一种免疫组化染色方法及装置

技术领域

本发明涉及免疫组化染色技术领域，具体涉及一种免疫组化染色方法及装置。

背景技术

免疫组化染色机在使用过程中必须要保证的技术条件是载玻片在染色过程中不干片产生非特异性背景；苏木素不过染干扰阳性样本显色；样本中心区样本空白等问题，此外，使用染色机对同一批次进行染色时，需要保证保证对玻片染色效果保持均一性，否则可能会对染色结果的准确性造成影响。

现有的染色方法在抗原修复结束后，水槽温度过高容易导致干片，在染色实验中，温度的不均一性，会使玻片的染色效果不均一、不稳定，使用空气泵对玻片进行清洗时也会导致玻片中心区样本被空气泵吸走，使得染色结果呈现中心空白的现象，对试剂进行吸取分配及混合时，试剂吸取精度不够，移液针清洗后存在纯水挂壁现象，对试剂产生污染稀释的负向影响。

有的现有技术采用在玻璃表面增加一个小塑料罩，为免疫反应提供一个封闭的孵育环境，防止试剂挥发，如莱卡的bond-max，这种方案对控温精度要求较高，否则仍然存在较大干片的可能。

市面上还有其他模仿手工染色方式研制的染色机，实验过程比较繁琐，需要对玻片进行多次转移，仪器结构比较复杂，试剂用量大。

发明内容

根据第一方面，在一实施例中，提供一种免疫组化染色方法，包括：

清洗高度计算步骤，将载有抗原修复后样本的玻片置于水槽中，使得所述玻片处于水浴中，计算玻片的最佳清洗高度，根据所述最佳清洗高度设定参数；

清洗步骤，包括控制移液臂，吸取试剂，分配到每张玻片上，待反应完成后，吸取清洗剂，根据所述设定参数对玻片进行清洗，获得免疫组化染色后的玻片。

根据第二方面，在一实施例中，提供一种免疫组化染色装置，包括：

清洗高度计算模块，将载有抗原修复后样本的玻片置于水槽中，使得所述玻片处于水浴中，计算玻片的最佳清洗高度，根据所述最佳清洗高度设定参数；

清洗模块，包括控制移液臂，吸取试剂，分配到每张玻片上，待反应完成后，吸取清洗剂，根据所述设定参数对玻片进行清洗，获得免疫组化染色后的玻片。

根据第三方面，在一实施例中，提供一种免疫组化染色装置，包括：

存储器，用于存储程序；

处理器，用于通过执行所述存储器存储的程序以实现如第一方面任一项所述的方法。

根据第四方面，在一实施例中，提供一种计算机可读存储介质，所述介质上存储有程序，所述程序能够被处理器执行以实现如第一方面任一项所述的方法。

依据上述实施例的一种免疫组化染色方法及装置，本发明有效避免干片，实验过程简单，试剂用量小。

附图说明

图1为控制染色机实现细胞染色的流程图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。

另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。

本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。

根据第一方面，在一实施例中，提供一种免疫组化染色方法，包括：

清洗高度计算步骤，将载有抗原修复后样本的玻片置于水槽中，使得所述玻片处于水浴中，计算玻片的最佳清洗高度，根据所述最佳清洗高度设定参数；

清洗步骤，包括控制移液臂，吸取试剂，分配到每张玻片上，待反应完成后，吸取清洗剂，根据所述设定参数对玻片进行清洗，获得免疫组化染色后的玻片。

在一实施例中，清洗步骤中，包括第一轮清洗、第二轮清洗、第三轮清洗、第四轮清洗、第五轮清洗、第六轮清洗、第七轮清洗、第八轮清洗。

在一实施例中，所述第七轮清洗包括：控制移液臂吸取染色剂，并分配到每张玻片上，完成一个反应水槽的玻片分配后，等待一定时间，然后根据所述设定参数，使用清洗剂对玻片进行清洗，采用同样的方法对其他水槽分配染色剂并进行清洗。

在一实施例中，所述一定时间为0.5～2s，优选为1s。

在一实施例中，所述染色剂包括苏木素。

在一实施例中，所述第七轮清洗所使用的清洗剂包含水。

在一实施例中，清洗高度计算步骤中，使得所述玻片的下表面处于水浴中，而上表面的样本区不浸入水浴中，然后计算玻片的最佳清洗高度。

在一实施例中，根据所述设定参数，控制移液臂对玻片进行清洗，获得免疫组化染色后的玻片。

在一实施例中，清洗步骤中，对于第二轮以及之后的每一轮清洗，每一轮清洗前，控制移液臂，吸取所需加入的试剂，分配到玻片上，等待所述试剂反应完成后，根据所述设定参数，使用清洗剂对玻片进行清洗。

