用于快速筛选和鉴定微囊藻毒素降解菌的简并引物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及用于快速筛选和鉴定微囊藻毒素降解菌的简并引物及其应用，具体涉及一种简并引物的设计，以及利用该简并引物快速筛选和鉴定微囊藻毒素降解菌的方法和试剂盒。

背景技术

随着水体富营养化程度的加剧，全球范围内水生态系统蓝藻水华频繁爆发，由此引发的次级代谢产物-藻毒素的释放已成为严重威胁生态环境和人类健康的公共环境问题。大部分藻毒素具有水溶性，直接污染了水体。其中，微囊藻毒素(microcystins， MC)是蓝藻水华污染中检出率最高、危害最严重的藻毒素种类。MC能专一性地与细胞 (尤其是肝、肾细胞)内的蛋白磷酸酶结合，强烈抑制其活性，因而具有广泛的毒性作用，是一类强烈的肝脏肿瘤促进剂。MC具有环状结构和间隔双键，在水体中相当稳定，如何有效去除MC污染是环境科学领域的一个难题。研究证实，微生物降解是污染水体中MC去除的最主要途径之一。微生物来源于环境，利用微生物自身的代谢作用去除水体中的MC无疑是一种安全、高效、环境友好型的污染治理方法。

MC降解菌株的筛选是微生物修复技术开发中的重要环节。目前，MC降解菌的筛选一般采取以下方法：将待测菌株接种在以MC作为唯一碳源的液体培养基中，进行摇瓶实验，通过定期测定培养基中剩余MC的含量来计算降解率，从而确定菌株的降解能力。一般情况下，MC降解菌的成功筛选需要检测较多数量的待测菌株，逐一测定其降解率所需的工作量较大，而且该常规检测方法依赖于以价格昂贵的MC纯品(市售MC纯品每毫克达上千元)作为降解底物，并且MC的定量检测需要借助液相色谱技术，导致 MC的检测成本较高、检测周期较长。因此，亟需开发一种新的MC降解菌筛选方法，解决传统筛选方法显露出来的弊端。建立一种快速、准确、灵敏、高效、便捷、低成本的MC降解菌株筛选方法是非常有必要的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何快速、高效和/或低成本地筛选和/或鉴定微囊藻毒素降解菌。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了鉴定或辅助鉴定微囊藻毒素降解菌的简并引物对，所述简并引物对由引物mlrA-354F和引物mlrA-785R组成；所述引物 mlrA-354F为SEQ ID No.1所示的单链DNA分子；所述引物mlrA-785R为SEQ ID No.2 所示的单链DNA分子。

进一步地，SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列中，Y＝C或T，V＝G、A或C，S＝C或G。

所述引物mlrA-354F为正向引物，所述引物mlrA-785R为反向引物。

本发明还提供了鉴定或辅助鉴定微囊藻毒素降解菌的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包含所述简并引物对。

进一步地，所述试剂盒还包含DNA裂解液、PCR反应液。

所述DNA裂解液可包括：Tris-HCl，EDTA，NaCl，SDS。

所述PCR反应液包括：上游引物mlrA-354F，下游引物mlrA-785R，Premix Taq。

Premix Taq包括：DNA Polymerase、Buffer、dNTP。

本发明还提供了鉴定或辅助鉴定微囊藻毒素降解菌的方法，所述方法包括如下步骤：

A1)提取待测样品DNA；

A2)以所述待测样品DNA为模板，用所述简并引物对进行PCR扩增；根据PCR扩增产物中是否含有一个大小为449bp的DNA片段，确定待测样品是否含有微囊藻毒素降解菌或所述待测样品是否为微囊藻毒素降解菌。

上述方法中，所述根据PCR扩增产物中是否含有一个大小为449bp的DNA片段，确定待测样品是否含有微囊藻毒素降解菌或所述待测样品是否为微囊藻毒素降解菌的方法为：如果所述PCR扩增产物含有一个大小为449bp的DNA片段，则所述待测样品中含有微囊藻毒素降解菌或所述待测样品为微囊藻毒素降解菌；如果所述PCR扩增产物不含有一个大小为449bp的DNA片段，则所述待测样品中不含有微囊藻毒素降解菌或所述待测样品不为微囊藻毒素降解菌。

上述方法中，所述PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；98℃变性10s，50℃退火30s，72℃延伸1min；30个循环；72℃继续延伸10min。

上述方法中，所述PCR扩增反应体系为：DNA裂解上清液2μL，上游引物mlrA-354F和下游引物mlrA-785R各0.2μM，Premix Taq 25μL，灭菌蒸馏水补至50μL。

