用于诊断乳腺癌化疗导致的心肌损伤的环状RNA标志物、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种诊断标志物，具体地说是一种用于诊断乳腺癌化疗心肌损伤的环状RNA标志物，以及由该环状RNA标志物制备得到的检测试剂盒，属于分子生物学技术领域。

背景技术

心血管疾病是导致乳腺癌幸存者死亡的主要原因之一。这些继发的心血管疾病大部分是由于癌症化疗药物的心脏毒性导致。临床试验数据表明，曲妥珠单抗利引起的心脏毒性发生率从4.1％到10％不等。蒽环类药物阿霉素是最早引入的化疗药物之一，目前仍是最常用、最有效的抗肿瘤药物之一。尽管靶向酪氨酸激酶和单克隆抗体疗法的出现，但仍然有40～50％的乳腺癌患者使用蒽环类药物，阿霉素的心脏毒性副作用已经被证实。即使在相对较低的200～250mg/m

迄今为止，临床上还不能准确预测和及时诊断出化疗是否会出现心肌损伤并发症。因此，探索如何早期识别化疗药物引起的心脏损伤具有重大意义。

circRNA是一种具有共价封闭结构的ncRNA，参与调控疾病的发生发展。circRNA由RNA聚合酶II转录，没有5’和3’末端和多聚腺嘌呤尾。circRNA有数百到数千个碱基长，主要由外显子组成。circRNA分子富含microRNA结合位点，在细胞中起到miRNA海绵(miRNAsponge)的作用，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平。此外，circRNA中高度保守的ORFs在体内和体外以独立于5'帽结构的方式编码功能肽，如诱导内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)、促进腺苷甲基化(N6-methylladenosine，m6A)和滚环扩增等。与线性RNA不同，circRNA具有特殊的环状共价键结构，这使它们对外切酶具有更高的耐受性。此外，circRNA具有保持性、丰富性和组织特异性，这使得circRNA可作为一些疾病发生发展过程中潜在的生物标志物。

综上所述，乳腺癌化疗心肌损伤的生物标志物一直是本领域是技术人员研究的热点，探索一种circRNA作为乳腺癌化疗心肌损伤标志物有助于对其早诊断、早治疗，有很好的临床意义。

发明内容

本发明所要解决的首要技术问题在于提供一种环状RNA标志物的应用，该环状RNA标志物在制备诊断、筛查、预后评估及区分乳腺癌化疗心肌损伤的物质中的新用途。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种用于检测环状RNA标志物的试剂盒，该试剂盒可以用于诊断、筛查、预后评估及区分乳腺癌化疗心肌损伤。

本发明所要解决的第三个技术问题在于提供一种检测环状RNA标志物的引物，该引物可以用于诊断、筛查、预后评估及区分乳腺癌化疗心肌损伤。

为实现上述技术目的，本发明采用以下的技术方案：

根据本发明实施例的第一方面，提供一种检测环状RNA标志物的物质的应用，包括下述应用中的一种或多种：

A1)在用于制备诊断乳腺癌化疗导致的心肌损伤的产品中的应用；

A2)在用于制备筛查乳腺癌化疗导致的心肌损伤的产品中的应用；

A3)在用于制备评估乳腺癌化疗导致的心肌损伤的风险产品中的应用；

A4)在用于制备乳腺癌化疗导致的心肌损伤的预后评估产品中的应用；

A5)在用于制备鉴别区分乳腺癌化疗导致的心肌损伤与其他疾病产品中的应用；

所述环状RNA标志物为hsa_circ_0003559，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

上述记载的“产品”可以为通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测hsa_circ_0003559表达水平以诊断乳腺癌化疗心肌损伤的产品。

上述应用中，hsa_circ_0003559环状RNA标志物在化疗引起的心脏损伤病人的血浆样本中表达显著上调；受试者工作特征(ROC)曲线显示hsa_circ_0003559具备良好的诊断化疗引起的心脏损伤的潜能；hsa_circ_0003559在多柔比星或曲妥珠单抗处理的人心肌细胞系(AC16)中表达上调。

其中较优地，所述物质为用于检测hsa_circ_0003559表达量，或特异性识别hsa_circ_0003559的试剂，或用于检测hsa_circ_0003559含量的试剂。

