一种高比表面积聚离子液体载体的制备及其对漆酶的固定化

技术领域

本发明属于漆酶固定化技术领域，具体涉及一种高比表面积聚离子液体材料的制备及固定化漆酶的方法。

背景技术

漆酶(Lac,EC 1.10.3.2)属于蓝铜酶家族，广泛存在于真菌、植物、细菌和昆虫中，具有广泛的底物特异性和生态友好性，可在不同的工业领域发挥不同的作用。然而，漆酶存在容易失活、稳定性差、重复利用率低、成本高等缺陷，这在一定程度上限制了漆酶的工程化应用。

载体材料在溶液中形成的微环境会影响固定化酶的性能，它可能影响载体的物理性质和化学结构、酶与其载体的相互作用性质、结合位置以及键的数目。专利CN114045280A中公开了一种以磁性单宁酸-壳聚糖为载体共价固定化酶的方法，考察了不同pH、温度条件下酶的活性，并且在循环7次后仍能保留79％的相对酶活力。专利CN113980921 A中合成了一种离子液体修饰的复合材料，酶载量达到120mg/g，并将该固定化酶应用于酚类物质的吸附降解，其中，间苯二酚、2,4-二氯苯酚的降解吸附率超过90％，邻苯二酚的降解吸附率接近80％。载体有多种类型，目前载体研究主要集中在天然高分子载体、无机载体、金属有机框架载体合成聚合物载体等。

在过去的几十年里，以IL为基础的生物催化技术已经得到了广泛的研究。ILs在酶催化中发挥着越来越重要的作用，被认为是挥发性有机溶剂的“绿色”替代品。聚离子液体是一种新型的高分子电解质，在重复单元中含有IL结构，其阴离子或阳离子被限制在大分子的基质中。PIL有广泛的应用，包括热响应材料、碳材料、能量收集/生成，以及几种生物应用。然而，关于PIL材料在载酶方面的应用报道很少，这可能是因为PIL的制备方法如自由基聚合一般会导致产品孔隙分布不规则或比表面积低，不利于载酶。为了提高聚合物的比表面积，已有提高交联密度或引入多孔材料的研究，但事实上，制备具有高比表面积的聚合物仍然是一个挑战。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明旨在提供一种基于氨基功能化聚合离子液体微球的制备方法，所述聚合离子液体材料用于漆酶的固定化，通过限域聚合提高载体比表面积，改善固定化漆酶微环境，实现了漆酶的高固定化、催化活性及稳定性。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

氨基功能化聚合离子液体载体的制备，包括如下步骤：

(1)离子液体单体的制备

在氮气保护下，将一定量的氨基类化合物单体溶解于无水乙腈中，搅拌、加热。N-乙烯基咪唑溶于无水乙腈(30.0mL)中，逐滴加到氨基类化合物溶液中。回流，除去溶剂，用有机溶剂洗涤产物。将溶剂在真空下蒸发后，得到离子液体单体ILM。

(2)氨基功能化聚离子液体微球的制备

采用限域聚合制备PIL-NH

(3)漆酶的固定化

氨基功能化聚合离子液体微球PIL-NH

所述步骤(1)中，氨基类单体可以是溴乙胺氢溴酸盐、溴丙胺氢溴酸盐及溴丁胺氢溴酸盐，且加热温度在30-60℃之间，回流温度在40-80℃之间；

所述步骤(1)中，有机溶剂包括乙醇、甲醇、四氢呋喃、丙酮、乙醚、二氯甲烷中的一种或多种；

所述步骤(1)中，氨基类化合物与乙烯基咪唑用量的摩尔比在1:(0.8～2)之间，优选 1：(1～1.5)；

所述步骤(2)中，聚二乙烯基苯微球聚合温度为40-80℃之间，搅拌速率在120 -350r/min 之间，致孔剂为正己烷、正庚烷、液体石蜡、甲苯中的一种或多种，与单体用量的质量比为1：(0.5～5)，优选1：(1～3)；

所述步骤(2)中，溶胀所需溶剂为甲苯、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮中的一种或多种；