上述方法中，所述提取待测样品DNA的方法包括：将待测样品置于裂解液中80℃反应15分钟。

上述方法中，使用1％琼脂糖凝胶(EB染色)电泳检测PCR扩增产物。

本发明还提供了利用所述简并引物对筛选鉴定微囊藻毒素降解菌的方法，包括如下步骤：(1)从NCBI数据库中收集所有已公开的mlrA基因序列；(2)利用BioEdit 软件进行多序列比对，根据基因保守区设计简并引物对；(3)以待测菌株的基因组DNA 为模板，利用简并引物进行PCR扩增并测序；(4)运用NCBI中的Blastx工具将测序结果与已知序列进行比对；(5)基因比对结果为阳性的菌株进行MC降解能力的检测，验证PCR筛选方法的有效性。

检测结果显示，PCR扩增得到的阳性菌株全部能够有效降解MC，表明该方法具有很高的准确率。

本发明还提供了所述简并引物对或所述试剂盒、或所述试剂在鉴定或辅助鉴定微囊藻毒素降解菌中的应用。

本发明还提供了所述简并引物对在制备鉴定或辅助鉴定微囊藻毒素降解菌的产品中的应用。

mlr途径是目前研究最清楚的MC生物降解途径，广泛存在于MC降解菌中。其中，mlrA基因编码的金属蛋白酶(metalloprotease)是该酶促反应途径的初始降解酶，该基因作为评判菌株是否具备MC降解性能的分子标记基因被广泛使用。以此为分子生物学依据，可以针对mlrA基因设计通用引物，运用PCR扩增和测序技术进行MC降解菌的初步鉴定，进而通过液相色谱-质谱联用技术确认阳性菌株的降解能力。

本发明的目的在于提供一对通用的简并引物用于MC降解基因mlrA的扩增，从而从分子水平鉴定MC降解菌；本发明提供的方法不依赖于批量的摇瓶实验，可以达到简化筛选步骤、节约时间、节省成本的目的。

本发明为了快速准确检测待测样品中是否含有微囊藻毒素降解菌，从NCBI数据库中共获得了41条已公开的mlrA基因序列，通过序列对比分析，获得了两段基因保守区域，并针对mlrA基因设计了一对通用简并引物mlrA-354F和mlrA-785R，建立了利用该简并引物对快速筛选鉴定微囊藻毒素降解菌的方法。本发明人在设计引物时尽可能涵盖了所有已公开的mlrA基因序列，从而保证了该简并引物的通用性，并且设计引物时选取了距离较远的两段上游保守区和下游保守区，从而使扩增产物更长，序列比对结果更加可靠。所设计的引物能够准确地鉴定出具备高效的MC降解能力的阳性菌。

在本发明的一个实施方案中，还采用了一种能够快速裂解大部分细菌，使其释放核酸，然后直接用于各种PCR检测反应的试剂(Lysis Buffer for Microorganism toDirect PCR,TaKaRa Code No.9164)。该方法只需取待测菌株的单克隆置于裂解液中 80℃反应15分钟，即可取DNA裂解液上清用于后续PCR扩增，省去了提取基因组DNA 的复杂操作，极大地节省了时间与成本。

实验证明，本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1)筛选周期短：本发明使用的PCR筛选方法可以在两天内得到鉴定结果，而传统的筛选方法至少需要一周时间，该方法有效地缩短了筛选周期。

2)筛选成本低：本发明中降解菌的筛选不依赖于批量的摇瓶实验，从而节省了大量价格昂贵的MC纯品，并且减轻了筛选工作量，极大地节约了人力、物力以及财力成本。

3)筛选效果好：具体实施效果显示，利用本发明提供的方法所鉴定的阳性菌株均具有优异的MC降解能力，说明该方法具有良好的筛选效果。

附图说明

图1为mlrA基因简并引物序列。

图2为PCR产物电泳检测结果。M为DNA marker DL2000；ERW19、ERS04、ERS09、ERN02、ERN07、ERR01、ERR08分别代表7株待测菌株的PCR扩增产物，其中ERW19和 ERN07扩增条带大小正确。

图3为菌株ERW19和ERN07的MC降解曲线，LR代表微囊藻毒素MC-LR，RR代表微囊藻毒素MC-RR。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下面实施例中，涉及的供试菌株、试剂和仪器为：

1、实验中所用的7株待测菌分别为ERW19、ERS04、ERS09、ERN02、ERN07、ERR 01、ERR08(Yan-Hua Zeng,Zhong-Hua Cai,Jian-Ming Zhu,Xiao-Peng Du,Jin Zh ou.Twohierarchical LuxR-LuxI type quorum sensing systems in Novosphingob iumactivate microcystin degradation through transcriptional regulation of themlr pathway.Water Research,2020,183:116092),分离自蓝藻水华爆发时的太湖水样,所有供试菌株均可从清华大学深圳国际研究生院，即申请人处获得，以重复本发明的实验用。

