一种产L-柠檬烯的热带假丝酵母工程菌及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种产L-柠檬烯的热带假丝酵母工程菌及其构建方法，属于微生物技术领域。

背景技术

L-柠檬烯，又称作苧烯，是一种重要的单环类单萜化合物，在自然界中分布广泛，已经被发现存在于300多种植物中，并且被FDA鉴定为安全的化合物。L-柠檬烯具有抑菌、消炎、抗癌、抗氧化等多种药理活性，但是L-柠檬烯的化学性质不稳定，因此应用具有一定的局限性。自然界中存在的L-柠檬烯有三种形式：右旋L-柠檬烯(D-柠檬烯)和左旋L-柠檬烯(L- 柠檬烯)为光学异构体，以及一种外消旋体(D/L-柠檬烯)。L-柠檬烯主要存在于留兰香、薄荷、松针、橡树等植物或者树木的挥发油中，具有类似于松油和松脂的芳香气味，因此可作为优质的香料被广泛应用于食品、饮料、化妆品中，具有很高的市场价值。

目前，L-柠檬烯的工业生产主要还是通过直接从植物原料中提取实现的，虽然利用植物提取直接制备的L-柠檬烯被认为是天然的，且更受消费者欢迎。但是，这一方法存在许多不足之处，如原料来源有限、目标物质含量低、分离提取难度大等。此外，利用化学方法也能够合成L-柠檬烯，但化学合成法不仅需要较高的成本(如高压力和温度)，还会产生环境问题(如使用大量有机溶剂)。近年来，随着人们对健康、能源和环境问题越来越关注，从而掀起了对有着重要生物学功能的天然含氧单萜类化合物的研究热潮。

因此，通过微生物代谢工程技术生产L-柠檬烯是一种新的思路和方法。微生物转化法具有转化率高、反应条件温和、低碳和可持续发展等优点，因此具有广阔的发展前景。

发明内容

为了得到一种操作简单、转化效率高、生产成本低、工业化应用前景广的高产柠檬烯的方法，本发明提供了一种重组热带假丝酵母(Candida tropicalis)，表达了法尼基焦磷酸合成酶突变体ERG20WW，和来源于留兰香(Mentha spicata)的柠檬烯合酶。

在一种实施方式中，所述突变体ERG20WW含有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

在一种实施方式中，编码所述ERG20WW突变体的基因是在如SEQ ID NO.1所示的ERG20核苷酸序列的基础上，将编码第95位的苯丙氨酸和编码第126位的天冬酰胺进行突变得到的。

在一种实施方式中，所述突变是将第95位的苯丙氨酸和第126位的天冬酰胺都突变为色氨酸得到的。

在一种实施方式中，所述来源于Mentha spicata的柠檬烯合酶基因LS的NCBI登录号为 GeneID:L13459。

在一种实施方式中，以热带假丝酵母(Candida tropicalis)ATCC 20336为宿主。

在一种实施方式中，所述热带假丝酵母ATCC 20336还敲除了酰基辅酶A氧化酶基因 POX5和D-乳酸脱氢酶基因DLD1。

本发明还提供了一种构建上述重组热带假丝酵母的方法，包括以下步骤：

(1)合成如GeneID:L13459所示的柠檬烯合酶基因，并将柠檬烯合酶基因连接到质粒上，得到重组质粒；

(2)将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的ERG20WW的基因通过CRISPR-Cas9整合到热带假丝酵母基因组上，得到表达宿主；

(3)采用醋酸锂转化法将经线性化的步骤(1)构建的重组质粒转化到步骤(2)构建的重组热带假丝酵母中，构建产柠檬烯工程菌。

在一种实施方式中，所述柠檬烯合酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

本发明还提供了一种生产柠檬烯的方法，所述方法是将所述重组热带假丝酵母在发酵培养基中发酵制备柠檬烯。

在一种实施方式中，所述发酵培养基为YPD培养基。

在一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：

(1)将所述重组热带假丝酵母的单菌落接种到种子培养基中，在30℃，200rpm下培养 24h，得到种子液；

(2)将步骤(1)得到的种子液以按OD

在一种实施方式中，所述种子培养基、发酵培养基均为YPD培养基。

本发明提供了所述重组热带假丝酵母在农业、食品工业、医药卫生领域或化妆品领域的应用。

在一种实施方式中，所述应用包括但不限于生产含L-柠檬烯的产品。

有益效果：

(1)本发明提供了一种操作简单、转化效率高的生产柠檬烯的方法，本发明采用热带假丝酵母(C.tropicalis)ATCC 20336为宿主，对柠檬烯的耐受性高，可达141.48mg/L,有利于该菌株在农业、食品工业、医药卫生领域和化妆品中的应用。

