一种预防和/或治疗心血管疾病的药物组合物

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种预防和/或治疗心血管疾病的药物组合物。

背景技术

当前心血管疾病已成为威胁人类健康的头号杀手，仅心力衰竭患者全球就有4000万，已经成为人类死亡的主要原因。研究发现哺乳动物成年后心肌细胞逐渐失去增殖能力，一旦发生心梗，心肌细胞的损失将不可逆转。成年人约有20-40亿个心肌细胞，心梗发生后数小时内会造成约25％的心肌细胞损失，剩余的心肌细胞增殖能力非常有限，不足以恢复心脏的收缩功能，患者最终心衰死亡。为解决这一难题，除外科手术外，基础转化研究主要包括寻找心脏干细胞或前体细胞，通过诱导分化移植到心梗区域，然而缺乏足够确凿的分子标记物且移植效率低限制了这一技术的使用，此外还可以利用重编程技术将成纤维细胞转分化为心肌细胞，或通过促进内源心肌细胞增殖的方式以补充丢失的心肌。已有的研究表明低等的脊椎动物如斑马鱼、蝾螈等心脏具有很强的再生能力，新生乳鼠也具有一定的再生能力，主要通过损伤诱导的心肌细胞增殖来实现，而这种能力在成年之后就消失了。以往人们认为成年心脏不能再生，但是大量证据表明哺乳动物心肌细胞存在缓慢的更新，并且研究发现新生的心肌细胞来源于已有的心肌。因此，越来越多的科学家们对诱导内源性心肌细胞的增殖这一策略感兴趣，寻找能够诱导内源性心肌细胞增殖的药物对于人类心血管疾病的治疗具有重大意义。

盐酸去氧肾上腺素(Phenylephrine Hcl，CAS No.：61-76-7)目前主要用于防治脊椎麻醉、全身麻醉、应用氯丙嗪等原因引起的低血压，也用于室上性心动过速和散瞳检查等。

巴瑞克替尼(Baricitinib，CAS No.：1187595-84-1)是一种选择性的Janus激酶1(JAK1)和Janus激酶2(JAK2)不可逆抑制剂。Baricitinib于2017年2月13日获得欧洲药品管理局(EMA)批准上市，之后于2017年7月3日获日本医药品医疗器械综合机构(PMDA)批准上市，本品最初由Incyte研发，后来授权给礼来并由其负责上市销售，商品名为

去氢骆驼蓬碱(Harmine，CAS No.442-51-3)目前主要公开的用途有促进骨生长(US2013315965A1)、促进白色脂肪细胞褐变，抵抗高脂肪饮食引起的脂肪、葡萄糖耐受不良和胰岛素抵抗(CN104224780A)、治疗肥胖及肥胖综合征，如2型糖尿病(WO2010080756A2)，治疗肾病，癌症(WO2010036567A2)以及荔枝霜疫霉菌病(CN105037350A)。但并没有去氢骆驼蓬碱在诱导内源性心肌细胞增殖方面的相关报道。

VO-Ohpic trihydrate(CAS No.：476310-60-8)是一种有效的PTEN(phosphataseand tensin homolog)抑制剂。VO-Ohpic是一种有效的抗癌药物，可以单独应用或与其它药物联合应用来降低肿瘤复发的频率。但并没有VO-Ohpic trihydrate在诱导内源性心肌细胞增殖方面的相关报道。

AZD3965(CAS No.：1448671-31-5)是一种高效的单羧酸转运体MCT1选择性抑制剂，结合Ki值为1.6nM，比MCT2高6倍的选择性。AZD3965在优先表达MCT1的淋巴瘤细胞系中，有效的抑制了乳酸的转运以及细胞的生长。在H526、HGC27和DMS114细胞中，AZD3965增加了细胞内的乳酸，并显著的减少了乳酸的摄入。AZD3965(100mg/kg,p.o.)在含有H526肿瘤的小鼠中，增加了乳酸浓度，减少了肿瘤生长，增加了放射的敏感性。AZD3965(100mg/kg,p.o.)在含有COR-L103肿瘤的非肥胖糖尿病scid-γ小鼠中，减少了肿瘤生长并增加了瘤内的乳酸。但并没有AZD3965在诱导内源性心肌细胞增殖方面的相关报道。