2、实验中所用的试剂和仪器包括：

①DNA裂解用试剂：Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(TaKaRaCode No.9164)；

②PCR扩增用试剂：Premix Taq

③琼脂糖凝胶电泳用试剂：溴化乙锭(Ethidium bromide,EB)和50×TAE缓冲液购买自上海生工生物工程技术服务有限公司，所用琼脂糖为Biowest Agarose(西班牙琼脂糖)；

④MC降解验证实验用试剂：MgSO

⑤LC-MS/MS检测用试剂：乙腈和甲酸(均为色谱纯)购买自德国Merck公司，色谱柱为C18柱(Atlantis T3，2.1mm×100mm，3.0μm)购买自美国Waters公司。

实施例1引物的设计

综合文献调研和数据库挖掘法，从NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 共获得了41条已公开的mlrA基因序列。利用BioEdit软件(version 7.0.5.2)内置的 ClustalW工具对以上序列进行多序列比对，获得了两段基因保守区域；据此针对mlrA 基因设计了一对通用简并引物mlrA-354F/mlrA-785R(如图1所示)，预期利用这对简并引物可扩增得到450bp左右的目的基因片段，可以用来鉴定或辅助鉴定微囊藻毒素降解菌。引物委托广州艾基生物技术有限公司合成。

本发明的简并引物对由引物mlrA-354F和引物mlrA-785R组成；所述引物 mlrA-354F为SEQ ID No.1所示的单链DNA分子；所述引物mlrA-785R为SEQ ID No.2所示的单链DNA分子；SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列如下所示：

上游引物mlrA-354F：5’-TTCYTTGYVTTCTTCGCGCTC-3’

下游引物mlrA-785R：5’-CCCAGYTCGTTATGGATSGCGTGA-3’

上述简并引物中，Y＝C或T，V＝G、A或C，S＝C或G。

本发明所设计的引物尽可能涵盖了所有已公开的mlrA基因序列，从而保证了该简并引物的通用性，并且设计引物时选取了距离较远的两段上游保守区和下游保守区，从而使扩增产物更长，序列比对结果更加可靠。

实施例2利用简并引物筛选微囊藻毒素降解菌(MC)的方法

1、待测菌株DNA的获取

实验中所用的7株待测菌分离自蓝藻水华爆发时的太湖水样，分别编号为：ERW19、ERS04、ERS09、ERN02、ERN07、ERR01、ERR08。DNA的获取采用了一种能够快速裂解大部分细菌使其释放核酸，然后直接用于各种PCR检测反应的试剂。具体操作步骤为：

①向7支已灭菌的200μL离心管中分别加入50μL DNA裂解液(Lysis Buffer forMicroorganism to Direct PCR)；

②用灭菌枪头分别挑取7株待测菌株的单菌落，分别置于7支200μL离心管中轻轻吹打几下后取出；

③将步骤②中的7支200μL离心管置于PCR仪中80℃热变性15分钟后，4000rpm 低速离心1分钟，然后取2μL裂解后的上清液(DNA裂解上清液)作为PCR反应的DNA模板。

2、PCR扩增mlrA降解基因

以步骤1中获取的7株待测菌的DNA裂解液上清液为PCR扩增的DNA模板，利用简并引物mlrA-354F和mlrA-785R进行PCR扩增反应。

PCR反应体系为：DNA裂解上清液2μL，上游引物mlrA-354F和下游引物mlrA-785R各0.2μM，Premix Taq 25μL，灭菌蒸馏水补至50μL。

PCR反应条件为：预变性，95℃，5min；变性，98℃，10s；退火，50℃，30s；延伸，72℃，1min；变性、退火、延伸进行30个循环；继续延伸，72℃，10min，最后12℃保持直到取出，得到PCR扩增产物。

3、琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物

①配置琼脂糖凝胶：称取0.5g琼脂糖置于50mL 1×TAE缓冲液中(浓度为1％)，微波加热至琼脂糖完全融化，室温冷却至50℃-60℃时加入溴化乙锭(EB)至其终浓度为0.5μg/mL，然后将凝胶液缓慢倒入制胶槽中(提前插入1cm梳子)，待凝胶完全凝固后轻轻拨出梳子。

②上样、电泳：向每个样品孔中依次加入5μL DNA marker及PCR产物，接通电泳仪电源开始电泳，控制电压保持在120V左右，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm 时停止电泳。