其中较优地，所述物质为用于检测hsa_circ_0003559的物质为下述a)、b)或c)

a)用于检测hsa_circ_0003559表达量的引物；或特异性识别hsa_circ_0003559的引物

b)含有所述a)的试剂组；

c)含有所述a)或所述b)的试剂盒。

其中较优地，所述引物为SEQ ID No.2所示的上游引物和SEQ ID No.3所示的下游引物。

根据本发明实施例的第二方面，提供一种检测环状RNA标志物的试剂盒，所述试剂盒包括下述应用中的一种或多种：

A1)在用于制备诊断乳腺癌化疗导致的心肌损伤的产品中的应用；

A2)在用于制备筛查乳腺癌化疗导致的心肌损伤的产品中的应用；

A3)在用于制备评估乳腺癌化疗导致的心肌损伤的风险产品中的应用；

A4)在用于制备乳腺癌化疗导致的心肌损伤的预后评估产品中的应用；

A5)在用于制备鉴别区分乳腺癌化疗导致的心肌损伤与其他疾病产品中的应用；

所述环状RNA标志物为hsa_circ_0003559，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述试剂盒包括用于检测hsa_circ_0003559表达量的试剂，或用于特异性识别hsa_circ_0003559的试剂。

利用本发明所提供的试剂盒，可以检测受检者外周血中SEQ ID NO.1所示环状RNAhsa_circ_0003559的表达情况，然后根据这些基因表达上调或下调的信息判别受检者乳腺癌化疗心肌损伤的概率，从而实现对乳腺癌化疗心肌损伤的诊断。

本发明所提供的试剂盒可包含适当的包装和说明书用于在本文所公开的方法中使用。本发明所提供的试剂盒为核酸检测试剂盒，包括RNA提取及实时荧光定量PCR(qRT-PCR)所需试剂。试剂盒还可进一步包含适当的缓冲液和聚合酶。这种试剂盒也可包含对照引物和/或探针。

其中较优地，所述用于检测或特异性识别hsa_circ_0003559的试剂为特异性引物，所述特异性引物为SEQ ID No.2所示的上游引物和SEQ ID No.3所示的下游引物。

根据本发明实施例的第三方面，提供一种用于检测环状RNA标志物的引物，所述引物包括下述应用中的一种或多种：

A1)在用于制备诊断乳腺癌化疗导致的心肌损伤的产品中的应用；

A2)在用于制备筛查乳腺癌化疗导致的心肌损伤的产品中的应用；

A3)在用于制备评估乳腺癌化疗导致的心肌损伤的风险产品中的应用；

A4)在用于制备乳腺癌化疗导致的心肌损伤的预后评估产品中的应用；

A5)在用于制备鉴别区分乳腺癌化疗导致的心肌损伤与其他疾病产品中的应用；

所述引物为检测hsa_circ_0003559表达量或特异性识别hsa_circ_0003559的引物；所述环状RNA标志物hsa_circ_0003559，的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

其中较优地，所述引物为SEQ ID No.2所示的上游引物和SEQ ID No.3所示的下游引物。

本发明具有以下的技术效果：

(1)本发明经临床验证，环状RNA hsa_circ_0003559可以作为乳腺癌化疗心肌损伤诊断的新标志物。RNA hsa_circ_0003559只有在乳腺癌进行化疗出现了心肌损伤的患者血浆中的表达量显著上调。其他类型心肌损伤或用化疗未出现心肌损伤的患者中，hsa_circ_0003559表达量不会上调，说明环状RNA hsa_circ_0003559为乳腺癌化疗心肌损伤新标志物。

(2)通过ROC曲线可以看出，hsa_circ_0003559具有良好的诊断效能，表明hsa_circ_000355作为新型诊断生物标志物具有良好的敏感度和特异性。

(3)hsa_circ_000355表达量与病人血浆CM-MB水平呈正相关关系，表明hsa_circ_0003559在血浆中的水平可反应疾病的严重程度。

(4)体外细胞学实验再次证明，在化疗药物多柔比星联合曲妥珠单抗诱导心肌损伤细胞中，hsa_circ_0003559的表达量显著升高，而在敲减了hsa_circ_0003559，心肌细胞的损伤有所逆转，这再一次提示了hsa_circ_0003559可能参与到了多柔比星联合曲妥珠单抗所诱导的心肌细胞损伤的过程中。