(2)本发明构建的重组热带假丝酵母菌株，通过代谢工程改造，敲除了酰基辅酶A氧化酶基因POX5和D-乳酸脱氢酶基因DLD1，整合表达了异源L-柠檬烯合酶基因LS和法尼基焦磷酸合成酶突变体基因ERG20WW，可以明显提高柠檬产量，使柠檬烯产量由出发菌株GJR-LS-01的产量0.092mg/L提高到141.48mg/L，使产量提高了1000多倍，提高产量的同时为柠檬烯生产菌株的研究提供思路。

附图说明

图1为引入甲羟戊酸代谢途径基因以及柠檬烯合成基因后热带酵母生成柠檬烯的代谢途径。

图2为菌株GJR-LS-01以葡萄糖为唯一碳源以及菌株GJR-tLS-01的摇瓶发酵生产柠檬烯的结果图。

图3为菌株GJR-EW-tLS-04在不同发酵时间生产柠檬烯的结果图。

图4为菌株GJR-EW-tLS-04以不同浓度的葡萄糖为碳源的摇瓶发酵生产柠檬烯的结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例中所涉及的培养基如下：

YPD培养基(g/L)：葡萄糖20，酵母膏10，蛋白胨20。

MM培养基(g/L)：葡萄糖20、酵母基础氮源培养基(yeast nitrogen base，YNB)6.7、硫酸铵10。

SM培养基(g/L)：在MM培养基的基础上添加60mg/L尿嘧啶。

LB培养基(g/L)：蛋白胨10、酵母膏5、氯化钠10。

柠檬烯含量的检测：

取上层正十二烷层进行气相-质谱(GC-MS)检测。检测条件为：TG–5MS气相色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)载气为He，升温程序：50℃保持1min后，按照6℃/min升温至 100℃，再按照20℃/min升温至280℃，运行5min。

下述实施例中所涉及的引物序列如表1所示：

表1引物序列

实施例1产柠檬烯工程菌的构建

敲除盒的构建：以POX5的基因敲除盒为例介绍，以C.tropicalis ATCC 20336基因组为模板，以POX5-F和POX5-R为引物进行扩增，对上述PCR产物琼脂糖凝胶电泳验证，验证正确后进行胶回收，产物标记为POX5。使用solution I将片段POX5与pM19T simple载体进行连接，连接成功的产物片段转化进E.coli JM109感受态细胞，将转化子稀释涂布在添加了氨苄青霉素的LB固体培养基上并筛选阳性转化子(使用菌落PCR的方法)。挑取菌落PCR正确的单菌落接种在添加了氨苄青霉素的液体LB培养基内培养8～12h，使用少量质粒提取试剂盒提取重组质粒，利用Mlu I和Pst I酶切验证，再对该质粒进行测序分析，确认正确的质粒命名为Ts-POX5。以重组质粒Ts-POX5为模板，以反向引物rPOX5-F和rPOX5-R(内置PstⅠ和XbaⅠ酶切位点)，反向PCR获得片段POX5U-Ts-POX5D并通过核酸电泳凝胶回收该片段，PCR清洁试剂盒纯化。使用Pst I和Mlu I对质粒Ts-gda324-URA3经限制性内切酶Pst I和Xba I消化，经过凝胶回收后将线性载体POX5U-Ts-POX5D与DNA片段 gda324-URA3使用一步连接试剂盒进行一步克隆连接，获得重组质粒Ts-POX5-gda324-URA3。将此重组质粒使用限制性内切酶Mlu I进行消化获得敲除盒POX5-gda324-URA3-POX5。利用相似策略，以Ts-ERG20WW为模板,以引物rDLD1-F和rDLD1-R构建DLD1敲除盒；应用 POX5敲除盒、DLD1敲除盒，以尿嘧啶缺陷型改造的C.tropicalis ATCC 20336构建敲除了 POX5和DLD1基因的热带假丝酵母，命名为CU-200。

线性化载体准备：合成核氨酸序列如SEQ ID NO.2所示的柠檬烯烯合酶LS；

以全长L-柠檬烯合酶LS基因为模板，LS-F和LS-R为引物，PCR扩增如Gene ID:L13459 所示的L-柠檬烯合酶LS基因,对PCR产物进行纯化，将纯化产物与片段 POX5-gda-URA3-PGAPDH-carRP-TENO1A通过一步克隆试剂盒连接，获得重组质粒Ts-POX5-gda-URA3-PGAPDH-LS-TENO1A。利用Mlu I单酶切，获得 POX5-PGAPDH-LS-TENO1A-gda324-URA3-POX5线性化片段，对所得片段进行纯化。

