SNP位点的检测试剂在判断雷琼黄牛肉色性状中的应用

技术领域

本发明涉及分子育种技术领域，更具体地，涉及SNP位点的检测试剂在判断雷琼黄牛肉色性状中的应用。

背景技术

雷琼黄牛是我国南方热带地区的良种肉牛，其属华南黄牛体系，主产地为我国广东湛江、海南省海口市及邻近区域。雷琼黄牛具有良好的耐热性、耐湿性、耐粗性和抗逆性。基于母系遗传角度，雷琼黄牛起源于瘤牛，外貌特征为肩峰隆起，体躯匀称，后躯不丰满，背线平直，肌肉结实紧凑，四肢强健，肋骨开张大，腹部圆润且不下垂，垂皮发达，尻部尖而斜，蹄部坚硬，皮薄有弹性，母牛角细短，公牛角粗短。雷琼黄牛毛发特征表现为黄色居多，黑色次之，且呈现十三黑特征，即鼻镜、眼睑、耳尖、四蹄、尾帚、背线和阴户及阴囊下部为黑色。雷琼黄牛繁殖性能高，性成熟早，挽力和持久力强，具有极强的抗逆性和耐高温高湿性能，对焦虫等寄生虫有较强的抵抗力，是我国南方肉牛新品种选育和改良的重要遗传资源。

随着农业耕种技术发展以及农业机械化的普及，主要作为役用的雷琼黄牛逐渐转向肉用。但由于其体型小、生长速度慢、肉色较浅，与我国优秀的良种肉牛存在一定的差距。

肉色是购买者选择肉产品的直接感官评价指标，影响消费者的购买欲望。肉产品颜色形成的物质基础是色素，其主要包括血红蛋白、肌红蛋白和细胞色素C等。畜禽在充分放血的情况下，肌红蛋白在肌肉总色素中的比例为80％至90％，对肉色的影响起主导地位，因而肌红蛋白是肉产品呈色最主要的色素成分。肌红蛋白呈色取决于肌红蛋白的含量和化学状态，肌红蛋白的化学状态主要有紫红色的脱氧肌红蛋白、鲜红色的氧合肌红蛋白和褐色的高铁肌红蛋白。脱氧肌红蛋白与氧合肌红蛋白中的二价铁离子可被氧化，成褐色的高铁肌红蛋白，使肉色变暗。同时，高铁肌红蛋白也可被肌肉中的高铁肌红蛋白还原酶还原为脱氧肌红蛋白，减少肌肉的褐变。因此，肉色形成的物质基础为肌红蛋白、血红蛋白和细胞色素C等色素分子，其中肌肉蛋白为主导色素分子，而肌红蛋白呈色机理是肌红蛋白含量和化学状态。

肉色会受品种、遗传、内源性抗氧化物质、饲养方式、日粮的配比、肌浆蛋白成分、添加剂的成分、屠宰应激、肌肉pH值、运输应激、环境温度、性别、年龄和pH值等多种因素的影响。其中遗传因素起着至关重要的作用。肉色属于复杂的、多基因控制的、表现为连续性变异的数量性状。

GSTP1基因属谷胱甘肽硫转移酶家族成员，其主要作用为调控硫代谷胱甘肽化循环、参与异生物质代谢、细胞解毒、催化等。GSTP1是谷胱甘肽硫转移酶家族(GSTs)成员中的P类，占该家族成员的90％，是蛋白质的硫代谷胱甘肽化循环中的关键调控酶，参与了异生物质代谢。GSTP1基因位于牛29号染色体上，基因全长2.8kb，7个外显子，共编码211个氨基酸。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供SNP位点的检测试剂在判断雷琼黄牛肉色性状中的应用。