但并没有盐酸去氧肾上腺素、巴瑞克替尼、去氢骆驼蓬碱、VO-Ohpic trihydrate和AZD3965组合物在诱导内源性心肌细胞增殖方面的相关报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种药物组合物。

本发明所提供的药物组合物(简称为5SM)由盐酸去氧肾上腺素、巴瑞克替尼、去氢骆驼蓬碱、VO-Ohpic trihydrate和AZD3965组成，

其中，所述盐酸去氧肾上腺素(Phenylephrine Hcl)、巴瑞克替尼(Baricitinib)、去氢骆驼蓬碱(Harmine)、VO-Ohpic trihydrate和AZD3965的摩尔比依次为1:(0.01～200):(0.01～40):(0.01～40):(0.01～100)。

进一步的，所述盐酸去氧肾上腺素(Phenylephrine Hcl)、巴瑞克替尼(Baricitinib)、去氢骆驼蓬碱(Harmine)、VO-Ohpic trihydrate和AZD3965的摩尔比依次为1:(0.05～100):(0.5～25):(0.02～30):(0.02～60)，或摩尔比依次为0.2:(4-20):5:(2-6):(2-12)，或摩尔比依次为10:(0.5-4):(0.5-5):(0.2-2):(0.2-2)，或摩尔比依次为(0.2-10):4:5:2:2。

更进一步的，所述盐酸去氧肾上腺素(Phenylephrine Hcl)、巴瑞克替尼(Baricitinib)、去氢骆驼蓬碱(Harmine)、VO-Ohpic trihydrate和AZD3965的摩尔比依次为2:4:5:2:2，或摩尔比依次为0.2:(4-20):5:2:2，或摩尔比依次为0.2:4:5:(2-6):2，或摩尔比依次为0.2:4:5:2:(2-12)，或摩尔比依次为10:(0.5-4):5:2:2，或摩尔比依次为10:4:(0.5-2):2:2，或摩尔比依次为10:4:5:(0.2-1):2，或摩尔比依次为10:4:5:2:(0.2-2)。

所述盐酸去氧肾上腺素，CAS No.：61-76-7，其结构式如式I所示：

所述巴瑞克替尼，CAS No.：1187595-84-1，其结构式如式Ⅱ所示：

所述去氢骆驼蓬碱，CAS No.442-51-3，其结构式如式Ⅲ所示：

VO-Ohpic trihydrate，CAS No.：476310-60-8，其结构式如式Ⅳ所示：

AZD3965，CAS No.：1448671-31-5，其结构式如式Ⅴ所示：

本发明的另一个目的是提供上述药物组合物的应用。

本发明所提供的上述药物组合物的应用包括其在制备促进心肌细胞增殖和/或改善心梗后心脏功能药物中的应用。

所述心肌细胞可为哺乳动物心肌细胞。所述哺乳动物包括人类。

所述改善心梗后心脏功能具体体现在提高心脏收缩功能、减小心梗后心肌纤维化面积。

本发明所提供的上述药物组合物的应用还包括其在制备预防和/或治疗心血管疾病药物中的应用。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述心血管疾病是由心肌细胞缺失、损伤或死亡导致的心脏病。

更进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述心脏病包括但不限于心肌梗死以及其他心肌细胞缺失、损伤或死亡导致的心肌病等。

本发明还保护一种药物制剂。

所述药物制剂，包括本发明所提供的药物组合物以及药学上可接受的载体。

所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

上述药物制剂可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式；上述各种剂型的药物制剂均可以按照药学领域的常规方法制备。

上述药物制剂可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

本发明通过药效学实验证明，由盐酸去氧肾上腺素、巴瑞克替尼、去氢骆驼蓬碱、VO-Ohpic trihydrate和AZD3965组成的小分子组合物能显著促进新生大小鼠心肌细胞以及人iPSC来源心肌细胞的增殖，并且进一步改善心梗后心脏功能。因此，该组合物可以用于制备促进心肌细胞增殖药物以及治疗或预防心脏病的药物等相关领域，为治疗或预防心脏病例如心肌梗死提供一种新的药物和治疗思路。

