小麦耐碱生长素响应蛋白基因TaSAUR215及其应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及耐碱基因——小麦耐碱生长素响应蛋白基因TaSAUR215及其应用。

背景技术

土壤盐碱化严重影响农作物产量。特别是随着工业的发展，土壤盐碱化愈来愈严重，已成为一个全球关注的社会问题。我国人口众多，而土壤盐碱化更为严重，已经成为制约我国经济和社会发展的重要因素。因此，除了缓解土壤盐碱化以外，培育耐盐碱农作物新品种已成为当前一个十分迫切的任务。

利用转基因改良植物技术将新的性状转入高生物量植物中，以此开发高效的转基因植物新品种并用于在盐碱地种植，是一项具有广阔应用前景的技术。

利用基因工程技术开展植物耐碱方面研究已取得了较大的进展，克隆了大量相关基因，并将这些基因转入植物中，用于耐碱机制研究。一些实验表明，将植物本身以及其它生物中与耐碱相关的基因转入植物中，其异源转录和翻译产物可以使转基因植物的抗碱能力得到提高。

目前，已发现了一些能显著提高植物耐碱能力的基因，但检索发现小麦耐碱生长素响应蛋白基因TaSAUR215及其在作物中调控小麦耐碱性未见报道

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种耐碱基因——小麦耐碱生长素响应蛋白基因TaSAUR215及其应用。

本发明所述的小麦耐碱生长素响应蛋白基因TaSAUR215，其特征在于：所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了含上述基因TaSAUR215的植物表达载体，其特征在于：所述植物表达载体是pGA3426-TaSAUR215或pTCK303-TaSAUR215。

本发明的技术方案在于从小麦中分离得到小麦基因TaSAUR215，然后将该基因转化到普通小麦YM20中以实现研究TaSAUR215基因的功能以及植物的耐碱机理。

本发明所述小麦耐碱生长素响应蛋白基因TaSAUR215在培育抗碱植物中的应用。

本发明所述植物表达载体pGA3426-TaSAUR215或pTCK303-TaSAUR215在培育抗碱植物中的应用。

其中：所述植物优选是普通小麦。

将本发明所述基因小麦耐碱生长素响应蛋白基因TaSAUR215导入植物细胞，植物就可以获得碱胁迫的耐受能力。为了便于对转基因植物或细胞系进行筛选，可以对含有所述基因TaSAUR215的植物表达载体(pGA3426-TaSAUR215或pTCK303-TaSAUR215)进行加工，如可以加入选择标记(GUS等)或者具有抗性的抗生素标记物(潮霉素，卡那霉素，庆大霉素等)等。

事实上，任何一种可以将外源基因导入植物中表达的载体都可以应用，本发明优选的载体是pGA3426。

本发明提供了一种小麦耐碱生长素响应蛋白基因TaSAUR215，所述基因可广泛用于培育耐碱农作物品种。本发明的有益效果是：利用现有的植物基因工程技术，本发明克隆得到了小麦碱胁迫应答基因TaSAUR215，并通过根瘤农杆菌介导的方法将该基因过量表达于小麦，经过实验比较分析，TaSAUR215过表达促进了小麦对碱胁迫的抗性，证明转基因植株的耐碱能力明显提高。

附图说明

图1山融4号和济南177碱胁迫TaSAUR215的RT-PCR分析。

图2TaSAUR215转基因小麦表达量鉴定。

图3TaSAUR215转基因小麦碱胁迫下的表型。

其中：(A)TaSAUR215转基因小麦碱胁迫下的表型；(B)TaSAUR215-OE碱胁迫下的鲜重统计；(C)TaSAUR215-OE碱胁迫下与对照的相对鲜重；(D)TaSAUR215-RNAi碱胁迫下的鲜重统计；(E)TaSAUR215-RNAi碱胁迫下与对照的相对鲜重。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

下述实施例中，所使用的材料、试剂、载体、菌株等，如无特殊说明，均从商业途径得到。

实施例1、TaSAUR215的克隆

1.1提取小麦Total RNA

1.将组织材料与钢株放入2.0的EP管中，液氮速冻并用组织研磨机研磨成粉末；

2.待液氮挥发干，每100mg材料约加入1ml的Invitrogen公司的TRIzol提取液，融化后，用加样枪反复吸吹，剧烈振荡混匀样品，使样品充分裂解，室温放置5min；

