检测油酸的物质在制备肿瘤辅助诊断产品中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域。更具体地，涉及检测油酸的物质在制备肿瘤辅助诊断产品中的应用。

背景技术

肿瘤是由于控制细胞生长增殖的机制失常而引起的疾病。目前常用的肿瘤诊断方式包括影像检查、X线检查、核磁共震、超声波、内窥镜检查以及病理切片检查等。而上述检查虽能确定肿瘤的发生，但并不便于对肿瘤的增殖状况等进行判断。因此，寻找肿瘤标志物对于肿瘤的早期诊断、发展监测或预后判断等具有重要意义。

肿瘤细胞中脂肪酸的合成增加有利于满足细胞快速增殖时对脂质的需求，也有研究表明以脂肪酸代谢为靶点可能是肿瘤治疗的一种有效方法。油酸(Oleic acid，OA)为18碳-9-烯酸的长链单不饱和脂肪酸，被认为是具有较高营养价值的一种脂肪酸。现有研究表明油酸具有抗癌作用，有助于免疫调节，可用于治疗和预防不同类型的疾病，如心血管或自身免疫性疾病、代谢紊乱，对皮肤损伤和乳腺癌有积极的作用。此外，也有报道称油酸具有神经元细胞保护活性，可用于预防或治疗感觉神经功能紊乱。但目前尚未有关于油酸与肿瘤有关的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供检测油酸的产品在制备肿瘤辅助诊断产品中的应用。

本发明的第一个目的是提供检测油酸的产品在制备肿瘤辅助诊断产品中的应用。

本发明的第二个目的是提供检测油酸的产品在制备肿瘤细胞增殖检测产品中的应用。

本发明的第三个目的是提供检测油酸的产品在制备肿瘤细胞老化检测产品中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种肿瘤辅助诊断产品。

本发明的第五个目的是提供一种肿瘤细胞增殖检测产品。

本发明的第六个目的是提供一种肿瘤细胞老化检测产品。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明利用代谢流技术及相关分子生物学实验工具，发现油酸参与沉默肉毒碱棕榈酰基转移酶1C(CPT1C)所致的肿瘤细胞老化。进一步利用BrdU细胞增殖实验、细胞集落形成实验和β-gal细胞衰老实验，证实了油酸可促进肿瘤细胞增殖并逆转沉默CPT1C所致的肿瘤细胞老化，即可通过检测油酸对肿瘤进行辅助诊断。

因此，本发明申请保护检测油酸的产品的以下应用：

本发明申请保护检测油酸的产品在制备肿瘤辅助诊断产品中的应用。

本发明申请保护检测油酸的产品在制备肿瘤细胞增殖检测产品中的应用。

本发明申请保护检测油酸的产品在制备肿瘤细胞老化检测产品中的应用。

具体地，所述检测油酸的产品为检测油酸含量的产品；包含检测油酸含量所需的试剂。

具体地，所述肿瘤为人乳腺癌或人胰腺癌。

具体地，所述肿瘤细胞为人乳腺癌细胞株MDA-MB-231或人胰腺癌细胞株PANC-1。

本发明还提供了一种肿瘤辅助诊断产品，所述产品中含有检测油酸含量的试剂。

具体地，所述产品为人乳腺癌或人胰腺癌辅助诊断产品。

本发明还提供了一种肿瘤细胞增殖检测产品，所述产品中含有检测油酸含量的试剂。

本发明还提供了一种肿瘤细胞老化检测产品，所述产品中含有检测油酸含量的试剂。

具体地，所述肿瘤细胞为人乳腺癌或人胰腺癌细胞。

具体地，所述肿瘤细胞为人乳腺癌细胞株MDA-MB-231或人胰腺癌细胞株PANC-1。

本发明具有以下有益效果：

本发明发现油酸可以促进肿瘤细胞增殖并逆转由沉默肉毒碱棕榈酰基转移酶1C(CPT1C)所致的肿瘤细胞老化。在此基础上，本发明提供了检测油酸的物质在制备肿瘤辅助诊断、肿瘤细胞增殖检测和肿瘤细胞老化检测产品中的应用，为肿瘤的辅助诊断提供了新的方法。

附图说明

图1为沉默CPT1C对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231中外源性脂肪酸合成代谢的影响结果；其中，图A为MDA-MB-231细胞中几种长链脂肪酸的表达量检测结果；图B为BSA共轭[U-

图2为沉默CPT1C对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231内源性脂肪酸合成代谢的影响结果；其中，图A为[U-

