盐酸去亚甲基小檗碱在制备预防性治疗铜绿假单胞菌肺炎药物中的应用

技术领域：

本发明涉及生物医药领域，具体涉及盐酸去亚甲基小檗碱在制备预防或治疗铜绿假单胞菌肺炎的应用。

技术背景：

肺炎是指包括终末气道、肺泡腔在内的肺实质的急性炎症，其致病因素多为病原微生物、免疫损伤、理化因素、药物及过敏等，其中细菌性肺炎最为常见。铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa)又称绿脓杆菌，是一种革兰氏阴性菌。铜绿假单胞菌肺炎是因肺部感染铜绿假单胞菌引起的一类肺炎，是院内获得性肺炎(HAP)的首位发病原因，是当今医学界关注的一大焦点。

铜绿假单胞菌之所以成为医院内感染第一致病菌，一方面，该菌具有较强的耐受性和适应力，在潮湿环境、紫外线照射、甚至清洁剂和消毒液中均能存活；另一方面，住院患者大部分具有不同程度的免疫缺陷，使其容易感染铜绿假单胞菌。随着铜绿假单胞菌感染性逐渐增强，且患者一但感染，病情进展迅速，病死率高。因而各种广谱抗生素治疗应运而生，然而，铜绿假单胞菌对多种抗菌药物具有耐药性，包括酶促作用导致的抗生素失活、外排泵机制的改变、靶点突变和抗生素摄取减少。除此之外，铜绿假单胞菌感染机制复杂。因此，临床上需要寻找新的药物和探究新的机制来治疗铜绿假单胞菌引起的感染。

机体对病原体和自身改变的识别必须高效和高度特异，以协调适当的反应，同时将过度的炎症和自身免疫反应限制在正常的自身。黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)是天然免疫传感器的成员之一，它可以检测DNA的存在。一方面，AIM2是病原体的关键感受器，可检测病毒、细菌和寄生虫等胞内病原体生命周期中胞质内累积的外源DNA；另一方面，AIM2还可以检测受损DNA，以及胞质内DNA的异常存在，如核膜完整性丧失后释放到胞质内的基因组DNA。通过识别胞质中这些异常存在的DNA，AIM2被激活启动炎性小体的组装，炎性小体是一种固有免疫复合物，可导致凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和炎性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(caspase1)的激活。这触发了细胞因子IL-1β和IL-18的成熟和分泌。它还可以启动细胞焦亡，一种促炎症形式的细胞死亡。土拉热弗朗西丝菌(Francisella tularensis)和单核细胞增生李斯特氏菌(Lysteria monocytogenes)是第最先被鉴定为参与AIM2炎症体的活菌。到目前为止，许多细菌物种被发现可以激活AIM2，包括肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、霉菌(Mycobaterium)、嗜肺军团杆菌(Legionella pneumophila)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等，这些发现都引起了广泛的关注。本专利首次证明铜绿假单胞菌感染肺部，AIM2通过识别铜绿假单胞菌和自身肺组织损伤DNA，从而被激活，引起炎症因子的释放，因此AIM2可以作为治疗铜绿假单胞菌肺炎一个关键靶点。

盐酸去亚甲基小檗碱，如式(Ⅰ)所示。

盐酸去亚甲基小檗碱(式Ⅰ)的英文名为Demethyleneberberine Hydrochloride或Demethyleneberberine Chloride。本发明专利将它简称为DMB。式(Ⅰ)中的骨架结构为去亚甲基小檗碱，它是盐酸去亚甲基小檗碱的活性成份。国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)将式(Ⅰ)中的有机结构部分去亚甲基小檗碱命名9,10-dimethoxy-5,6-dihydroisoquinolino[2,1-b]isoquinolin-7-ium-2,3-diol，其中文名为9，10-二甲氧基-5，6-二氢异喹啉[2,1-b]异喹啉-7-鎓-2，3-二羟基。它的分子式：C19H18NO4+，分子量为：324.35。化学文摘号(CAS)为：25459-91-0。去亚甲基小檗碱可以与无机酸或有机酸形成多种盐，如氯化盐、硫酸盐、磷酸盐、溴化盐、碘化盐、枸橼酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐、苹果酸盐和琥珀酸盐等分子形式存在。