附图说明

图1为小分子组合5SM对新生大鼠心肌细胞增殖的促进作用图及统计图；其中，(A)小分子组合5SM中各小分子浓度比例在2:4:5:2:2时，与阴性对照(0.5％FBS+等量DMSO)和阳性对照(10％FBS+等量DMSO)相比能显著增加mAG-Geminin阳性新生大鼠心肌细胞比例；(B)当盐酸去氧肾上腺素(Phenylephrine Hcl)浓度为10μM时，改变组合中其他小分子的浓度后对新生大鼠心肌细胞的促增殖作用；(C)当盐酸去氧肾上腺素(Phenylephrine Hcl)浓度为0.2μM时，改变组合中其他小分子的浓度后对新生大鼠心肌细胞的促增殖作用；Mean±SEM；*P＜0.05，***P＜0.001，****P＜0.0001，One-way ANOVA，Dunnett多重比较方法。

图2为小分子组合5SM对新生小鼠心肌细胞增殖的促进作用图；其中，(A)小分子组合5SM能使mAG-Geminin阳性新生小鼠心肌细胞比例显著增加；(B)5SM对新生小鼠心肌细胞增殖影响的统计结果。Mean±SEM；***P＜0.001，非配对双尾t检验。

图3为小分子组合5SM促进新生大鼠以及人iPSC来源心肌细胞进入细胞周期的作用图；其中，(A-D)5SM小分子组合可以提高新生大鼠心肌细胞(A-C)细胞周期活性标志物(PH3、Ki67、Aurora B)的表达以及促进人iPSC来源心肌细胞(D)的增殖；(E-F)5SM对新生大鼠心肌细胞(E)及iPSC来源心肌细胞(iPSC-CMs)(F)增殖影响的统计结果。Mean±SEM；*P＜0.05，***P＜0.001，非配对双尾t检验。

图4为小分子组合5SM改善成年大鼠心梗后心脏收缩功能，减小梗死后纤维化面积的作用图；其中(A-B)显示小分子组合5SM能使心脏功能指标EF、FS显著提高。N＝3；Mean±SEM；**P＜0.005，***P＜0.001,two way ANOVA,Bonferroni多重检验方法；(C)马松结果显示5SM小分子组合可以使心梗8周后心肌纤维化面积减小；(D)5SM和对照组纤维化面积的统计结果。N＝3；Mean±SEM；*P＜0.05，**P＜0.005，非配对双尾t检验。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所使用的5SM组合物为5SM组合物的DMEM高糖培养基(Hyclone)溶液，其中，各物质的浓度分别为盐酸去氧肾上腺素(2μmol/L)，巴瑞克替尼(4μmol/L)，去氢骆驼蓬碱(5μmol/L),VO-Ohpic trihydrate(2μmol/L)，AZD3965(2μmol/L)。

其中，盐酸去氧肾上腺素(1mL*10mM，溶于DMSO)和巴瑞克替尼(1mL*10mM，溶于DMSO)购买于上海陶素生化公司。

去氢骆驼蓬碱(1mL*10mM，溶于DMSO),VO-Ohpic trihydrate(1mL*10mM，溶于DMSO)，AZD3965(1mL*10mM，溶于DMSO)购买于MCE公司。

下述实施例中“FBS”为胎牛血清，购买自GIBCO公司，货号为10437077

下述实施例中DMEM高糖培养基购买自Hyclone公司，货号为SH30022.01

下述实施例中hoechst33342购买自Yeasen，货号为40732ES10

下述实施例中使用的cTnT-mAG-hGeminin(1/110)病毒的构建方法如下：

cTnT心肌特异性启动子(如序列表中序列1所示)和mAG-hGeminin(1/110)(GenBank:NM_015895)通过pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit(全式金CU101-01)组装克隆到pShuttle载体(Addgene 16402)上，然后采用限制性内切酶PmeI进行酶切，收集线性化质粒；将线性化质粒和pAdEasy1DNA(Addgene 16400)共转化BJ5183感受态，筛选重组质粒并扩增，然后用重组质粒转染293A细胞(转染前一天将7.5×10