③观察、拍照：打开凝胶成像仪软件，设置好各项参数后，将电泳后的凝胶放置在凝胶成像仪的紫外投射平台上，进行成像分析，成像结果保存为图片格式。

结果如图2所示，菌株ERW19和ERN07的PCR扩增产物大小均为450bp左右，符合理论预测，将这两个菌株的PCR产物送往广州艾基生物技术有限公司进行测序。

4、运用Blastx工具进行序列比对

①根据测序公司提供的序列峰图，读取得到了菌株ERW19和ERN07的扩增产物序列，分别为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4，大小均为449bp。

②运用NCBI中的Blastx工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 将测序结果与已知序列进行比对。

根据Blastx比对结果，菌株ERW19和ERN07的扩增产物序列与已报道的MC降解菌株Novosphingobium sp.THN1的mlrA基因的相似度均为100％。因此，利用这对简并引物，通过PCR扩增的方法筛选鉴定了两株阳性MC降解菌。

5、阳性菌株ERW19和ERN07的MC降解能力验证

进一步通过摇瓶培养实验来验证两株阳性菌(ERW19和ERN07)均具有高效的MC降解能力，说明本发明提供的分子生物学方法筛选效果好、准确性高。主要实施步骤与检测结果如下：

①摇瓶实验：将两株阳性菌ERW19和ERN07分别接种到以MC(MC-LR和MC-RR浓度均为100μg/L)为唯一碳源的MSM(MgSO

②LC-MS/MS测定MC含量：LC-MS/MS由高效液相色谱仪(LC-20A，岛津，日本)与三重四级杆串联质谱仪(API 3200，AB，美国)组合而成。高效液相色谱配备自动进样系统，色谱柱为C18柱(Atlantis T3，2.1mm×100mm，3.0μm，Waters，美国)，柱温为40℃，流动相A相为含0.1％甲酸的超纯水溶液(由溶质和溶剂组成的溶液，溶质是甲酸，溶剂为超纯水，甲酸的体积百分含量为0.1％的超纯水溶液)、B相为含0.1％甲酸的乙腈溶液(由溶质和溶剂组成的溶液，溶质是甲酸，溶剂为乙腈，甲酸的体积百分含量为0.1％的溶液)，采用线性梯度洗脱模式。ESI-MS/MS采用正离子ESI电离源，多反应监测模式(MRM)模式。

结果如图3所示，两株阳性菌均具备高效的MC降解能力，其中菌株ERW19可以在12h内将两种微囊藻毒素MC-LR和MC-RR完全降解；菌株ERN07也可以在18h将两种微囊藻毒素降解90％左右。表明用本发明设计和筛选的简并引物以及利用该简并引物建立的快速筛选和鉴定微囊藻毒素降解菌的方法对待测样本进行检测，可以准确、简便、快捷地鉴定出高效微囊藻毒素降解菌，所获得的MC降解菌具有更高的降解能力，可满足实际应用的需求。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 清华大学深圳国际研究生院

<120> 用于快速筛选和鉴定微囊藻毒素降解菌的简并引物及其应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

ttcyttgyvt tcttcgcgct c 21

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

cccagytcgt tatggatsgc gtga 24

<210> 3

<211> 449

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

ttccttgcat tcttcgcgct cacaggaatc atgtgggttc agacatacct ctacgctccg 60

cctggtacgc ttgatcgtac cttcctgcgc tatgggtcag atccggtcgc catttatgtg 120

atgctggcag catcgctgct actcagccct ggcccgctgc tcgaagaact gggctggcgc 180

ggctttgcgc tgccgcagct cctcaagaag tttgaccccc ttaccgcagc ggtgatcctc 240

ggcatcatgt ggtgggcctg gcatttgcca cgcgacctgc caacactgtt ctccggcgcc 300

cctggcgcgg cctggagcgt tattgtcaaa caactcgtca tcgctcctgg gttcattgcg 360

agcaccatca tcgctgtctt cgtatgcaac aagctcggtg gatcaatgtg ggggggcgtg 420

ctcactcacg ccatccataa cgagctggg 449

<210> 4

<211> 449

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

ttccttgcat tcttcgcgct cacaggaatc atgtgggttc agacatacct ctacgctccg 60

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atgctggcag catcgctgct actcagccct ggcccgctgc tcgaagaact gggctggcgc 180

ggctttgcgc tgccgcagct cctcaagaag tttgaccccc ttaccgcagc ggtgatcctc 240

ggcatcatgt ggtgggcctg gcatttgcca cgcgacctgc caacactgtt ctccggcgcc 300

cctggcgcgg cctggagcgt tattgtcaaa caactcgtca tcgctcctgg gttcattgcg 360

agcaccatca tcgctgtctt cgtatgcaac aagctcggtg gatcaatgtg ggggggcgtg 420

ctcactcacg ccatccataa cgagctggg 449