图3为沉默CPT1C对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231脂肪酸代谢相关酶基因和蛋白水平的影响；其中，图A为MDA-MB-231细胞中葡萄糖代谢相关酶的mRNA表达量检测结果；图B为MDA-MB-231细胞中脂肪酸代谢相关酶的mRNA表达量检测结果；图C为MDA-MB-231细胞中苹果酸酶各亚型的蛋白表达量检测结果；图D为MDA-MB-231细胞中脂肪酸代谢相关酶的蛋白表达量检测结果。

图4为油酸对沉默CPT1C的人乳腺癌细胞株MDA-MB-231增殖及老化的影响结果；其中，图A为不同浓度梯度的BSA共轭油酸和BSA培养MDA-MB-231细胞的存活率结果；图B为BSA共轭油酸和BSA培养MDA-MB-231细胞的增殖结果；图C为BSA共轭油酸和BSA培养MDA-MB-231细胞的集落形成结果；图D为BSA共轭油酸和BSA培养MDA-MB-231细胞的衰老相关β-gal染色结果；图E为BSA共轭油酸和BSA培养MDA-MB-231细胞的衰老相关β-gal定量结果。

图5为油酸对沉默CPT1C的人胰腺癌细胞株PANC-1增殖及老化的影响结果；其中，图A为不同浓度梯度的BSA共轭油酸和BSA培养PANC-1细胞的存活率结果；图B为BSA共轭油酸和BSA培养PANC-1细胞的增殖结果；图C为BSA共轭油酸和BSA培养PANC-1细胞的集落形成结果；图D为BSA共轭油酸和BSA培养PANC-1细胞的衰老相关β-gal染色结果；图E为BSA共轭油酸和BSA培养PANC-1细胞的衰老相关β-gal定量结果。

注：siRNA CPT1C为干扰CPT1C表达的小RNA；图中*和#代表差异显著；图1～3中，与空白转染组相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，#p＜0.0001；图4～5中，与空白转染并给予对照溶剂组相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；与转染siRNA CPT1C转染并给予对照溶剂组相比，#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.001。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

本发明实验数据均以mean±S.E.M.表示，采用Graphpad Prism 8软件进行统计分析；采用unpaired Student’s t test或One-way ANOVA进行两组或多组间比较，p<0.05被认为有显著性差异。

实施例1沉默CPT1C对肿瘤细胞外源性和内源性脂肪酸合成代谢的影响

1、实验方法

本发明所用肿瘤细胞为人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和人胰腺癌细胞株PANC-1，均由广州赛库生物技术有限公司进行细胞株品系鉴定。

(1)细胞的培养与转染：用含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养基培养两株肿瘤细胞(人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和人胰腺癌细胞株PANC-1)，进行传代。用Lipofectamine2000转染试剂转染siRNA CPT1C构建低表达CPT1C的细胞株。

转染6孔板细胞按照每孔250μLOpti-MEM培养基与5μL siRNA CPT1C或siControl储备液混匀，同时按照每孔250μLOpti-MEM培养基与5μLLipofectamine 2000转染试剂混匀。室温孵育5min后，将250μLLipofectamine2000工作液和250μL siRNA CPT1C或siControl工作液混匀，室温下孵育10min。预先从6孔板每孔吸出500μL培养基，然后从培养孔的不同位置逐滴加入上述混合溶液，每孔各500μL，混匀，培养板置于培养箱中继续培养。

转染96孔板细胞按照每孔25μLOpti-MEM培养基与0.25μL siRNA CPT1C或siControl储备液混匀，同时按照每孔25μLOpti-MEM培养基与0.25μLLipofectamine 2000转染试剂混匀。室温孵育5min后，将25μLLipofectamine 2000工作液和25μLsiRNA CPT1C或siControl工作液混匀，室温下孵育10min。预先从96孔板每孔吸出50μL培养基，然后加入上述混合溶液，每孔各50μL，混匀，培养板置于培养箱中继续培养。

(2)分别以BSA共轭[U-

2、实验结果

沉默CPT1C对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231中外源性脂肪酸合成代谢的影响结果如图1所示。其中，图1A为MDA-MB-231细胞中几种长链脂肪酸的表达量检测结果；图1B为BSA共轭[U-

沉默CPT1C对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231内源性脂肪酸合成代谢的影响结果如图2所示。其中，图2A为[U-

实施例2沉默CPT1C对肿瘤细胞脂肪酸代谢相关酶基因和蛋白水平的影响

1、实验方法

(1)细胞的培养与转染等实验同实施例1。

(2)RT-qPCR检测相关代谢酶的mRNA表达量

按照Trizol试剂的说明书从培养细胞中得到总RNA，微量紫外分光光度计检测RNA纯度和浓度后，参照RT-PCR试剂盒说明书去除基因组DNA反应并逆转成cDNA。反转录结束后，按照RT-qPCR试剂盒说明书进行Real-time PCR反应，检测内参基因及目的基因的表达量，内参基因ACTB和目的基因的引物序列如表1所示：

