；所述的胰蛋白酶质量浓度为0.125％；

(6)当培养瓶底部原代细胞之间达到85％融合后，用胰蛋白酶将培养瓶底部的细胞消化收集，然后进行传代培养，此细胞细胞为P1代；所述的胰蛋白酶质量浓度为0.125％；

(7)待P1代细胞长至95％融合后，用胰蛋白酶消化收集细胞并计数，然后将细胞进行传代培养，此细胞为P2代；所述的胰蛋白酶质量浓度为0.25％；所述将细胞进行传代培养，其接种细胞的浓度为0.5×10

(8)待P2代细胞长至95％融合后，用胰蛋白酶消化收集细胞，所述的胰蛋白酶质量浓度为0.125％。

实施例3子宫内膜间充质干细胞的分离培养方法

(1)子宫内膜的采集：在月经的第二天，将月经杯置于阴道内3个小时取出，用无菌纱布过滤掉经血，用等渗溶液冲洗3次，然后再将纱布中的组织块转移至保护液中，在5℃的条件下12小时内送至实验室进行分离操作；

所述的保护液为含有质量浓度为400mg/L青霉素和质量浓度为600mg/L链霉素的DMEN/F12培养基；所述的等渗溶液为生理盐水；

(2)将子宫内膜组织置于肾形盘中，用等渗溶液反复冲洗，将多余的红细胞和凝血块清洗干净，剩下白色的子宫内膜组织；所述的等渗溶液为PBS液；

(3)将子宫内膜组织浸泡于75％酒精中30秒，进行杀菌消毒，然后再用大量生理盐水冲洗子宫内膜组织；

(4)将子宫内膜组织剪成面积为1mm

(5)当子宫内膜组织碎块大部分长成光滑的球形时，将组织块用胰蛋白酶消化20分钟，收集消化液置于离心管中，离心收集消化液中的细胞，弃上清液，加入完全培养基吹打重悬细胞，将细胞悬液接种到新培养瓶中，置于37℃，5％CO2浓度，饱和湿度的培养箱中培养，之后每4天更换一次完全培养基；所述的胰蛋白酶质量浓度为0.2％；

(6)当培养瓶底部原代细胞之间达到85％融合后，用胰蛋白酶将培养瓶底部的细胞消化收集，然后进行传代培养，此细胞细胞为P1代；所述的胰蛋白酶质量浓度为0.2％；

(7)待P1代细胞长至95％融合后，用胰蛋白酶消化收集细胞并计数，然后将细胞进行传代培养，此细胞为P2代；所述的胰蛋白酶质量浓度为0.2％；所述将细胞进行传代培养，其接种细胞的浓度为1.5×10

(8)待P2代细胞长至95％融合后，用胰蛋白酶消化收集细胞，所述的胰蛋白酶质量浓度为0.2％。

实施例4细胞表型鉴定

经过试验验证与鉴定，实施例1-3的分离培养方法均能得到符合要求的子宫内膜间充质干细胞，其中以实施例1的分离培养方法更佳，因此以实施例1的实验图作为附图展示。表型鉴定的结果如图3-4所示：CD34(0.70％)、CD45(1.79％)、HLA-DR(1.26％),表达率均小于2％，符合间充质干细胞表型的国际标准；CD73(99.61％)、CD90(99.36％)、CD105(99.74％)，表达率均大于95％，符合间充质干细胞表型的国际标准。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。