下述实施例中使用的人诱导性多能干细胞诱导的心肌细胞(hiPSC-derivedcardiomyocytes)按照下述文献的方法制备得到：Cell Res.2017Aug；27(8):1002-1019.doi:10.1038/cr.2017.84.Epub 2017Jun 16。

下述实施例中使用的Anti-Cardiac Troponin T为abcam公司生产的货号为ab8295的一抗

下述实施例中使用的Anti-α-Actinin为sigma公司生产的货号为A7811的一抗

下述实施例中使用的Phospho-Histone H3(Ser10)为CST公司生产的货号为9701S的一抗

下述实施例中使用的Anti-Ki67为abcam公司生产的货号为ab15580的一抗

下述实施例中使用的Anti-Aurora B抗体为abcam公司生产的货号为ab2254的一抗。

下述实施例中使用的山羊抗兔IgG(H+L)高度交叉吸附的二级抗体为Invitrogen公司生产的货号为A32731、商品名称为Goat anti-Rabbit IgG(H+L)Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody,Alexa Fluor Plus 488的二抗。

下述实施例中使用的山羊抗鼠IgG(H+L)高度交叉吸附的二级抗体为Lifetechnologies公司生产的货号为A21424、商品名称为Goat anti-Mouse IgG(H+L)HighlyCross-Adsorbed Secondary Antibody,Alexa Fluor 555的二抗。

实施例1、小分子组合5SM促进大鼠心肌细胞增殖的体外试验

(1)SD大鼠的心肌细胞的培养

分离出生3天SD大鼠的心肌细胞进行培养，DMEM高糖培养基(Hyclone)+5％马血清(GIBCO)，在37度，5％二氧化碳培养箱培养。

(2)实验分组和处理

分离SD大鼠的心肌细胞，加入5％马血清(GIBCO)+DMEM高糖培养基培养液(Hyclone)，并且用阿糖胞苷(终浓度20μmol/L)处理以抑制非心肌细胞的生长，细胞贴壁48h后感染cTnT-mAG-hGeminin(1/110)病毒(病毒感染的MOI值＝100)，再过24小时后换成含0.5％FBS的DMEM培养液，分组加药处理，分组如下：

a、实验组：加小分子组合5SM处理(培养基中各物质的终浓度分别为：盐酸去氧肾上腺素(2μmol/L)，巴瑞克替尼(4μmol/L)，去氢骆驼蓬碱(5μmol/L),VO-Ohpictrihydrate(2μmol/L)，AZD3965(2μmol/L))24小时。

b、空白对照组(Control)：加与a实验组等量DMSO处理。

c、阳性对照组(Positive Control)：用含与a实验组等量DMSO的10％FBS处理。

(3)试验方法

上述3个分组分别处理24h后，用hoechst33342荧光染料染细胞核，然后用高内涵活细胞分析仪(Molecular Device)进行拍照，并分析mAG-hGeminin(1/110)阳性心肌细胞及总细胞数。

(4)结果

试验结果如图1所示。由图1(A)可知，小分子组合5SM中各小分子浓度比例在2:4:5:2:2与阴性对照(0.5％FBS+等量DMSO)和阳性对照(10％FBS+等量DMSO)相比能使mAG-Geminin阳性新生大鼠心肌细胞比例显著增加；不同浓度比例范围的5SM对新生大鼠心肌细胞增殖影响的统计结果见图1(B，C)。Mean±SEM；*P＜0.05，***P＜0.001，****P＜0.0001，One-way ANOVA，Dunnett多重比较方法。

实施例2、小分子组合5SM促进小鼠心肌细胞增殖的体外试验

(1)新生小鼠心肌细胞的培养

分离出生3天小鼠的心肌细胞进行培养(分离方法参考文献：改良的乳小鼠心肌细胞原代培养方法[J].中国比较医学杂志,2016,026(004):62-67.)，用含10％FBS的DMEM高糖培养基培养细胞，在37度，5％二氧化碳培养箱中培养。