附图说明

图1A为由circRNA芯片和qRT-PCR筛选出的hsa_circ_0003559结构示意图；

图1B为circRNA芯片测定表达差异的circRNA富集火山图；

图2为使用hsa_circ_0003559引物对乳腺癌化疗病人和健康体检者血浆外泌体表达量检测的结果图；

图3为A组和B组为评价hsa_circ_0003559诊断乳腺癌化疗患者中是否出现心肌损伤的ROC曲线图；

图4为C组和D组血浆hsa_circ_0003559比较的ROC曲线图；

图5为B组和D组血浆hsa_circ_0003559比较的ROC曲线图；

图6为病人血浆CM-MB与hsa_circ_0003559表达量的关系；

图7为多柔比星和曲妥珠单抗处理和正常对照的AC16细胞上清液外泌体中hsa_circ_0003559的表达量；

图8为hsa_circ_0003559小干扰RNA(siRNA)在AC16转染敲降率的qRT-PCR验证图；

图9为敲降hsa_circ_0003559和对照组AC16经过多柔比星和曲妥珠单抗处理后的细胞上清液LDH浓度检测。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术内容进行详细具体的说明。

本发明首先入组80名在乳腺癌化疗期间出现心肌损伤患者，利用circRNA表达芯片分析：检测乳腺癌化疗心肌损伤患者血清和相应正常对照者的血清中circRNA表达谱的差异，筛选表达量具有显著性差异的circRNA，再利用qRT-PCR测定患者血浆中该circRNA芯片中表达显著升高的前10位circRNA的含量，取表达量显著升高的第一位circRNA进行后续实验。本发明再次利用体外细胞学实验进行标志物与乳腺癌化疗心肌损伤关系的验证，利用人心肌细胞系(AC16)加入多柔比星和曲妥珠单抗诱导心肌细胞损伤，并在对照组中加入等量的溶剂，利用qRT-PCR的方法检测细胞上清中hsa_circ_0003559的含量的变化。具体数据如下：

实施例1乳腺癌化疗心肌损伤环状RNA标志物的筛选及相关性研究

1.实验材料与方法

1.1临床样本：

收集解放军总医院2018～2021年肿瘤学部住院化疗(化疗药物包括多柔比星或曲妥珠单抗)期间出现心肌损伤证据(心肌酶谱改变+心电图/心脏超声)的80名患者静脉血。此外，根据化疗后心肌损伤标准，本发明将化疗后LVEF在基础上降低10％、心肌酶谱升高和心电图动态改变定义为化疗后心损，而在此基础上将入组患者分为以下4个组进行后续研究：

A组：未进行化疗的乳腺癌患者外周血血浆。

B组：进行化疗出现心脏损伤的乳腺癌患者外周血血浆。

C组：进行化疗无心肌损伤的乳腺癌患者外周血血浆

D组：乳腺癌未进行化疗但因其他原发病出现心脏损伤的患者外周血血浆

1.2血浆提取：

使用EDTA抗凝采血管采集人外周血，以2500g离心15min，取上层血浆至2m1无菌管，置于-80℃冰箱中冻存。

1.3RNA提取及实时荧光定量PCR(qRT-PCR)：

使用RNA simple Total RNA Kit(DP419，TIANGEN，Beijing，China)从AC16中提取总RNA。

1.3.1RNA提取

血浆样本按照TRIZOL Reagent(Invitrogen)说明书提取组织RNA。向血浆中加入1ml TRIZOL Reagent(Invitrogen)并加入氯仿200u1，振荡20s，室温静置10min：13000rpm，4℃离心15min。小心仔细吸取上清，加入异丙醇800u1，上下颠倒轻柔混匀，-20℃静置1h，13000rpm，4℃离心15min，弃除上清。加入1ml 75％乙醇，轻轻洗涤沉淀，4℃离心13000rpm5min后去除上清，吹干。加入适量无酶水，65℃促溶10min检测RNA的OD值及浓度，-80℃保存备用。