在一实施例中，清洗步骤中，第二轮清洗前，加入的试剂为DS-A试剂。

在一实施例中，清洗步骤中，第三轮清洗前，加入的试剂为DS-B试剂。

在一实施例中，清洗步骤中，第四轮清洗前，加入的试剂为DS-C试剂。

在一实施例中，清洗步骤中，第五轮清洗前，加入的试剂为DAB试剂。

在一实施例中，所述DAB试剂包含DS-D和DS-E试剂。

在一实施例中，清洗步骤中，第六轮清洗前，加入的试剂为Fast-Red试剂。

在一实施例中，所述Fast-Red试剂包含DS-F和DS-G试剂。

在一实施例中，DAB试剂中，按体积计，DS-D：DS-E＝1：33，该比值记为d；

Fast-Red试剂中，按体积计，DS-F：DS-G＝1：50，该比值记为f；

DAB与Fast-Red所需试剂总量记为S；

DS-D液量＝[S×d]+1；

DS-E液量＝DS-D液量×33；

DS-F液量＝[S×f]+1；

DS-G液量＝DS-D液量×55。

液量即为对应试剂的体积。

通过上述计算方法，避免因计算得到值带小数类型的数据，从而因移液针在吸取液量分辨精度无法达到0.1级别导致的试剂混合配比不准的问题。

在一实施例中，所述第一轮至第六轮清洗所使用的清洗剂包含PBST。

在一实施例中，清洗步骤中，第八轮清洗前，加入的试剂为返蓝液。

在一实施例中，清洗步骤中，第八轮清洗所使用的清洗剂包含水。

在一实施例中，清洗步骤中，用于放置玻片的实验平台包含至少一个区域，对每个区域的玻片单独进行染色。

在一实施例中，清洗步骤中，所述区域为1～10个，优选为6个。

在一实施例中，清洗步骤中，移液臂在纯水中进行冲刷清洗时，缓慢抬升移液针。

根据第二方面，在一实施例中，提供一种免疫组化染色装置，包括：

清洗高度计算模块，将载有抗原修复后样本的玻片置于水槽中，使得所述玻片处于水浴中，计算玻片的最佳清洗高度，根据所述最佳清洗高度设定参数；

清洗模块，包括控制移液臂，吸取试剂，分配到每张玻片上，待反应完成后，吸取清洗剂，根据所述设定参数对玻片进行清洗，获得免疫组化染色后的玻片。

根据第三方面，在一实施例中，提供一种免疫组化染色装置，包括：

存储器，用于存储程序；

处理器，用于通过执行所述存储器存储的程序以实现如第一方面任一项所述的方法。

根据第四方面，在一实施例中，提供一种计算机可读存储介质，所述介质上存储有程序，所述程序能够被处理器执行以实现如第一方面任一项所述的方法。

在一实施例中，本发明提供一种基于现有染色机的染色方法，通过合适的染色流程方法使玻片不干片，染色效果稳定、均一。

在一实施例中，本发明利用现代控制软件技术实现染色实验自动化、染色实验结果稳定、样本区无空白、苏木素不过染等。

在一实施例中，本发明有效解决染色实验结果不均一、不稳定、样本中心区空白、苏木素过染、对反应条件要求苛刻等问题。

实施例1

图1为控制染色机实现细胞染色的流程图，控制方法具体如下：

(1)将制备好的样本玻片依次放入玻片架并置于仪器反应水槽中，在仪器设置界面中设置样本量、选中修复实验，进行抗原修复实验。

(2)仪器控制反应水槽加热组件使水槽温度升高到设置温度，并维持设置时间，随后自然冷却降温，降温完成后，自动打开反应水槽。

(3)将玻片架取出，用力甩干玻片上残留的修复液，使用疏水笔进行补画疏水圈，在玻片样本区滴加清洗液；待所有玻片处理完成后，点击仪器实验设置界面上的排水，控制仪器自动排干反应水槽中残留的修复液。