3.加入0.2ml氯仿(chloroform)，剧烈振荡混匀15sec，室温放置10min；

4.4℃，12000rpm离心15min；

5.用移液器小心吸出上层水相，加入新的1.5ml的离心管中，加入500μl的异丙醇(1:1体积)，充分混匀，-20℃2沉淀30min或过夜；

6.4℃，12000rpm离心10min，小心弃去上清液；

7.RNA沉淀用1ml的75％乙醇洗涤。4℃，12000rpm离心10min收集沉淀；

8.重复用75％乙醇洗涤一次RNA沉淀；

9.去上清，RNA沉淀于无菌操作台上晾干约10-15分钟，RNA略显透明，加入适当体积(30-50μl)的RNase-free水充分溶解(可放于-80℃长期保存)；

10.紫外分光光度计及1％Agrose凝胶电泳检测RNA浓度及质量。

注：a)用紫外分光光度计检测RNA的产量，在260nm处的吸光度，1OD＝40μg/ml。根据在260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度2纯RNA的OD

b)用1％Agrose凝胶电泳检侧RNA的质量及大小。吸取1μl RNA加入3μl的RNase-free水，加1μl上样缓冲液65℃变性5min。电泳后用EB染色，另取3μl的1kb DNAMarker作为对照。

1.2cDNA反转录

反转录酶：M-MLV Reverse Transcriptase(Invitrogen)。

1.12μl体系：

2.65℃变性5min，迅速插入冰中，然后依次加入:

5×First-Strand Buffer 4μl

0.1M DTT 2μl

RNaseOUT(Invitrogen) 1μl

3.轻轻混匀，37℃反应2min；

4.加入1μl M-MLV RT，混匀，37℃反应50min；

5.70℃温育15min使M-MLV RT失活；

6.加入1μl RNase H(Invitrogen)，37℃反应20min；

7.用超纯水稀释至合适浓度。作为PCR模板。

1.3开放阅读框的克隆和序列测定

1.引物序列：根据测序结果，设计基因上下游引物(TaSAUR215-F、TaSAUR215-R)，扩增基因的开放阅读框。

TaSAUR215-F：5’-ATGGGGGAGCAAGGCAGGGC-3’

TaSAUR215-R：5’-TCATGTGCACAAGATCCCATG-3’

2.PCR反应体系(50μl)：

3.PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，55℃复性45sec，72℃延伸1.5min，循环35次；72℃延伸7min。

4.扩增片段回收后与pEASY-T1载体连接并转化大肠杆菌Trans1 T1，测序由青岛擎科公司完成。

1.4基因表达分析(RT-PCR和real-time PCR)

a.胁迫下RNA的提取

山融4号和济南177种子正常萌发，Hangload培养液培养至株高约10cm时(约2周时间)

开始施加碱性盐胁迫100mM NaHCO

b.反转录(RT)产生cDNA

反转录产生cDNA，方法同上。

c.PCR反应及电泳

1.以cDNA为模板，进行PCR反应。引物如下

TaSAUR215-RT-F:5’-GAGATGAGGAGGTTCGTCATC-3’

TaSAUR215-RT-R:5’-CTCCGAAGAGGAGTAGGAC-3’

2.PCR体系：

3.PCR程序：

95℃5min2 25～30cycles 95℃20sec2 57℃60sec2 72℃60sec；72℃7min.

根据内参Actin的扩增情况确定PCR的循环数，调整cDNA模板的加入量。

结果见图1。

实施例2、植物表达载体的构建(Ubi启动子)

2.1Ubi启动子植物表达载体的构建

利用植物表达载体pGA3426，选用KKKⅠ和HHKHⅢ分别对pGA3426和含有目的基因的pEASY-T1载体进行双酶切，分别回收载体大片段和目的基因小片段，用T

(1)质粒pGA3426空载体和pEASY-T1的KKKⅠ和HHKHⅢ双酶切

碱裂解法提取pGA3426空载体和pEASY-T1质粒，各取10μg酶切，酶切体系如下：

于30℃恒温水浴锅酶切2小时以上。双酶切后以1×TAE为电泳缓冲液，将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。在紫外透射仪下用洁净刀片切下pGA3426中11kb的载体大片段和pEASY-T1中大约0.4kb的目的基因条带，回收该条带。