1.3.2RNA逆转录合成cDNA

使用逆转录试剂盒(Takara RR037A)，将500ng的RNA逆转录为CDNA。

(1)circRNA的逆转录：

冰上操作，每个反应体系20u1，如下表：

表1

(2)mRNA的逆转录：

冰上操作，每个反应体系20u1，如下表：

表2

反应程序为：37℃45min，85℃5min，4℃维持。

1.3.3qRT-PCR

根据circRNAs引物设计原则设计circRNAs引物序列。

将逆转录反应得到的cDNA，按照1:10稀释，进行如下qRT-PCR反应

(1)冰上操作，每个反应体系20u1，如下表：

表3

(2)反应液混匀Real-time PCR仪反应程序如下：

Stage 1:95℃2min；

Stage 2:Cycle 35，94℃5s，60℃1min；

Stage 3:95℃15s，60℃1min，95℃15s。

用GAPDH定量各mRNA的相对水平，并以相对比率表达。

1.4circRNA表达芯片分析：

使用SBC公司的SurePrint G3 Human circRNA Array检测乳腺癌化疗心肌损伤患者血清和相应正常对照者的血清中circRNA表达谱的差异,并使用利用Agilent GeneSpring软件对芯片结果进行分析,筛选表达量具有显著性差异(Fold chang≥2.0,P值<0.05)的circRNA，再利用qRT-PCR测定患者血浆中该circRNA芯片中表达显著升高的前10位circRNA的含量，取表达量显著升高的第一位circRNA进行后续实验。

表4前10位circRNA

1.5统计分析：

对正态变量采用t检验和方差分析，对非正态变量采用Mann Whitney U检验和Kruskal Wallis检验。采用R软件(v 3.4.2)和GraphPad Prism软件(v 8.00)进行统计分析。生物学重复显示为单个数据点叠加在柱状图上。P<0.05认为有显著性差异。

2.实验结果：

图1A为由circRNA芯片和qRT-PCR实验筛选的hsa_circ_0003559结构示意图。结合表4及图1B显示，图1B为circRNA芯片测定表达差异的circRNA富集火山图。提示了病理状态下患者血清circRNA发生了显著性变化，发生显著性上调或下调的circRNA可能与疾病的发生发展有关，其中发生显著性上调的circRNA有望进一步研究作为疾病诊断生物标志物。

图2为使用hsa_circ_0003559引物对4组乳腺癌化疗病人和健康体检者血浆表达量检测的结果图。从图中可见，B组患者血浆中hsa_circ_0003559表达显著高于其他组患者。这结果表明了只有在进行化疗出现了心肌损伤的患者血浆中hsa_circ_0003559的表达上调，而在其他类型心损和用化疗未出现心损的患者中，hsa_circ_0003559的表达不会上调，表明hsa_circ_0003559可能有作为化疗损伤心肌的特异性生物标志物。

如图3、图4和图5所示，hsa_circ_0003559诊断乳腺癌化疗患者A组与B组、B组与C组、B组与D组相比AUC曲线下面积分别为0.9138、0.9375和0.9400，表明其有良好的诊断效能。这些数据表明了hsa_circ_000355作为新型诊断生物标志物具有良好的敏感度和特异性。

如图6所示，hsa_circ_0003559表达量与血浆CM-MB水平呈正相关关系，表明其表达量与心肌受损程度相关。CK-MB是心肌细胞受损的标志性蛋白，hsa_circ_0031446与CK-MB水平呈正相关。这些结果表，hsa_circ_0003559在血浆中的水平可反应疾病的严重程度。

实施例2体外实验细胞水平验证hsa_circ_0031446与乳腺癌化疗心肌损伤之间的

1.材料和方法：

1.1细胞培养：

人心肌细胞系(AC16)购自武汉普诺赛，细胞培养在RPMI-1640培养基+10％胎牛血清中，培养在37度5％二氧化碳敷箱中。

多柔比星和曲妥珠单抗诱导心肌细胞损伤：

在细胞汇合度达到80％左右时，想培养基中加入1um多柔比星和10ng/ml曲妥珠单抗，并在对照组中加入等量的溶剂，处理24h后利用qRT-PCR的方法检测细胞上清中hsa_circ_0003559的含量。

qRT-PCR的方法同实施例1。

1.2LDH浓度检测：

采用LDH释放检测试剂盒(C0016，Beyotime，Shanghai，China)，按说明书检测细胞的细胞毒性。每孔加入60微升LDH检测工作液。样品在室温(约25℃)黑暗中孵育30分钟。然后在490nm处测定吸光度。