(4)排水完成后，将玻片依次放入反应水槽中。在仪器实验设置界面设置样本量，选中染色实验步骤，控制仪器开始进行染色实验。

(5)染色实验具体如下：

A.仪器在内部控制软件的的控制下，开始进行染色实验。首先控制仪器进行管路填充和移液针清洗等。

B.控制仪器的多针移液臂给所有有样本的水槽添加足量的纯水，使水槽内玻片处于一种水浴的状态。

C.控制多针移液臂，利用步进电机力矩控制技术，对玻片位置进行探测，计算出每张玻片的最佳清洗高度，以能够对玻片进行完全清洗并且不会吸走玻片样本区的样本。

D.第一轮清洗：控制仪器的多针移液臂，根据实验设定参数，用清洗液对玻片进行PBS T清洗。

E.第二轮清洗：第一轮清洗完成后，控制单针移液臂吸取DS-A试剂，并分配到每张玻片上，等待DS-A试剂反应完成后，进行第二轮PBST清洗。

F.第三轮清洗：第二轮清洗完成后，控制单针移液臂吸取DS-B试剂分配到玻片上，等待DS-B试剂反应完成后，进行第三轮PBST清洗。

G.第四轮清洗：第三轮清洗完成后，控制单针移液臂吸取DS-C试剂分配到玻片上，等待DS-C试剂反应完成后，进行第四轮PBST清洗。

H.配制DAB试剂：在第四轮清洗间隙时间，控制单针移液臂按照1：33的比例分别吸取足量的DS-D和DS-E试剂混合到DAB玻璃瓶成DAB试剂。

I.第五轮清洗：第四轮清洗完成后，控制单针移液臂吸取DAB试剂分配到玻片上，等待DAB试剂反应完成后进行第五轮清洗，具体地，先根据设定参数，使用纯水清洗玻片。纯水清洗完成后，继续使用PBST清洗一次。

J.第五轮清洗间隙，控制单针移液臂按照1：50的体积比例分别吸取足量的DS-F和DS-G试剂混合到Fast-Red玻璃瓶，制得Fast-Red试剂。

K.第六轮清洗：第五轮清洗完成后，控制单针移液臂吸取Fast-Red试剂分配到玻片上，等待Fast-Red试剂反应完成，使用纯水进行第六轮清洗。

L.第七轮清洗：第六轮清洗完成后，控制多针移液臂，给多针苏木素液路进行苏木素填充，随后控制多针给玻片分配苏木素，分配完成一个反应水槽后，等待1秒钟，立即使用纯水对玻片进行第七轮清洗，并依次执行所有水槽，每个水槽完成后，使用纯水对对应的其他水槽进行第七轮清洗。

M.第八轮清洗：第七轮清洗完成后，控制多针移液臂，给返蓝液(亦称返染液)管路填充返蓝液，随后控制多针给玻片分配返蓝液，等待返蓝液反应完成后，使用纯水进行第八轮清洗。

N.第八轮清洗完成后，控制仪器排空管路，复位所有运动轴，打开水槽盒盖，弹出实验完成界面。

(6)实验完成后，取出玻片，置于显微镜下观察细胞染色情况。

(7)实验通量控制方法如下：将实验平台划分为6个区域，可对每个区域进行单独实验操作。通量从1～30个玻片自由选择，玻片实验放置位置可在6个区域进行自由选择。

(8)单针移液臂清洗方法如下：单针移液臂在纯水中进行冲刷清洗时，缓慢抬升移液针避免移液针末端挂有水珠，从而在吸取试剂时污染稀释试剂。移液针抬升至单针尖端高于纯水液面。

(9)DAB与Fast-Red试剂配液方法：

DAB试剂配比DS-D：DS-E＝1：33＝d；

Fast-Red试剂配比DS-F：DS-G＝1：50＝f；

DAB与Fast-Red所需试剂总量S；

DS-D液量＝[S×d]+1；

DS-E液量＝DS-D液量×33；

DS-F液量＝[S×f]+1；

DS-G液量＝DS-D液量×55。

通过上述计算方法，避免因计算得到值带小数类型的数据，从而因移液针在吸取液量分辨精度无法达到0.1级别导致的试剂混合配比不准的问题。

本实施例中，各试剂的说明如下：

表1

表2

在一实施例中，本发明提供的细胞染色方法有效提高细胞染色效果稳定性。

在一实施例中，可通过其他清洗方式避免玻片样本区样本被清洗环节吸走的问题。

本领域技术人员可以理解，上述实施方式中各种方法的全部或部分功能可以通过硬件的方式实现，也可以通过计算机程序的方式实现。当上述实施方式中全部或部分功能通过计算机程序的方式实现时，该程序可以存储于一计算机可读存储介质中，存储介质可以包括：只读存储器、随机存储器、磁盘、光盘、硬盘等，通过计算机执行该程序以实现上述功能。例如，将程序存储在设备的存储器中，当通过处理器执行存储器中程序，即可实现上述全部或部分功能。另外，当上述实施方式中全部或部分功能通过计算机程序的方式实现时，该程序也可以存储在服务器、另一计算机、磁盘、光盘、闪存盘或移动硬盘等存储介质中，通过下载或复制保存到本地设备的存储器中，或对本地设备的系统进行版本更新，当通过处理器执行存储器中的程序时，即可实现上述实施方式中全部或部分功能。

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。