一种植物茎秆细胞壁超微结构的透射电镜制样方法

技术领域

本发明属于透射电镜样品制备技术领域，具体涉及一种植物茎秆细胞壁超微结构的透射电镜制样方法。

背景技术

透射电镜生物样品制样方法(也称超薄切片术)是保存生物样品超微结构的经典方法。其步骤包括：戊二醛和多聚甲醛前固定样品；漂洗样品；四氧化锇后固定样品；漂洗样品；酒精梯度脱水；丙酮置换酒精；丙酮和树脂梯度渗透样品；树脂包埋样品；高温聚合样品；对样品包埋块进行超薄切片和用铜网捞取超薄切片；对超薄切片进行醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染色；对超薄切片进行透射电镜观察。

因生物样品材质不一，如植物和动物样品存在有无细胞壁的区别，植物叶片样品较嫩，而植物的皮、茎秆以及木材则较硬等。在用经典的透射电镜生物样品制样方法对不同的生物样品进行制样，往往效果不同。因此，对待不同材质的生物样品，应该在原有的方法上进行改良，才能保存样品的超微结构，获得最佳制样效果。

现有用于透射电镜观察的超薄切片厚度一般为10～100nm，超薄切片的速度一般设为1mm/s。在超薄切片过程中，由于刀刃的切削而产生的压缩力可使样品的结构发生方向性变形，在切片上表现为规则均匀的形态变化，切削积压会在切片上形成皱褶。现有植物茎秆和木材样品的超薄切片的细胞壁上通常有很多褶皱，影响对细胞壁超微结构的观察。因此，为了更好保存植物茎秆类生物样品细胞壁超微结构，需要提供一种减少植物茎秆细胞壁皱褶的透射电镜生物样品制样方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种植物茎秆细胞壁超微结构的透射电镜制样方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种植物茎秆的细胞壁超微结构的透射电镜制样方法，包括依次对植物茎秆样品进行前固定，漂洗，后固定，脱水，渗透，包埋，聚合，切片，收集；所述切片速度为3～5mm/s、切片厚度为150～200nm。

本发明根据植物茎秆细胞的特点，创造性地在经典透射电镜制样方法的基础上，调整了超薄切片的切片速度和厚度至特定范围(切片速度为3～5mm/s、切片厚度为150～200nm)时，即可获得细胞壁褶皱显著减少甚至无褶皱的植物茎秆超薄切片，获得超微结构保存较好的植物茎秆超薄切片，从而可更好地对植物茎秆的细胞壁超微结构进行观察。

进一步地，所述植物茎秆样品包括但不限于甘蔗蔗皮或木材、竹子等类似于甘蔗蔗皮组织结构的植物样品。

进一步地，所述前固定为采用戊二醛和多聚甲醛处理。

优选地，戊二醛的浓度为4％，多聚甲醛的浓度为2％。

优选地，固定时间为2～4小时。

进一步地，所述漂洗为采用磷酸缓冲液漂洗。

优选地，磷酸缓冲液pH值为7.0。

进一步地，所述后固定为采用高锰酸钾处理。现有的方法中，是用四氧化锇进行后固定。四氧化锇用于固定生物样品的膜系统以及含脂类结构，同时作为一种电子染色剂，增强样品的电子反差，是生物样品透射电镜制样最常用的后固定剂。然而四氧化锇是管控试剂，有毒性，价格贵且不易获得。甘蔗蔗皮主要含纤维素和果胶，四氧化锇对其固定效果和电子染色效果均不明显。高锰酸钾可以对纤维素和果胶进行电子染色和固定。本发明根据甘蔗蔗皮细胞壁的成分特点，将四氧化锇改为高锰酸钾进行后固定，减少制样过程的有毒试剂的使用和节约成本，并可以省去超薄切片后的醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染色步骤，得到的甘蔗蔗皮超微结构良好。

使用高锰酸钾替代管控试剂四氧化锇，无需常规超薄切片后的醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染色步骤即可进行观察，减少制样过程的有毒试剂的使用和节约成本，操作简单。