表1

Real-time PCR反应体系为：10μL SYBR Premix Ex Taq(2×)，2.0μL cDNA，0.8μLPrimer F(10μM)，0.8μL Primer R(10μM)，0.4μLROX reference dyeⅡ(50×)和6μLDEPC水，根据正交上样法在八连管上依次加样。

Real-time PCR反应程序为：95℃，30s；95℃，5s；60℃，34s(40个循环)；95℃，15s；65℃，60s；95℃，15s。以ACTB基因为内参，采用相对Ct值(ΔΔCt)法，即将各样本目的基因的Ct值减去内参ACTB基因的Ct值计算得到各自的ΔCt值，再将处理组ΔCt值减去对照组ΔCt值得ΔΔCt，计算2

(3)Western-blot检测相关代谢酶的蛋白表达量

使用RIPA裂解液提取细胞蛋白，利用超声破碎仪在冰上对样品进行超声处理，4℃、16000g条件下离心20min，离心后上清液即为蛋白样本。根据BCA蛋白定量试剂盒说明书测定上清液蛋白的浓度，以PBS稀释至统一浓度，并按照蛋白上清：5×loading buffer体积比为4:1加入相应的5×loading buffer，混匀离心，在100℃下变性10min，样本存于-80℃冰箱，或冰上放置以便后续蛋白上样。按照每孔上样总蛋白量为20μg进行SDS-PAGE电泳，同时在两端的上样孔内加入3～4μL的ladder maker。

电泳结束后根据目的蛋白的分子量裁切出玻璃胶板上相应位置的凝胶，平行移至滤纸上，并裁剪大小一致的PVDF膜，做好标记，在甲醇中活化数秒，反向倒扣于胶上，注意避免产生气泡。夹紧电极板，按照膜向正极胶向负极放入电泳槽中，槽内倒入新鲜的SDS-PAGE1×电转液，并放入冰袋，将电泳槽置于冰盆中，连接好装置，采用恒流模式，调电流使电流稳定维持在250mA，电转75～100min。电转结束后将PVDF膜泡入TBST缓冲液中漂洗，漂洗后浸于5％封闭液中，在摇床上室温缓慢摇动70min。封闭结束，使用TBST缓冲液漂洗PVDF膜。PVDF膜浸于一抗稀释液中，在4℃摇床上孵育过夜。次日用TBST缓冲液漂洗PVDF膜3次，每次8min，以除去膜上的非特异结合抗体。将PVDF膜浸于二抗稀释液，室温缓慢振摇1h。二抗孵育结束，以TBST缓冲液漂洗PVDF膜3次，每次8min，除去一抗上非特异结合的二抗。启动显影仪预热，将显影发光液试剂A与B以1:1的体积比混匀。以滤纸吸干PVDF膜上的TBST缓冲液，将PVDF膜浸入发光液体系中避光反应1min。置于ImageQuant LAS4000 mini曝光成像仪中进行显影操作。蛋白条带结果使用Quantity One软件进行灰度扫描，以GAPDH为内参，计算各组目的蛋白的表达变化，并进行统计学差异分析。

2、实验结果

沉默CPT1C对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231脂肪酸代谢相关酶基因和蛋白水平的影响结果如图3所示。其中，图3A为MDA-MB-231细胞中葡萄糖代谢相关酶的mRNA表达量检测结果；图3B为MDA-MB-231细胞中脂肪酸代谢相关酶的mRNA表达量检测结果；图3C为MDA-MB-231细胞中苹果酸酶各亚型的蛋白表达量检测结果；图3D为MDA-MB-231细胞中脂肪酸代谢相关酶的蛋白表达量检测结果。由图3所示结果可知，下调CPT1C表达后，MDA-MB-231细胞脂肪酸合成代谢相关酶的基因与蛋白表达与实施例1中沉默CPT1C对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231脂肪酸合成代谢的影响结果基本一致。

实施例3油酸对沉默CPT1C的MDA-MB-231细胞增殖及老化的影响

1、实验方法

(1)细胞的培养与转染等实验同实施例1。

(2)CCK-8细胞活力检测实验

将未经CPT1C沉默处理的细胞按适宜的密度培养于96孔板中，每孔为100μL体系，每组设3个复孔，同时设置空白孔对照。细胞添加BSA共轭油酸48h后检测细胞活力。检测时，用培养基按照10:1的比例稀释试剂盒中的CCK-8溶液，移除96孔板内培养基，每孔加入100μL稀释液，标准培养条件下继续孵育1～4h，使用多功能酶标仪测定450nm波长处的吸光度。