(2)实验分组和处理

分离出生3天小鼠的心肌细胞，加入10％FBS+DMEM高糖培养基(Hyclone)，加阿糖胞苷(终浓度20μmol/L)处理以抑制非心肌细胞的生长，细胞贴壁48h后感染cTnT-mAG-hGeminin(1/110)病毒(病毒感染的MOI值＝100)，再过24小时后换成含0.5％FBS的DMEM培养液，分组加药处理，分组如下：

a、实验组：加小分子组合5SM处理(培养基中各物质的终浓度分别为：盐酸去氧肾上腺素(2μmol/L)，巴瑞克替尼(4μmol/L)，去氢骆驼蓬碱(5μmol/L),VO-Ohpic trihydrate(2μmol/L)，AZD3965(2μmol/L))24小时。

b、空白对照组(Control)：加与a实验组等量DMSO处理。

(3)试验方法

上述2个分组分别处理24h后，用hoechst33342荧光染料染细胞核，然后用高内涵活细胞分析仪(Molecular Device)进行拍照，并分析mAG-hGeminin(1/110)阳性心肌细胞及总细胞数。

(4)结果

试验结果如图2所示。由图2(A)可知，小分子组合5SM能使mAG-Geminin阳性新生小鼠心肌细胞比例显著增加；5SM对新生小鼠心肌细胞增殖影响的统计结果见图2(B)。Mean±SEM；***P＜0.001，非配对双尾t检验。

实施例3、小分子组合5SM促进新生大鼠心肌细胞进入细胞周期的体外试验

分离出生3天的大鼠心肌细胞，加小分子组合5SM处理48h(培养基中各物质的终浓度分别为：盐酸去氧肾上腺素(2μmol/L)，巴瑞克替尼(4μmol/L)，去氢骆驼蓬碱(5μmol/L)，VO-Ohpic trihydrate(2μmol/L)，AZD3965(2μmol/L)，以DMEM+DMSO作为对照(control)，48h后用PBS洗三次，4％PFA(多聚甲醛)室温固定15min，PBS洗三次，1％BSA/PBS/0.1％Triton室温封闭1h，1h后加一抗:Anti-α-Actinin(1:300，sigma,mouse,A7811)，Phospho-Histone H3(Ser10)抗体(1:300,CST,rabbit,9701S),Anti-Ki67(1:300,abcam,rabbit,ab15580),Anti-Aurora B抗体(1:300,abcam,rabbit,ab2254)4℃过夜,用1％BSA/PBS/0.02％Tween洗4次，加二抗：山羊抗兔IgG(H+L)高度交叉吸附的二级抗体(1:500,Invitrogen,A32731)，山羊抗鼠IgG(H+L)高度交叉吸附的二级抗体(1:500,Lifetechnologies,A21424)，室温放置1h，用PBS/0.02％Tween洗3次，用DAPI染细胞核，用共聚焦显微镜拍照，统计分析PH3阳性，Ki67阳性，AuroraB阳性的心肌细胞比例。