去亚甲基小檗碱存在于天然药用植物芸香科植物黄柏(Cortex PhellodendriChinensis)中，由于含量较低，相关活性研究很少。有报道认为它在体外对多种革兰阳性及阴性菌均具有抑菌作用，除此之外，还具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等药理活性。有研究表明小檗碱可以治疗由病毒、脂多糖、缺血再灌注以及酒精等引起的肺炎或急性肺损伤，但迄今为止，尚没有小檗碱或去亚甲基小檗碱对于细菌性肺炎体内治疗及其机制的研究。所以本研究首次采用盐酸去亚甲基小檗碱，探讨其是否可以通过抑制AIM2炎症小体的激活，从而缓解铜绿假单胞菌急性肺炎的症状。

发明内容：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种预防或治疗铜绿假单胞菌肺炎的化合物，特别是提供了如式(Ⅰ)所示的盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)作为预防或治疗铜绿假单胞菌肺炎药物的应用。

本发明通过建立铜绿假单胞菌肺炎模型，观察盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)对铜绿假单胞菌肺炎是否具有预防或治疗效果。研究结果表明，盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)对铜绿假单胞菌肺炎有预防性保护和治疗作用。

本发明所用盐酸去亚甲基四氢小檗碱产品采用常规化学与分离纯化制得。本实验室采用高效液相色谱(HPLC)分析检测，其纯度达99％以上，并经过化学法、质谱法和核磁共振法分析鉴定，表明本实验室所用的盐酸去亚甲基四氢小檗碱产品化学结构正确。此项研究表明盐酸去亚甲基四氢小檗碱其纯度和化学结构符合开展体内、体外生物学活性和药理作用研究要求。

本发明还涉及及含有作为活性成分的盐酸去亚甲基小檗碱和常规药物赋形剂或辅剂的药物组合物。通常本发明药物组合物含有0.1～95％重量的盐酸去亚甲基小檗碱。在单元剂型中本发明化合物一般含量为0.1～100mg。

本发明化合物的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明化合物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形式。

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔黏膜、皮肤、腹膜或直肠等。

本发明化合物或含有它的药物组合物的给药途径可为注射给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射和穴位注射等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂等。

本发明化合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

例如为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

例如为了将给药单元制成胶囊，将有效成份本发明化合物盐酸去亚甲基小檗碱与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。

例如，将本发明化合物盐酸去亚甲基小檗碱制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂、分散剂、渗透压调节剂、增溶剂和pH调节剂。如稀释可选用水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂、脂肪酸酯等。渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、甘油、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等；增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基β-环糊精等；pH调节剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等。如制备冻干粉针剂，还可以加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或香料等。这些辅料是本领域常用的。

本发明所用的无菌介质都可以通过本领域技术人员众所周知的标准技术制得。可将它们灭菌，例如通过经由细菌过虑器过滤、通过向组合物中加入灭菌剂、通过将组合物放射处理、或通过将组合物加热灭菌。还可以在临用前将它们制成无菌可注射介质。

为了达到用药目的，增加治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。当然用于实施本发明化合物的给药途径取决于疾病和需要治疗的部位。因为本发明化合物的药动学和药效学特征会有某种程度的不同，因此在组织中获得治疗浓度的最优选方法是逐渐增加剂量并监测临床效果。对于这样的逐渐增加治疗剂量，初始剂量将取决于给药途径。

对于任何特定患者，本发明化合物药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的治疗剂量可以有较大范围的变化。根据所治疗患者的病症，可能必须对剂量作出某些改变，并且在任何情况下，都由医师决定个体患者的合适剂量。