优选地，高锰酸钾浓度为1％。

优选地，后固定时间为1～4小时。

进一步地，所述脱水为采用乙醇梯度脱水。

优选地，为采用30％、50％、70％、85％、95％的乙醇梯度脱水，最后再无水乙醇脱水，丙酮置换。

进一步地，所述渗透、包埋为采用的树脂为Spurr环氧树脂、Embed 812环氧树脂或者LR-White丙烯酸树脂处理。

优选地，所述渗透为将样品在丙酮和Spurr环氧树脂梯度中进行梯度渗透，再采用纯Spurr环氧树脂渗透。

优选地，梯度渗透采用的浓度依次为：丙酮和树脂比例3：1，1：1和1：3，每个梯度渗透时间均为12小时。

进一步地，所述聚合为70℃聚合48小时。

进一步地，所述切片速度为3mm/s、切片厚度为150～200nm，可获得褶皱显著减少甚至无褶皱的超薄切片。

进一步地，所述切片速度为3～5mm/s、切片厚度为200nm，可获得褶皱显著减少甚至无褶皱的超薄切片。

优选地，所述切片速度为3mm/s、切片厚度为200nm。综合考虑切片机功耗和超薄切片效果。

进一步地，所述收集为采用铜网收集切片。

作为一种优选的可实施方式，所述甘蔗蔗皮的细胞壁超微结构的透射电镜制样方法为：

(1)取甘蔗蔗皮，用4.0％戊二醛和2％多聚甲醛固定，先室温固定2～4小时，后置4℃固定过夜或更长。

(2)磷酸缓冲液(pH 7.0)漂洗；

(3)高锰酸钾室温固定1～4小时；

(4)去离子水漂洗样品；

(5)30％、50％、70％、85％、95％的乙醇梯度脱水；

(6)无水乙醇脱水；

(7)丙酮置换乙醇；

(8)样品在丙酮和Spurr环氧树脂梯度中进行梯度渗透；

(9)纯Spurr树脂渗透；

(10)样品在包埋模具中包埋，后置70℃烘箱聚合48小时。

(11)包埋块用超薄切片机进行超薄切片，切片速度设为3mm/s，厚度设为200nm，用铜网收集超薄切片。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了植物茎秆的细胞壁超微结构的透射电镜制样方法，是在经典透射电镜制样方法的基础上通过提高超薄切片速度以及切片厚度至特定范围，即可获得细胞壁褶皱显著减少甚至无褶皱，超微结构保存较好的植物茎秆超薄切片，从而可更好地对植物茎秆的细胞壁超微结构进行观察。

附图说明

图1为甘蔗蔗皮细胞壁超微结构。

图2为切片速度为3mm/s，厚度为200nm时获得的甘蔗蔗皮超薄切片。

图3为切片速度为3mm/s，厚度为150nm时获得的甘蔗蔗皮超薄切片。

图4为切片速度为5mm/s，厚度为200nm时获得的甘蔗蔗皮超薄切片。

图5为切片速度为1mm/s，厚度为80nm时获得的甘蔗蔗皮超薄切片。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1

(1)取成熟甘蔗蔗皮，切成1×1×3mm

(2)磷酸缓冲液(pH 7.0)漂洗4次，每次20分钟。

(3)1％高锰酸钾室温固定4小时。

(4)去离子水漂洗4次，每次20分钟。

(5)30％、50％、70％、85％、95％的乙醇梯度脱水，每次20分钟。

(6)无水乙醇脱水两次，每次20分钟。

(7)丙酮置换两次，每次20分钟。

(8)样品在丙酮：Spurr环氧树脂梯度中进行渗透。设三个渗透梯度，分别为：丙酮和树脂比例3：1，1：1和1：3。每个梯度渗透时间均为12小时。

(9)纯Spurr树脂渗透两次，每次12小时。

(10)样品在包埋模具中包埋，后置70℃烘箱聚合48小时。

(11)包埋块用超薄切片机(Leica UC7，德国)进行超薄切片，设置切片速度为3mm/s，厚度为200nm，用附有方华膜的单孔铜网和下捞法收集超薄切片。

(12)超薄切片在Talos L120C(Thermo Fisher，美国)透射电镜下进行观察，并用Ceta 2相机获取图片。

细胞壁超微结构如图1所示，得到的甘蔗蔗皮超微结构良好，I为胞间层；P为初生壁；S1为第一层次生壁；S2为第二层次生壁；S3为第三层次生壁。当切片速度为3mm/s，厚度为200nm，获得的甘蔗蔗皮超薄切片如图2所示，显示甘蔗蔗皮细胞壁上无褶皱，细胞壁结构清晰，有利于细胞壁超微结构的观察。