(2)经酶切和脱磷的pGA3426载体片段(约11kb)和pEASY-T1双酶切回收片段(约0.4kb)以摩尔比1:4的比例进行16℃连接过夜。

(3)连接产物热激法转化大肠杆菌Trans1 T1感受态细胞，转化菌在含Kan 50μg/ml的LB固体平板上37℃培养16小时左右。

(4)重组子的鉴定

①质粒的PCR验证

挑取单菌落分别接种于5ml含Kan的LB液体培养基中37℃振荡培养过夜，碱变性法提取质粒，用基因特异引物(TaSAUR215-F，TaSAUR215-R)进行PCR扩增，引物如下：

TaSAUR215-F：5’-ATGGGGGAGCAAGGCAGGGC-3’

TaSAUR215-R：5’-TCATGTGCACAAGATCCCATG-3’

体系如下：

PCR反应条件如下：预变性94℃3min，35个循环为：94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，最后，72℃延伸10min。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

②质粒酶切鉴定

提质粒进行KKKⅠ和HHKHⅢ双酶切，酶切体系同上。

1％琼脂糖凝胶电泳，检测是否含有预期分子量大小的片段，验证载体的正确构建。

实施例3、农杆菌感受态的制备与转化

3.1农杆菌EHA105感受态的制备

(1)从YEP平板(含50μg/ml利福平)上挑取根癌农杆菌单菌落，接种于含50μg/ml利福平的YEP液体培养基中，200rpm/min，28℃培养过夜。

(2)取2ml过夜培养液接种于50ml含相同抗生素的YEP液体培养基中在相同条件下培养至OD

(3)菌液冰浴30min，4℃，5000rpm离心10min，收集菌体。

(4)将菌体重悬于冰浴的10ml 0.15mol/L的NaCl中，离心收集菌体。

(5)再悬浮于1ml 20mmol/L冰预冷的CaCl

3.2冻融法转化根癌农杆菌EHA105

(1)在室温下融化农杆菌感受态细胞，加入1μg表达载体质粒DNA，混匀后冰浴30min。

(2)置液氮速冻1min，迅速移至37℃保温3min。

(3)加入无抗生素的YEP 800μl，28℃震荡培养3小时。

(4)7000rpm离心30s收集菌体，涂于含50μg/ml利福平、50μg/ml Kan的YEP平板上，28℃倒置暗培养2-3天。

3.3菌体PCR鉴定。

实施例4、转基因功能验证－小麦转化及筛选

小麦转化

(1)挑选饱满的YM20种子，70％乙醇中浸泡5min，然后清洁剂(20％漂水(白猫，上海)，0.1％ Triton)洗涤10-15min，无菌水冲洗4次，并浸泡于无菌水中过夜，将泡发的YM20种子转移至垫有浸湿滤纸的无菌培养皿中暗培养3天。

(2)转化前一天，取2ml活化的农杆菌EHA105加到含相应抗生素的200ml YEP培养基中，过夜培养至OD

(3)离心收集菌体，并重悬于浸染液中，使OD

(4)采用茎尖法进行小麦转化，用解剖刀切开小麦嫩芽，暴露其生长点并浸泡在侵染液中抽真空15min并保持压力15min。

(5)待抽真空完毕后倒掉侵染液并沥干侵染液，将小麦幼苗平铺于垫有浸湿滤纸的无菌培养皿中暗培养3天。

(6)暗处理完成后将小麦幼芽转移到培养土中正常生长。

(7)将正常生长的小麦幼苗取叶片于填装钢株的2.0EP管中，采用CTAB法提取小麦全基因组DNA，并采用TaSAUR215特异性引物(UBI-F2TaSAUR215-R)鉴定小麦转基因事件。

UBI-F:5’-GCCCTGCCTTCATACGCT-3’

TaSAUR215-R:5’-TCATGTGCACAAGATCCCATG-3’

(8)提取小麦Total RNA并用TaSAUR215引物(TaSAUR215-RT-F、TaSAUR215-RT-R)鉴定转基因小麦植株表达量变化。

TaSAUR215-RT-F:5’-GAGATGAGGAGGTTCGTCATC-3’

TaSAUR215-RT-R:5’-CTCCGAAGAGGAGTAGGAC-3’

(9)将转基因小麦种子与对照YM20种子泡发过夜，平铺于浸湿的滤纸上，待种子萌发后转移到锥形瓶或花盆中。

(10)待部分锥形瓶中的TaSAUR215-OE、TaSAUR215-RNAi及YM20生长至一叶一心时施加100mM NaHCO

(11)将鲜重作为表型标准，正常生长时TaSAUR215-OE较YM20鲜重更高，TaSAUR215-RNAi鲜重低于YM20，而在100mM NaHCO

结果见图2、图3。