给药剂量是指不包括载体重量(当使用载体时)在内的化合物的重量。一般来讲，本发明中药学成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明化合物组合物中最后的制剂中所含有的实际药物剂量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的预防或治疗目的。可以是单一剂量形式给药或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药；这受限于给药医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用并调整剂量。

有益效果

1、本发明首次发现盐酸去亚甲基小檗碱可以预防或治疗铜绿假单胞菌肺炎，不仅增加了该化合物新的适应症，同时也为开发和研究治疗细菌性肺炎药物提供新的思路，某种程度上也为解决临床广谱抗生素不合理利用所导致的多重耐药性提供了新思路。

本发明以C57BL/6小鼠为动物模型，研究盐酸去亚甲基小檗碱对铜绿假单胞菌引起的肺炎模型具有预防和治疗的作用。盐酸去亚甲基小檗碱给药组分别给予100mg/kg、200mg/kg灌胃预防给药7天，模型组给予相同剂量的赋行剂灌胃7天，第7天盐酸去亚甲基小檗碱给药组和模型组分别给药和赋形剂1小时后，通过气管注射50ul铜绿假单胞菌混悬液，每只小鼠注射量为4x10

2、本发明通过PA-LPS诱导MH-S细胞模拟肺炎炎症模型，并通过DMB对PA-LPS诱导的MH-S细胞炎症进行治疗。通过qRT-PCR技术检测TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平以及试剂盒检测NO含量。

3、本发明通过PA-LPS诱导BEAS-2B细胞建立细胞水平氧化损伤模型，并通过DMB对PA-LPS诱导的BEAS-2B细胞损伤进行治疗，并通过DCFH-DA探针检测细胞ROS水平，利用流式细胞仪检测。

术语

DMB：盐酸去亚甲基小檗碱

MPO:髓过氧化物酶

MDA：丙二醛

GSH：谷胱甘肽

NO:一氧化氮

TNF-α：肿瘤坏死因子

IL-1β：白细胞介素-1β

IL-6：白细胞介素-6

COX-2:环氧合酶

iNOS:一氧化氮合酶

AIM2：黑色素瘤缺乏因子2

ASC：凋亡相关斑点样蛋白

Caspase1:胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1

IG:灌胃

附图说明

图1、DMB抑制铜绿假单胞菌生长；

图2、DMB抑制PA-LPS诱导BEAS-2B细胞产生的ROS，其中A为流式细胞结果，B为柱状图；

图3、DMB减轻PA-LPS诱导MH-S细胞产生的炎症反应(细胞因子的变化)；其中A为TNF-α、B为IL-1β、C为IL-6、D为NO；

图4铜绿假单胞菌肺炎模型构建；

图5DMB减轻铜绿假单胞菌诱导的小鼠肺肿胀程度；

图6铜绿假单胞菌诱导的小鼠肺组织形态变化；

其中A代表正常小鼠肺组织形态，B代表铜绿假单胞菌诱导的肺炎模型小鼠肺组织形态，C代表DMB 100mg/kg给药组小鼠肺组织形态，D代表DMB 200mg/kg给药组小鼠肺组织形态

图7铜绿假单胞菌诱导的小鼠肺组织病理形态变化

其中A、A1代表正常小鼠肺组织HE染色图，B、B1代表铜绿假单胞菌诱导的肺炎模型小鼠肺组织HE染色图，C、C1代表DMB 100mg/kg给药组小鼠肺组织HE染色图，D、D1代表DMB200mg/kg给药组小鼠肺组织HE染色图