试验结果如图3所示。由图3(A、B、C、E)可知，小分子组合5SM处理组新生大鼠PH3阳性，Ki67阳性和AuroraB阳性心肌细胞与对照组相比显著增加。

实施例4、小分子组合5SM促进人iPSC来源心肌细胞增殖的体外试验

获得人诱导性多能干细胞诱导的心肌细胞(hiPSC-derived cardiomyocytes)加小分子组合5SM处理48h(培养基中各物质的终浓度分别为：盐酸去氧肾上腺素(2μmol/L)，巴瑞克替尼(4μmol/L)，去氢骆驼蓬碱(5μmol/L),VO-Ohpic trihydrate(2μmol/L)，AZD3965(2μmol/L))，以RPMI1640+DMSO作为对照(control)，48h后用PBS洗三次，4％PFA(多聚甲醛)室温固定15min，PBS洗三次，1％BSA/PBS/0.1％Triton室温封闭1h，1h后加一抗:Anti-Cardiac Troponin T(1:300，abcam,mouse,ab8295)，Phospho-Histone H3(Ser10)抗体(1:300,CST,rabbit,9701S)，4℃过夜，用1％BSA/PBS/0.02％Tween洗4次，加二抗：山羊抗兔IgG(H+L)高度交叉吸附的二级抗体(1:500,Invitrogen,A32731)，山羊抗鼠IgG(H+L)高度交叉吸附的二级抗体(1:500,Life technologies,A21424)，室温放置1h，用PBS/0.02％Tween洗3次，用DAPI染细胞核，用高内涵活细胞分析仪(Molecular Device)拍照，分析PH3阳性的心肌细胞数及细胞总数。

试验结果如图3所示。由图3(D、F)可知，小分子组合5SM处理组PH3阳性人iPSC来源心肌细胞比对照组增加了接近3倍。

实施例5、小分子组合5SM能改善成年大鼠心脏功能，减少梗死面积

心梗造模及给药方法：选取体重约为250g的健康雄性SD大鼠23只，随机分成3组(假手术组8只，对照组7只，试验组8只)。用10％水合氯醛(0.3ml/100g)麻醉大鼠后脱掉颈部和胸部的毛。剪开颈部皮肤，钝性分离皮下组织及肌肉，暴露气管后行气管插管。待呼吸稳定后，于左侧第4肋间剪开皮肤，钝性分离皮下和肌肉组织，用扩胸器撑开3，4肋间，暴露心脏。撕去心包膜后，在左心耳与肺动脉圆锥交界处下方2-3mm处穿针，用6-0带针缝合针结扎左冠状动脉前降支，随即用15％GelMA配制的5SM(盐酸去氧肾上腺素(20μmol/L)，巴瑞克替尼(40μmol/L)，去氢骆驼蓬碱(50μmol/L),VO-Ohpic trihydrate(20μmol/L)，AZD3965(20μmol/L))(试验组，80μl)或者等量DMSO(对照组，80μl)涂抹梗死及梗死边缘区域。用4-0缝合线缝合胸腔及皮肤，并在术后用碘伏涂抹术野以及注射1万单位青霉素溶液预防感染。假手术组除了不结扎冠状动脉和不涂抹等量DMSO外，其余操作与对照组相同。术后每隔两天腹腔注射用生理盐水配制的5SM(盐酸去氧肾上腺素(20μmol/L)，巴瑞克替尼(40μmol/L)，去氢骆驼蓬碱(50μmol/L),VO-Ohpic trihydrate(20μmol/L)，AZD3965(20μmol/L))或等量DMSO溶液1ml，直至心梗后8周处死大鼠并取材。

心脏功能测量方法：心梗前，心梗后1周，4周，8周用Vevo-2100超声仪器测量心脏功能指标射血分数(EF)和左室短轴缩短率(FS)。大鼠胸部脱毛后，用异氟烷气麻，在大鼠胸部及四肢涂抹耦合剂，用大鼠超声专用探头，探测左心室心动周期变化，记录心动周期及心脏腔室形态变化，并测量任意三个以上心动周期，统计分析心脏功能指标。

马松染色方法：心梗8周后用10％水合氯醛(0.3ml/100g)麻醉大鼠，并用10％KCl灌注心脏，取下心脏后在PBS中洗去多余的血液，将心脏从基底部到心尖部切成四部分，弃去最靠近基底部的一段，在PFA中固定48h，脱水，石蜡包埋及切片(5um厚度切片，每部分心脏切3片，每个心脏一共9片)，进一步用Masson三色染色试剂盒(Solarbio，G1340)做Masson染色检测纤维化面积。使用ImageJ统计纤维化面积，纤维化面积比例为纤维化面积占左心室总面积的百分比。

试验结果如图4所示。由图4(A、B)可知，小分子组合5SM能使心脏功能指标EF，FS显著提高。图4(C、D)Masson结果显示小分子组合5SM可以减小心梗8周后心脏纤维化面积。