本发明的第一个目的是SNP位点的检测试剂在判断雷琼黄牛肉色性状中的应用。

本发明的第二个目的是一种雷琼黄牛肉色性状的判断方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

SNP位点的检测试剂在判断雷琼黄牛肉色性状中的应用，所示试剂用于检测以下SNP位点中的一个或几个的基因型：

g.45441933G>C、g.45444249A>G、g.45444424G>A、g.45444613G>A、g.45441935G>A、g.45441998C>T、g.45442471C>G、g.45444484A>C；

其中，g.45441933G>C位于NC_037356.1：45441933，即ARS-UCD1.2版本的牛基因组第29染色体的第45441933位；

g.45444249A>G位于NC_037356.1：45444249，即ARS-UCD1.2版本的牛基因组第29染色体的第45444249位；

g.45444424G>A位于NC_037356.1：45444424，即ARS-UCD1.2版本的牛基因组第29染色体的第45444424位；

g.45444613G>A位于NC_037356.1：45444613，即ARS-UCD1.2版本的牛基因组第29染色体的第45444613位；

g.45441935G>A位于NC_037356.1：45441935，即ARS-UCD1.2版本的牛基因组第29染色体的第45441935位；

g.45441998C>T位于NC_037356.1：45441998，即ARS-UCD1.2版本的牛基因组第29染色体的第45441998位；

g.45442471C>G位于NC_037356.1：45442471，即ARS-UCD1.2版本的牛基因组第29染色体的第45442471位；

g.45444484A>C位于NC_037356.1：45444484，即ARS-UCD1.2版本的牛基因组第29染色体的第45444484位。

优选地，所述SNP位点为g.45441933G>C，其基因型为GG的个体屠宰后一小时亮度值显著高于基因型为GC的个体。

优选地，所述SNP位点为g.45444249A>G，其基因型为AG的个体屠宰后一小时亮度值显著高于基因型为GG的个体；其基因型为AG的个体屠宰后一小时黄度值显著高于基因型为GG的个体。

优选地，所述SNP位点为g.45444424G>A，其基因型为GG的个体屠宰后一小时亮度值显著低于基因型为GA或AA的个体；其基因型为GG的个体屠宰后一小时黄度值显著低于基因型为GA或AA的个体；其基因型为GG的个体屠宰后一小时色相角度值显著低于基因型为GA或AA的个体；其基因型为GG的个体屠宰后排酸24小时亮度值显著低于基因型为GA或AA的个体；其基因型为GG的个体屠宰后排酸24小时黄度值显著低于基因型为AA的个体；其基因型为GG的个体屠宰后排酸24小时色相角度值显著低于基因型为GA或AA的个体。

优选地，所述SNP位点为g.45444613G>A，其基因型为GG的个体屠宰后一小时亮度值显著低于基因型为GA的个体；其基因型为GG的个体屠宰后一小时黄度值显著低于基因型为GA的个体。

优选地，所述SNP位点为g.45441935G>A，其基因型为GG或GA的个体屠宰后排酸24小时亮度值显著高于基因型为AA的个体。

优选地，所述SNP位点为g.45442471C>G，其基因型为CC的个体屠宰后排酸24小时亮度值显著高于基因型为GG的个体。

优选地，所述SNP位点为g.45444484A>C，其基因型为AA的个体屠宰后排酸24小时亮度值显著高于基因型为AC的个体；

优选地，所述SNP位点为g.45441998C>T，其基因型为CC的个体屠宰后排酸24小时黄度值显著低于基因型为CT的个体；其基因型为CC的个体屠宰后排酸24小时色相角度值显著低于基因型为CT的个体。

更优选地，所述试剂为引物。

优选地，还有含有PCR试剂。

更优选地，所述PCR试剂为Green Taq Mix和/或ddH

更优选地，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～4和7～8。

F1:tcgtggccagagccgtga(SEQ ID NO:1)；

R1:tgcagccctcaacttctggc(SEQ ID NO:2)；

F2:tacttctagcctcccggcct(SEQ ID NO:3)；

R2:acagggtggctgggcgattt(SEQ ID NO:4)；

F4:gagtggccatcctctcatccc(SEQ ID NO:7)；

R4:cgtagcagcagcatcccag(SEQ ID NO:8)。

其中，核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示的引物对位点g.45441933G>C、g.45441935G>A、g.45441937G>A、g.45441998C>T和g.45442078G>C进行扩增；