所述步骤(2)中，聚二乙烯基苯和ILM的摩尔比为10：(0.5～5)，优选10：(1～3)；

所述步骤(2)中，限域聚合温度控制在30-80℃之间，搅拌速率在100-400r/min之间，反应时间在12-24h之间；

所述步骤(3)中，交联剂戊二醛水溶液浓度为0.2-2％ωt，优选0.5-1％ωt，交联时间在1-6h之间，优选3-5h，交联温度在20-50℃之间，优选25-40℃；

所述步骤(3)中，载体PIL-NH

具体实施方式

以下对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，实际的实施方式并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。

实施例1：

(1)氨基功能化聚离子液体载体的制备：在氮气保护下，将2-溴乙胺氢溴酸盐20mmol 溶解于无水乙腈中，磁搅拌加热至75℃，再将1-乙烯基咪唑30mmol溶解于无水乙腈(30mL) 中，逐滴加入烧瓶中。回流12h后，洗涤后得到ILM-1，加入ILM-1、引发剂、甲苯至聚二乙烯基苯微球中充分溶胀12h，升温聚合得到PIL-NH

(2)漆酶的固定化：将漆酶溶解于pH＝3.0的缓冲液中(0.1mol/L)，分别配成2mg/mL 溶液。加入活化的PIL-NH

实施例2：

(1)氨基功能化聚离子液体载体的制备：在氮气保护下，将3-溴丙胺氢溴酸盐20mmol 溶解于无水乙腈中，磁搅拌加热至75℃，再将1-乙烯基咪唑30mmol溶解于无水乙腈(30mL) 中，逐滴加入烧瓶中。回流12h后，洗涤后得到ILM-2，加入ILM-2、引发剂、甲苯与DMF混合液至聚二乙烯基苯微球中充分溶胀12h，升温聚合得到PIL-NH

(2)漆酶的固定化：将漆酶溶解于pH＝3.0的缓冲液中(0.1mol/L)，配成1mg/mL溶液。加入活化的PIL-NH

实施例3：(1)氨基功能化聚离子液体载体的制备：在氮气保护下，将3-溴丙胺氢溴酸盐20mmol溶解于无水乙腈中，磁搅拌加热至75℃，再将1-乙烯基咪唑30mmol溶解于无水乙腈(30mL)中，逐滴加入烧瓶中。回流12h后，洗涤后得到ILM-1，加入ILM-1、引发剂、甲苯与DMF混合液至聚二乙烯基苯微球中充分溶胀12h，升温聚合得到PIL-NH

(2)漆酶的固定化：将漆酶溶解于pH＝3.0的缓冲液中(0.1mol/L)，配成3mg/mL溶液。加入活化的PIL-NH

实施例4：(1)氨基功能化聚离子液体载体的制备：在氮气保护下，将3-溴丙胺氢溴酸盐20mmol溶解于无水乙腈中，磁搅拌加热至75℃，再将1-乙烯基咪唑30mmol溶解于无水乙腈(30mL)中，逐滴加入烧瓶中。回流12h后，洗涤后得到ILM-2，加入ILM-2、引发剂、甲苯与DMF混合液至聚二乙烯基苯微球中充分溶胀12h，升温聚合得到PIL-NH

(2)漆酶的固定化：将漆酶溶解于pH＝4.0的缓冲液中(0.1mol/L)，配成1mg/mL溶液。加入活化的PIL-NH

实施例5：(1)氨基功能化聚离子液体载体的制备：在氮气保护下，将3-溴丙胺氢溴酸盐20mmol溶解于无水乙腈中，磁搅拌加热至75℃，再将1-乙烯基咪唑30mmol溶解于无水乙腈(30mL)中，逐滴加入烧瓶中。回流12h后，洗涤后得到ILM-2，加入ILM-2、引发剂、甲苯与DMF混合液至聚二乙烯基苯微球中充分溶胀12h，升温聚合得到PIL-NH

(2)漆酶的固定化：将漆酶溶解于pH＝3.0的缓冲液中(0.1mol/L)，配成3mg/mL溶液。加入活化的PIL-NH

对比例：传统自由基聚合制备氨基功能化聚离子液体，步骤如下：在氮气保护下，将一定量的二乙烯基苯，ILM-2和少量引发剂溶解在三口烧瓶中的水、乙醇混合液中。将混合物在搅拌下于70℃保持回流24h。通过过滤收集形成的交联聚合物载体PIL，并分别用四氢呋喃，丙酮和甲醇洗涤，然后，将固体干燥得到PIL’-NH