采用LiCl转化法，以尿嘧啶缺陷型菌株C.tropicalis CU-200为出发菌株，以URA3基因为筛选标记，将DNA纯化片段转入宿主内，在MM固体培养基涂布于30℃培养箱培养3d。

挑取上述MM固体培养基上的转化子，提取基因组，进行PCR验证，鉴别正确转化子并且涂布在含5-FOA的培养基上，对筛选标记基因URA3弹出，经过PCR初步验证弹出URA3 基因后，将PCR产物送公司测序，挑选正确的菌株进行保藏。在上述基础上重复使用URA3，对DLD1基因敲除，以及后续基因的整合。

对ERG20的定点突变(将95位苯丙氨酸以及126位天冬酰胺突变成色氨酸)：以SEQID NO.1所示的Ts-ERG20为模板，设计引物ERG20WW-F和ERG2WW-R进行全质粒PCR， PCR产物进行酶切鉴定并进行胶回收，并且使用PCR纯化试剂盒进行产物纯化。纯化后的产物转化进E.coli JM109感受态细胞，将转化子稀释涂布在添加了氨苄青霉素的LB固体培养基上并筛选阳性转化子(使用菌落PCR的方法)。挑取菌落PCR正确的单菌落接种在添加了氨苄青霉素的液体LB培养基内培养8–12h，使用少量质粒提取试剂盒提取重组质粒，对该质粒进行测序分析，挑选正确的质粒命名为Ts-ERG20WW，并于-80℃冰箱保藏转化子。

实施例2重组热带假丝酵母的构建及发酵生产柠檬烯

将实施例1的重组质粒Ts-ERG20WW转化至实施例1构建的热带假丝酵母CU-200中，将获得的重组菌株GJR-tLS-04在YPD平板上划线培养，从固体平板上挑取单菌落转接到10mL YPD液体培养基中，200r/min，30℃培养1d左右，至OD

发酵过程中的生物量变化利用紫外-可见光分光光度计在600nm条件下的光吸收强度 OD600来表征，测量范围保持控制在0.2–0.8之间，菌体浓度过高时对其进行稀释再测定计算。发酵液中葡萄糖残余量通过SBA-90生物传感器来测定，测量范围在40-00mg/Dl之间，样品浓度过高时对其进行稀释再测定。

结果显示，ERG20WW酶突变体的过表达重组菌株的L-柠檬烯产量在细胞质、过氧化物酶体和线粒体中产量为125.31、7.33、2.58mg/L，使L-柠檬烯产量较未突变的对照菌株GJR-tLS-03(0.832mg/L)。说明本发明的技术方案对增强柠檬烯合成效果明显，并且合成前体物质的基因过表达有利于柠檬烯的合成。

实施例3重组热带假丝酵母在不同发酵条件下生产柠檬烯

具体实施方式同实施例2，以重组菌株GJR-tLS-04作为发酵微生物，区别在于，分别发酵时间和起始葡萄糖浓度。具体为：

发酵时间分别控制为：24h、48h、72h、96h、120h、144h。

发酵培养基中的起始葡萄糖浓度分别控制为：20g/L、40g/L、60g/L、80g/L、100g/L。

如图3所示，重组菌株GJR-tLS-04发酵120h的L-柠檬烯产量达100.22mg/L；相比于发酵24h的产量22.7mg/L，提高了354.54％。

如图4所示，重组菌株GJR-tLS-04在起始葡萄糖浓度为60g的培养基中发酵120h的L-柠檬烯产量达141.48mg/L；相比于浓度为20g时产量为100.22mg/L，提高了41.48％。

对比例不同重组热带假丝酵母生产柠檬烯

分别将按照实施例1的策略构建的如下重组菌作为对照菌株，按照实施例2的方法发酵，检测发酵过程的生物量和L-柠檬烯产量。

重组菌GJR-LS-01：在热带假丝酵母尿嘧啶(URA3)缺陷型菌株CU-200的基础上敲除了酰基辅酶A氧化酶基因POX5，整合表达SEQ ID NO.1所示的异源L-柠檬烯合酶基因LS。

重组菌GJR-tLS-01：在热带假丝酵母尿嘧啶(URA3)缺陷型菌株CU-200的基础上敲除了酰基辅酶A氧化酶基因POX5，整合表达SEQ ID NO.4所示的截短的异源L-柠檬烯合酶基因tLS。