核苷酸序列如SEQ ID NO:3～4所示的引物对位点g.45442471C>G和g.g.45442616C>T进行扩增；

核苷酸序列如SEQ ID NO:7～8所示的引物对位点g.45444249A>G、g.45444424G>A、g.45444484A>C和g.45444613G>A进行扩增。

本发明还要求保护一种雷琼黄牛肉色性状的判断方法，检测所述的SNP位点的基因型。

本发明还要求保护以下内容：

所述试剂在制备雷琼黄牛肉色性状试剂盒中的应用；

所述试剂在判断雷琼黄牛肉色性状中的应用；

所述试剂盒或所述判断方法在雷琼黄牛肉色性状分子育种中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明公开了雷琼黄牛的GSTP1基因的四个SNP位点(g.45441933G>C、g.45444249A>G、g.45444424G>A、g.45444613G>A)与屠宰后1小时的肉色性状存在显著相关(p<0.05)，五个SNP位点(g.45441935G>A、g.45441998C>T、g.45442471C>G、g.45444424G>A、g.45444484A>C)与肌肉排酸24小时的肉色性状存在显著相关(p<0.05)，表明上述8个位点与雷琼黄牛肉色性状显著相关，其突变位点可作为的分子标记，应用于分子育种。

附图说明

图1为雷琼黄牛GSTP1基因PCR扩增产物电泳图，M为DL2000Maker；1-4为GSTP1基因P1-P4片段的PCR产物。

图2为雷琼黄牛GSTP1基因SNPs位点测序图谱。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1雷琼黄牛GSTP1基因的多态性

一、实验方法

试验采集雷琼黄牛血液，每头牛取5mL的血液混合提取DNA模板；设计引物PCR扩增GSTP1所有外显子及部分非编码区，通过sanger测序技术，发现雷琼黄牛GSTP1基因的多态性。

1、样本

取国家雷琼黄牛保种场(广东省湛江市麻章区东海岛)50头纯种雷琼黄牛血液(公母各25头)，每头牛取5mL的血液。

2、引物设计

在NCBI上，获取牛GSTP1基因的DNA序列(NC_037356.1)，设计用于PCR的引物，并由生工生物工程(上海)股份有限公司负责合成，引物序列如表1。

表1：扩增雷琼黄牛GSTP1基因的引物序列

注：F：上游引物；R：下游引物

3、雷琼黄牛血液样本基因组DNA提取

将50头纯种雷琼黄牛血液混合后提取DNA，使用血液DNA提取试剂盒(北京天根)提取个体样本的DNA，得到个体全基因组DNA及DNA混池，DNA于-20℃保存。

4、PCR扩增

基于Green Taq Mix试剂及其说明书(南京诺唯赞生物科技有限公司)，配置50μL的反应体系：25μLGreen Taq Mix、2μL引物F(10μM)、2μL引物R(10μM)、5μL DNA模板、16μLddH

PCR扩增的程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸1min，循环40次，72℃延伸5min，放在4℃下保存。

制备1.5％的琼脂糖凝胶，TAE电泳检测PCR的结果，并切下含目的DNA片段的琼脂糖凝胶。

5、PCR产物纯化与测序

使用生工SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒(货号：B518141)，将含目的DNA片段的凝胶进行DNA提纯。PCR产物纯化后，送测序公司，进行sanger测序。

二、实验结果

以雷琼黄牛国家保种场50头纯种雷琼黄牛的血液基因组混池DNA为模板进行PCR扩增，得到GSTP1基因的P1、P2、P3和P4片段，分别为462、563、224、745bp的目的片段(图1)。所有片段无杂带，条带清晰，特异性较好，符合测序要求。