对实施例2及对比例所制备的氨基功能化载体进行比表面积分析，得到如下结果(表1)：

表1.两种实施例载体比较

从表1可以看出，采用限域聚合所得到的氨基功能化聚离子液体能够大幅提升载体比表面积，从而为实现酶的高负载量提供基础。

对实施例1～5及对比例制备得到的载体及固定化漆酶进行酶活力测试、固定化漆酶量测试、热稳定性及循环稳定性测试。具体测试方法如下：

(1)酶活性测试

以ABTS作为底物,420nm处测定漆酶吸光值。测定游离酶时，取2.9mL，0.5μmol/mL的ABTS底物，置于比色皿中，加入0.1mL，1mg/mL漆酶，在室温，pH＝3.0的条件下反应，以空白为参比，420nm处测定一段时间内吸光值。测定固定化酶时，将已经结合酶的载体(约20mg)，加入20mL，0.5μmol/mL的ABTS底物中，在室温，pH＝4.0的条件下反应，每隔3min离心，测定上清液在420nm处吸光值。

定义1单位的酶活力等于单位时间内(1min)吸光值改变0.001。

固定化酶的比活力和活力回收率用以下公式计算：

固定化酶比活力(IU/g)＝(△A)/(M×m×t)

式中△A为某一段时间内吸光度的改变；

M为固定化材料吸附酶的能力(mg/g)；

m为加入的固定化材料的质量(g)；

t为反应时间(min)。

回收率＝R

R

R

(2)固定化漆酶负载量测试

绘制BSA标准曲线：利用去离子水配置浓度为1～10μg/mL的BSA溶液，将4mL BSA与1mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂混合均匀，3min后利用酶标仪于595nm处测定吸光度值。以蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

考马斯亮蓝G-250染色法测定氨基功能化聚合离子液体对漆酶的固定化能力，由以下公式计算：

式中，q为PIL对漆酶的固定容量(mg/g)；

C

C为固定平衡时上清液中漆酶的浓度(μg/mL)；

V为固定溶液的体积(mL)；

m为PIL-NH

具体的测试计算结果如表2：

表2.各实施例酶负载量及相对活性

从表2结果可以看出，采用限域聚合所得到的氨基功能化聚离子液体载体具有更高的酶负载量。

(3)酸碱、温度稳定性测试

将实施例2及对比例所得固定化酶分别置于pH为2-6的缓冲溶液中(室温)孵育4h，按前述测试酶活方法，与游离漆酶相比得到相对酶活。

测试结果表明，固定化漆酶的钟形曲线较平缓，游离漆酶随着pH升高，活性下降明显，当pH为7时，游离漆酶相对活性为10％左右，PIL’-NH

将实施例2及对比例所得固定化酶分别置于pH为3，温度为30-60℃的缓冲溶液中1h，按前述测试酶活方法，与游离漆酶相比得到相对酶活。

测试结果表明，固定化酶温度稳定性更好，在40℃时，PIL-NH

(4)贮存、循环稳定性测试

将实施例2及对比例所得固定化酶置于pH为3的缓冲溶液中(0-4℃)，每隔几天取出，按前述测试酶活方法，检测漆酶活性。

测试结果表明，随着时间的延长，30天后，游离漆酶活性不到初始活性的30％，而PIL-NH

将实施例2及对比例所得固定化酶置于pH为3的缓冲溶液中(室温)，反应30min后离心，按前述测试酶活方法，取上清液测定酶活后洗涤，重复操作十次。

测试结果表明，固定化漆酶在循环使用8个批次以后，活性仍保持在80％以上，具有良好的循环使用性能。

以上说明描述本发明中的一个实施方式，不应将其看作为是对本发明权利要求保护范围的限制。在不脱离本发明原理和精神的情况下，任何修改、等效替换及改进，都应视为在本发明权利要求保护范围之内。