重组菌GJR-tLS-03：在重组菌GJR-tLS-01的基础上表达了SEQ ID NO.1所示的法尼基焦磷酸合成酶基因ERG20。

重组菌GJR-tLS-04：在重组菌GJR-tLS-01的基础上表达了SEQ ID NO.3所示的法尼基焦磷酸合成酶突变体基因ERG20WW。

结果显示，重组菌GJR-LS-01的产量仅0.092mg/L；重组菌GJR-tLS-01的产量仅0.257mg/L；GJR-tLS-03产量为0.832mg/L；GJR-tLS-04产量为100.222mg/L。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种产L-柠檬烯的热带假丝酵母工程菌及其构建方法

<130> BAA220223A

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1056

<212> DNA

<213> Mentha spicata

<400> 1

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aagaacttga actacaacac ccccggcggt aagttgaaca gaggtttgtc tgttgtcgac 180

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ggaaacattg caattaatga ctccttcatg ttggaaggtg ccatttacgt cttgttgaag 420

aagcacttcc gtcaagatcc atactatgtc gacttgttgg acttgttcca cgaagtcacc 480

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ttggacaagt tctccttgga caagcactcg ttcattgtca ttttcaaaac cgcatactac 600

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<211> 2170

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<211> 351

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

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1 5 10 15

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20 25 30

Gln Glu Ala Ile Asp Trp Phe Val Lys Asn Leu Asn Tyr Asn Thr Pro

35 40 45

Gly Gly Lys Leu Asn Arg Gly Leu Ser Val Val Asp Thr Tyr Ala Ile

50 55 60

Leu Asn Asn Thr Thr Ala Asp Lys Leu Asn Asp Glu Gln Tyr Lys Lys

65 70 75 80

Val Ala Leu Leu Gly Trp Ser Ile Glu Leu Leu Gln Ala Tyr Trp Leu

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Val Ala Asp Asp Met Met Asp Gln Ser Lys Thr Arg Arg Gly Gln Lys

100 105 110

Cys Trp Tyr Leu Val Glu Gly Val Gly Asn Ile Ala Ile Trp Asp Ser

115 120 125

Phe Met Leu Glu Gly Ala Ile Tyr Val Leu Leu Lys Lys His Phe Arg

130 135 140

Gln Asp Pro Tyr Tyr Val Asp Leu Leu Asp Leu Phe His Glu Val Thr

145 150 155 160

Phe Gln Thr Glu Leu Gly Gln Leu Leu Asp Leu Val Thr Ala Asp Glu

165 170 175

Glu Val Val Asp Leu Asp Lys Phe Ser Leu Asp Lys His Ser Phe Ile

180 185 190

Val Ile Phe Lys Thr Ala Tyr Tyr Ser Phe Tyr Leu Pro Val Ala Leu

195 200 205

Ala Met Tyr Met Ser Gly Ile Ser Ser Glu Glu Asp Leu Lys Gln Val

210 215 220

Arg Asp Ile Leu Ile Pro Leu Gly Glu Tyr Phe Gln Ile Gln Asp Asp

225 230 235 240

Phe Leu Asp Cys Phe Gly Thr Pro Glu Gln Ile Gly Lys Ile Gly Thr

245 250 255

Asp Ile Lys Asp Asn Lys Cys Ser Trp Val Val Asn Gln Ala Leu Leu

260 265 270

His Ala Thr Pro Glu Gln Arg Lys Leu Leu Asp Asp Asn Tyr Gly Lys

275 280 285

Lys Asp Asp Glu Ser Glu Gln Arg Cys Lys Asp Leu Phe Lys Ser Met

290 295 300

Gly Ile Glu Lys Ile Tyr His Asp Tyr Glu Glu Ser Ile Val Ala Lys

305 310 315 320

Leu Arg Glu Gln Ile Asp Lys Val Asp Glu Ser Arg Gly Leu Lys Lys

325 330 335

Asp Val Leu Thr Ala Phe Leu Gly Lys Val Tyr Lys Arg Ser Lys

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<210> 4

<211> 1678

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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atgggatgtt aacttcattc aatccttgtt atctgattac aaggaagata agcatgttat 120

tagagcttct gaattggtta ccttggttaa gatggaattg gaaaaggaaa ctgatcaaat 180

tagacaattg gaattgattg atgatttgca aagaatgggt ttgtctgatc acttccaaaa 240

tgagttcaaa gaaattttgt cctccattta cttggatcac cactactaca agaacccatt 300

cccaaaggaa gaaagagatt tgtactccac ttccttggct ttcagattgt tgagagaaca 360

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tcaagctcaa ttccaagaag aattgaagga atccttcaga tggtggagaa acactggttt 780

tgttgaaaag ttgccatttg ctagagatag attggttgaa tgttacttct ggaacactgg 840

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gattactgtt attgatgata tttatgatgt ttatggtacc ttagaagagt tggagcaatt 960

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