图8DMB改善铜绿假单胞菌诱导的小鼠肺组织TNF-α(A)、IL-1β(B)和IL-6(C)的表达

图9DMB预防治疗铜绿假单胞菌诱导的小鼠肺炎模型肺组织MPO结果图

图10DMB预防治疗铜绿假单胞菌诱导的小鼠肺炎模型肺组织MDA结果图

图11DMB预防治疗铜绿假单胞菌诱导的小鼠肺炎模型肺组织GSH结果图

图12DMB预防治疗铜绿假单胞菌诱导的小鼠肺炎模型肺组织炎症因子蛋白免疫印迹结果图

其中A、A1代表TNF-α、IL-1β和IL-6炎症因子蛋白表达和量化图，B、B1代表COX-2和iNOS蛋白表达和量化图

图13DMB抑制铜绿假单胞菌诱导的小鼠肺炎模型中AIM2炎症小体的激活

其中A代表AIM2、ASC、Cleaved caspase1、mature IL-β的蛋白表达，B代表AIM2量化图，C代表ASC量化图，D代表Cleaved caspase1量化图，E代表mature IL-β量化图

附图中Model和control比较为#，DMB给药跟Model比是*，其中#或*为p<0.05,##或**为p<0.01，所述的数据由graphpad统计获得。

具体实施方式

下面的实施例可以帮助本领域的技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1.盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)对铜绿假单胞菌具有抑菌效果

方法：取出冻存的铜绿假单胞菌(ATCC27853)菌株，采用三区划线的方法将其接种到固体LB培养基上，37℃孵育过夜。第二天固体LB培养皿中形成菌落后，挑取单个菌落到20ml液体LB培养基中，置于恒温震荡孵育箱(37℃，220rpm)震荡孵育14-16小时。从细菌菌悬液中吸取200ul于20ml新的LB液体培养基中，继续置于恒温震荡孵育箱(37℃，220rpm)2.5-4小时，待其生长至对数期，以1x10

结果：如图1所示，DMB对铜绿假单胞菌的生长具有抑制作用，且最小抑菌浓度为2048μg/ml。

实施例2.盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)对PA-LPS诱导的BEAS-2B细胞氧化损伤具有保护作用。

方法：以BEAS-2B为研究对象，铜绿假单胞菌来源的脂多糖(PA-LPS)为诱导试剂，采用ROS探针法在细胞水平检测DMB对ROS的清除作用。将人肺支气管上皮细胞(BEAS-2B)接种于培养板中待其贴壁后取出，给予DMB(10uM、20uM)预处理2h后取出，再用PA-LPS(4ug/ml)处理细胞24h后会产生ROS对细胞造成氧化损伤。利用荧光探针DCFH-DA(50uM)与ROS结合产生荧光的性质，用流式细胞仪检测ROS的清除作用。

结果：用flowjo软件处理流式数据显示10uM和20uM DMB能显著抑制PA-LPS在BEAS-2B细胞中产生的ROS，结果如图2。

实施例3.DMB减轻PA-LPS诱导的MH-S细胞的炎症反应

方法：以MH-S为研究对象，PA-LPS为诱导试剂，采用RT-PCR法和试剂盒，从细胞水平检测DMB减轻铜绿假单胞菌来源的脂多糖PA-LPS(1ug/ml)诱导的炎症反应。将小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S)接种于培养板中待其贴壁后取出，给予含有DMB(5uM、10uM、20uM)的细胞培养液预处理2h后取出，再用PA-LPS(1ug/ml)处理细胞24h后取出，用qRT-PCR法检测TNF-α、IL-1β和IL-6炎症因子。采用试剂盒，检测培养液中细胞分泌一氧化氮(NO)含量。

结果：qRT-PCR法显示，DMB可缓解PA-LPS对MH-S细胞造成的炎症反应。NO试剂盒结果表明，DMB能抑制细胞在培养液中分泌的NO。结果如图3所示。

实施例4：制备铜绿假单胞菌悬液

方法：取出冻存的铜绿假单胞菌(ATCC27853)菌株，采用三区划线的方法将其接种到固体LB培养基上，37℃孵育过夜。第二天固体LB培养皿中形成菌落后，挑取单个菌落到20ml液体LB培养基中，置于恒温震荡孵育箱(37℃，220rpm)震荡孵育14-16小时。从细菌菌悬液中吸取200ul于20ml新的LB液体培养基中，继续置于恒温震荡孵育箱(37℃，220rpm)2.5-4小时，用液体LB培养基稀释该重悬液，在600nm波长测量OD值至0.5。取液体LB培养基分别梯度稀释滴定好的重悬液，将不同浓度菌悬液取100ul接种到固体培养基中，37℃孵育过夜。第二天形成菌落后，计数菌落数为1.7x10