(3)BrdU细胞增殖实验

根据BrdU细胞增殖酶联免疫试剂盒说明书操作如下：a.实验用96孔板细胞每孔加进10μL的BrdU标记溶液(终浓度为10μM)，孵育24h，以标记细胞新合成的DNA。b.吸弃BrdU标记溶液，每孔加进200μL的FixDenat固定液，室温下固定20～30min。c.吸弃FixDenat固定液，每孔加进100μL的anti-BrdU-POD工作液，室温下孵育90min。d.吸弃anti-BrdU-POD工作液，每孔加进250μL的洗脱液，轻轻晃动，以除去未结合的抗体，清洗3次。e.完全吸弃洗脱液，每孔加进100μL的POD底物溶液，室温下孵育5～15min，小心去除溶液的气泡。f.使用酶标仪在370nm波长处测量各孔的吸光值，参比波长为492nm。

(4)细胞集落形成实验和β-gal染色实验

细胞集落形成实验根据Diff-Quik染色试剂盒说明书进行操作：a.室温下移除培养基，加入试剂盒内A液1mL，固定细胞2min；b.移除A液，使用超纯水轻轻润洗细胞1次，加入试剂盒内B液1mL，染色2min；c.移除B液，使用超纯水轻轻润洗细胞1次，加入试剂盒内C液1mL，复染色2min；d.移除C液，使用超纯水轻轻润洗细胞2次至去除残余染料。待6孔板自然风干后，在白纸背景下，对细胞集落斑块进行拍照。

β-gal染色实验根据SA-β-gal染色试剂盒说明书操作如下：a.吸弃细胞培养基，使用PBS小心润洗1次，每孔加入β-gal染色固定液1mL，室温固定15min；b.吸弃细胞固定液，使用PBS小心润洗2次，每次2～3min。c.吸弃PBS，每孔加入染色工作液1mL(10μLβ-gal染色液A，10μLβ-gal染色液B，930μLβ-gal染色液C，50μL X-Gal溶液)，6孔板用保鲜膜包裹以防止染色液蒸发，置于37℃、非二氧化碳培养箱孵育过夜。d.次日在倒置荧光显微镜下观察，选取不同视野进行拍照，确保结果具有一定的客观性。若无法及时拍照可更换染色工作液为PBS，保存于4℃冰箱。

2、实验结果

油酸对沉默CPT1C的人乳腺癌细胞株MDA-MB-231增殖及老化的影响结果如图4所示。其中，图4A为不同浓度梯度的BSA共轭油酸和BSA培养MDA-MB-231细胞的存活率结果；图4B为BSA共轭油酸和BSA培养MDA-MB-231细胞的增殖结果；图4C为BSA共轭油酸和BSA培养MDA-MB-231细胞的集落形成结果；图4D为BSA共轭油酸和BSA培养MDA-MB-231细胞的衰老相关β-gal染色结果；图4E为BSA共轭油酸和BSA培养MDA-MB-231细胞的衰老相关β-gal定量结果。由图4A所示结果可知，浓度小于100μM的油酸不会对MDA-MB-231细胞的活性造成影响。而由图4B～E所示结果可知，油酸促进MDA-MB-231细胞增殖并逆转沉默CPT1C所致老化表型，表现为细胞的BrdU增殖能力显著升高，集落形成能力显著增强，沉默CPT1C所致的SA-β-gal活性显著降低，表明油酸促进MDA-MB-231细胞增殖并逆转沉默CPT1C所致细胞老化。

实施例4油酸对沉默CPT1C的PANC-1细胞增殖及老化的影响

1、实验方法

此实施例的实验方法同实施例3，区别在于处理的细胞不同，本实施例为PANC-1肿瘤细胞。

2、实验结果

油酸对沉默CPT1C的人胰腺癌细胞株PANC-1增殖及老化的影响结果如图5所示。其中，图5A为不同浓度梯度的BSA共轭油酸和BSA培养PANC-1细胞的存活率结果；图5B为BSA共轭油酸或BSA培养PANC-1细胞的增殖结果；图5C为BSA共轭油酸或BSA培养PANC-1细胞的集落形成结果；图5D为BSA共轭油酸或BSA培养PANC-1细胞的衰老相关β-gal染色结果；图5E为BSA共轭油酸或BSA培养PANC-1细胞的衰老相关β-gal定量结果。由图5所示结果可知，油酸促进PANC-1细胞增殖并逆转沉默CPT1C所致老化表型，表现为细胞的BrdU增殖能力显著升高，集落形成能力显著增强，沉默CPT1C所致的SA-β-gal活性显著降低，表明油酸促进PANC-1细胞增殖并逆转沉默CPT1C所致细胞老化。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。