1.3siRNA敲减：

siRNA订购自Thermo Fisher公司，根据说明书，在细胞汇合度达70％加入，诱导24h之后qRT-PCR测定敲减效果。

1.4qRT-PCR方法同实施例1。

2.实验结果：

如图7所示，为了在细胞水平上验证化疗药物损伤心肌细胞后hsa_circ_0003559水平升高，我们选取了乳腺癌经典化疗药物多柔比星联合曲妥珠单抗处理AC16 24h后，用qRT-PCR检测细胞上清液hsa_circ_0003559的含量，发现hsa_circ_0003559的表达量显著升高，这表明了心肌细胞在损伤后会向上清液中释放hsa_circ_0003559。

如图8所示，再hsa_circ_0003559小干扰RNA(siRNA)AC16转染敲降后hsa_circ_0003559表达降低而mRNA总量变化无显著性差异。表明转染成功，后续实验在此基础上完成。

如图9所示，敲降hsa_circ_0003559和对照组AC16相比，敲低组经过多柔比星和曲妥珠单抗处理后的细胞上清液LDH浓度更低。LDH浓度是心肌细胞损伤的标志性蛋白，而在敲减了hsa_circ_0003559，心肌细胞的损伤有所逆转，这提示了hsa_circ_0003559可能参与到了多柔比星联合曲妥珠单抗所诱导的心肌细胞损伤的过程中。

上述实施例1和实施例2的结果表明hsa_circ_0003559在乳腺癌化疗心肌损伤病人血浆中表达上调；ROC曲线显示cire-具备良好的诊断能力；体外实验显示hsa_circ_0003559的敲减减轻了化疗药物对心肌细胞的损伤，表明多柔比星和曲妥珠单抗可能通过hsa_circ_0003559加重了对心肌细胞的损伤作用。综上所述，hsa_circ_0003559有望成为一种新的乳腺癌化疗致心肌损伤诊断生物标志物和治疗靶点。

实施例4本发明涉及到的序列、引物及试剂盒组成

本发明所述的乳腺癌化疗心肌损伤环状标志物hsa_circ_0003559序列为SEQ IDNo.1所示，

SEQ ID No.1：XYLT1基因的第3个外显子反向剪接形成GATGGCTACTTTTCTCATCGGCCGAAAGAGAAAGTGCGAACAGACAGCAACAACGAGAACTCTGTCCCCAAAGACTTTGAGAATGTCGACAACAGCAACTTCGCACCCAGGACTCAAAAGCAGAAGCACCAGCCTGAGTTGGCGAAGAAGCCACCGAGTAGACAGAAGGAGCTTTTGAAAAGGAAGCTGGAACAGCAGGAGAAAGGAAAAGGACATACATTCCCTGGGAAAGGCCCCGGTGAGGTGCTGCCTCCCGGGGACAGAGCCGCAGCCAACAGCAGCCACGGGAAGGATGTGTCCAGACCGCCTCATGCCAGGAAAACTGGGGGCAGCTCCCCCGAGACCAAGTATGACCAGCCCCCTAAGTGTGACATCTCAGGCAAGGAGGCCATCTCTGCCCTGTCCCGTGCTAAGTCCAAGCACTGCCGCCAGGAGATTGGGGAGACTTACTGCCGCCACAAGTTAGGGCTGCTGATGCCTGAGAAGGTGACTCGGTTCTGCCCCCTCGAGG

本发明提供的特异性识别hsa_circ_0003559的引物对，包括上游引物为SEQ IDNo.2所示，下游引物为SEQ ID No.3所示：

SEQ ID No.2：TACTGCCGCCACAAGTTAGG

SEQ ID No.3：GGGGACAGAGTTCTCGTTGT

本发明所提供的试剂盒的具体组成：

5xPrimeScript Buffer、PrimeScriptRT Enzyme Mix I、Random 6 mers、OligodT Primer、RNase-free H20、SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2x)、PCRPrimer(F+R)(10uM)、ROX Reference Dye(50x)。