实施例5：构建铜绿假单胞菌小鼠肺炎模型

方法：成年C57BL/6雄性小鼠，6-8周龄，体重20-22g，随机分为4组，每组6只。4组分别为正常对照组，模型组，DMB低剂量组(100mg/kg)、DMB高剂量组(200mg/kg)。给药组连续预防给药7天，每天一次，其余各组给予同体积赋形剂。第7天预防给药1小时后，除正常对照组外，其余各组动物使用2％异氟烷气体吸入麻醉小鼠，夹趾检测无反应。将小鼠固定，剖开颈部，钝性分离皮下组织和肌肉，暴露气管。抽取50ul细菌混悬液，刺入气管，随吸气注入肺内，保持小鼠直立位2分钟，逐层缝合肌肉层及皮肤，涂抹抗生素粉末，如图4所示。

实施例6：DMB对铜绿假单胞菌肺炎模型肺部病理改变具有保护作用

方法：铜绿假单胞菌肺炎模型结束6小时后，在异氟烷麻醉条件下对小鼠采取颈椎脱臼处死，称重，摘取肺组织，并在无菌生理盐水中漂洗干净，称重，并取不同小鼠左肺叶，以10％的中性福尔马林液固定24小时，行HE染色进行病理学检查。

结果：通过肺系数比、肺组织形态图以及HE染色结果表明，模型组与正常对照组相比，模型组小鼠肺组织肿胀明显，颜色暗红，炎症细胞浸润明显增加，盐酸去亚甲基小檗碱低剂量组(100mg/kg)和高剂量组(200mg/kg)与模型组相比，肺肿胀明显减小，轻度出血，炎症细胞浸润减少，且高剂量组与低剂量组相比，肺肿胀、出血和炎症细胞浸润减少更明显，如图5、6、7所示。

实施例7：DMB对铜绿假单胞菌肺炎模型肺组织炎症因子mRNA表达的影响

方法：铜绿假单胞菌肺炎模型结束6小时后，在异氟烷麻醉条件下对小鼠采取颈椎脱臼处死，摘取肺组织，准确称取不同小鼠同一位置肺组织15mg提取RNA，检测肺组织TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达变化。

结果：如图8所示，正常对照组与模型组相比，模型组肺组织TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达上调，而DMB低剂量组(100mg/kg)和高剂量组(200mg/kg)与模型组相比，肺组织TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达下调，且高剂量组与低剂量组相比，肺组织TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达下调更明显。

实施例8：DMB可降低铜绿假单胞菌肺炎小鼠的肺组织MPO水平。

方法:铜绿假单胞菌肺炎模型结束6小时后，在异氟烷麻醉条件下对小鼠采取颈椎脱臼处死，摘取肺组织，取不同小鼠同一位置肺组织，于冰浴上以生理盐水研磨制成10％的肺组织匀浆液，离心后取上清，按照南京建成试剂盒说明，测定肺组织中髓过氧化物酶MPO水平。

结果：MPO一般作为评价组织炎症程度的重要指标，其活力单位定义为每10％组织匀浆液在37℃的反应体系中分解1umol H

实施例9：DMB可降低铜绿假单胞菌肺炎小鼠的肺组织MDA水平。

方法：铜绿假单胞菌肺炎模型结束6小时后，在异氟烷麻醉条件下对小鼠采取颈椎脱臼处死，摘取肺组织，取不同小鼠同一位置肺组织，于冰浴上以生理盐水研磨制成10％的肺组织匀浆液，离心后取上清，按照南京建成试剂盒说明，测定肺组织组织中丙二醛MDA水平。