实施例2

(1)取成熟甘蔗蔗皮，切成1×1×3mm

(2)磷酸缓冲液(pH 7.0)漂洗4次，每次20分钟。

(3)1％高锰酸钾室温固定4小时。

(4)去离子水漂洗4次，每次20分钟。

(5)30％、50％、70％、85％、95％的乙醇梯度脱水，每次20分钟。

(6)无水乙醇脱水两次，每次20分钟。

(7)丙酮置换两次，每次20分钟。

(8)样品在丙酮：Spurr环氧树脂梯度中进行渗透。设三个渗透梯度，分别为：丙酮和树脂比例3：1，1：1和1：3。每个梯度渗透时间均为12小时。

(9)纯Spurr树脂渗透两次，每次12小时。

(10)样品在包埋模具中包埋，后置70℃烘箱聚合48小时。

(11)包埋块用超薄切片机(Leica UC7，德国)进行超薄切片，设置切片速度为3mm/s，厚度为150nm，用附有方华膜的单孔铜网和下捞法收集超薄切片。

(12)超薄切片在Talos L120C(Thermo Fisher，美国)透射电镜下进行观察，并用Ceta 2相机获取图片。

即与实施例1基本相同，不同之处在于，超薄切片速度为切片速度为切片速度为3mm/s，厚度为150nm；获得的甘蔗蔗皮超薄切片结果如图3所示，当以切片速度为3mm/s，厚度为150nm进行超薄切片时，甘蔗蔗皮细胞壁上略有褶皱，细胞壁结构较清晰，可用于观察。

实施例3

(1)取成熟甘蔗蔗皮，切成1×1×3mm

(2)磷酸缓冲液(pH 7.0)漂洗4次，每次20分钟。

(3)1％高锰酸钾室温固定4小时。

(4)去离子水漂洗4次，每次20分钟。

(5)30％、50％、70％、85％、95％的乙醇梯度脱水，每次20分钟。

(6)无水乙醇脱水两次，每次20分钟。

(7)丙酮置换两次，每次20分钟。

(8)样品在丙酮：Spurr环氧树脂梯度中进行渗透。设三个渗透梯度，分别为：丙酮和树脂比例3：1，1：1和1：3。每个梯度渗透时间均为12小时。

(9)纯Spurr树脂渗透两次，每次12小时。

(10)样品在包埋模具中包埋，后置70℃烘箱聚合48小时。

(11)包埋块用超薄切片机(Leica UC7，德国)进行超薄切片，设置切片速度为5mm/s，厚度为200nm，用附有方华膜的单孔铜网和下捞法收集超薄切片。

(12)超薄切片在Talos L120C(Thermo Fisher，美国)透射电镜下进行观察，并用Ceta 2相机获取图片。

即与实施例1基本相同，不同之处在于，超薄切片速度为切片速度为5mm/s，厚度为200nm；获得的甘蔗蔗皮超薄切片结果如图4所示，当以切片速度为5mm/s，厚度为200nm进行超薄切片时，显示甘蔗蔗皮细胞壁上无褶皱，细胞壁结构清晰，有利于细胞壁超微结构的观察。

对比例1

(1)取成熟甘蔗蔗皮，切成1×1×3mm

(2)磷酸缓冲液(pH 7.0)漂洗4次，每次20分钟。

(3)1％高锰酸钾室温固定4小时。

(4)去离子水漂洗4次，每次20分钟。

(5)30％、50％、70％、85％、95％的乙醇梯度脱水，每次20分钟。

(6)无水乙醇脱水两次，每次20分钟。

(7)丙酮置换两次，每次20分钟。

(8)样品在丙酮：Spurr环氧树脂梯度中进行渗透。设三个渗透梯度，分别为：丙酮和树脂比例3：1，1：1和1：3。每个梯度渗透时间均为12小时。

(9)纯Spurr树脂渗透两次，每次12小时。

(10)样品在包埋模具中包埋，后置70℃烘箱聚合48小时。

(11)包埋块用超薄切片机(Leica UC7，德国)进行超薄切片，设置切片速度为1mm/s，厚度为80nm，用附有方华膜的单孔铜网和下捞法收集超薄切片。

(12)超薄切片在Talos L120C(Thermo Fisher，美国)透射电镜下进行观察，并用Ceta 2相机获取图片。

即与实施例1基本相同，不同之处在于，超薄切片速度为切片速度为1mm/s，厚度为80nm；获得的甘蔗蔗皮超薄切片结果如图5所示，当以切片速度为1mm/s，厚度为80nm进行超薄切片时，甘蔗蔗皮细胞壁上出现较多皱褶，细胞壁结构不清晰，影响对细胞壁超微结构的观察。