结果：MDA是机体内的氧自由基攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸形成的脂质过氧化物，测定MDA的量可反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映出细胞损伤的程度。与对照组相比，模型组小鼠肺组织中MDA水平升高，而DMB低剂量(100mg/kg)组和高剂量(200mg/kg)组与模型组相比，均能显著降低MDA。研究结果表明DMB具有降低MDA作用，能改善肺组织细胞的氧化损伤，如图10所示。

实施例10：DMB可降低铜绿假单胞菌肺炎小鼠的肺组织GSH水平。

方法：铜绿假单胞菌肺炎模型结束6小时后，在异氟烷麻醉条件下对小鼠采取颈椎脱臼处死，摘取肺组织，取不同小鼠同一位置肺组织，于冰浴上以生理盐水研磨制成10％的肺组织匀浆液，离心后取上清，按照南京建成试剂盒说明，测定肺组织中GSH水平。

结果：GSH具有抗氧化的作用，主要用来衡量氧化性损伤。铜绿假单胞菌肺炎在发生炎症反应的同时，往往也伴随着氧化性损伤。与对照组相比，模型组小鼠肺组织中GSH水平降低，说明铜绿假单胞菌诱导的肺炎小鼠肺组织的氧化损伤比较严重，而DMB高剂量(200mg/kg)组能显著升高肺组织GSH含量。研究结果表明DMB可升高铜绿假单胞菌肺炎小鼠GSH水平，具有抗氧化损伤的作用，如图11所示。

实施例11：DMB对铜绿假单胞菌肺炎模型小鼠肺组织炎症相关蛋白表达的影响

方法：铜绿假单胞菌肺炎模型结束6小时后，在异氟烷麻醉条件下对小鼠采取颈椎脱臼处死，摘取肺组织，取不同小鼠同一位置肺组织25mg提取蛋白，采用蛋白免疫印迹法，检测DMB对铜绿假单胞菌肺炎模型小鼠肺组织TNF-α、IL-1β、IL-6、及COX-2蛋白表达的影响。

结果：机体经外界刺激导致免疫失衡，从而大量释放TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子，从而进一步加重了炎症反应的程度。COX-2也称环氧合酶，是花生四烯酸合成的限速酶，其表达量在正常生理条件下较低，在病理条件下，参与炎症反应，表达量升高数倍。iNOS在组织损伤后可以诱导其大量表达。蛋白免疫印记法显示，与正常对照组相比，模型组中TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2和iNOS蛋白高表达，而DMB低剂量(100mg/kg)组和高剂量(200mg/kg)组，均能显著降低TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2和iNOS表达，从而减轻炎症反应。结果如图12所示。

实施例12：DMB对铜绿假单胞菌肺炎模型小鼠肺组织AIM2炎症小体相关蛋白表达的影响

方法：铜绿假单胞菌肺炎模型结束6小时后，在异氟烷麻醉条件下对小鼠采取颈椎脱臼处死，摘取肺组织，取不同小鼠同一位置肺组织25mg提取蛋白，采用蛋白免疫印迹法，检测DMB对铜绿假单胞菌肺炎模型小鼠肺组织AIM2、ASC、Cleaved caspase1、mature IL-β蛋白表达的影响。

结果：AIM2通过识别铜绿假单胞菌DNA和自身损伤DNA被激活，促进AIM2炎症小体的组装，从而进一步加重了炎症反应的程度。蛋白免疫印记法显示，与正常组相比，模型组AIM2、ASC、Cleaved caspase1、mature IL-β蛋白表达升高，而DMB低剂量(100mg/kg)组和高剂量(200mg/kg)组，均能显著降低AIM2、ASC、Cleaved caspase1、mature IL-β蛋白表达，从而抑制AIM2炎症小体的组装，从而缓解过度炎症反应和促炎形式的细胞死亡。结果如图13所示。