基于Sanger测序技术对PCR扩增得到GSTP1基因的P1、P2、P3和P4片段进行测序，结果如图2所示，结果显示，雷琼黄牛GSTP1基因存在11个SNP位点：

雷琼黄牛GSTP1基因，上游非编码区域存在3个SNP位点(g.45441933G>C、g.45441935G>A、g.45441937G>A)，第1内含子存在2个SNP位点(g.45441998C>T、g.45442078G>C)，以上5个位点由F1和R1引物序列(SEQ ID NO:1～2)扩增获得；

第2内含子存在1个SNP位点(g.45442471C>G)，第3内含子存在1个SNP位点(g.45442616C>T)以上2个位点由F2和R2引物序列(SEQ ID NO:3～4)扩增获得；

第6外显子存在1个SNP位点(g.45444249A>G)，第6内含子存在2个SNP位点(g.45444424G>A、g.45444484A>C)，第7外显子存在1个SNP位点(g.45444613G>A)以上4个位点由F4和R4引物序列(SEQ ID NO:7～8)扩增获得，其余引物扩增片段均无突变位点。

具体得，g.45441933G>C位于NC_037356.1：45441933，即ARS-UCD1.2版本的牛基因组第29染色体的第45441933位；

g.45444249A>G位于NC_037356.1：45444249，即ARS-UCD1.2版本的牛基因组第29染色体的第45444249位；

g.45444424G>A位于NC_037356.1：45444424，即ARS-UCD1.2版本的牛基因组第29染色体的第45444424位；

g.45444613G>A位于NC_037356.1：45444613，即ARS-UCD1.2版本的牛基因组第29染色体的第45444613位；

g.45441935G>A位于NC_037356.1：45441935，即ARS-UCD1.2版本的牛基因组第29染色体的第45441935位；

g.45441998C>T位于NC_037356.1：45441998，即ARS-UCD1.2版本的牛基因组第29染色体的第45441998位；

g.45442471C>G位于NC_037356.1：45442471，即ARS-UCD1.2版本的牛基因组第29染色体的第45442471位；

g.45444484A>C位于NC_037356.1：45444484，即ARS-UCD1.2版本的牛基因组第29染色体的第45444484位；

g.45441937G>A位于NC_037356.1：45441937，即ARS-UCD1.2版本的牛基因组第29染色体的第45441937位；

g.45442078G>C位于NC_037356.1：45442078，即ARS-UCD1.2版本的牛基因组第29染色体的第45442078位；

g.45442616C>T位于NC_037356.1：45442616，即ARS-UCD1.2版本的牛基因组第29染色体的第45442616位。

实施例2雷琼黄牛GSTP1基因相关的SNP位点的基因型频率和等位基因频率

一、实验方法

试验选取广东省湛江市遂溪县杨柑镇相同饲养条件下，100头2岁龄健康雷琼黄牛(34头公牛，66头母牛)。禁食禁水8小时后屠宰，提取雷琼黄牛肌肉样本基因组DNA，取每头牛12至13肋骨间背部最长肌0.5kg，测定屠宰1小时肉色性状，并置4度冰箱中排酸24小时后，测定其屠宰后排酸24h肉色性状。基于实施例1得到的雷琼黄牛GSTP1基因中的SNP位点的结果，对100头雷琼黄牛个体通过sanger测序技术检测SNP基因型。

其中，雷琼黄牛肌肉样本基因组DNA提取方法为：

使用天根生物的DP304型基因组DNA提取试剂盒(离心柱法)，切取0.03g的肌肉样本，提取雷琼黄牛肌肉样本的基因组DNA。分别利用NannoDrop2000分光光度计(ThermoScientific,Hudson,DE,美国)和1.5％琼脂糖凝胶电泳检验DNA样品的浓度和纯度。

检测SNP基因型的方法同实施例1“PCR扩增”和“PCR产物纯化与测序”。

二、实验结果

结果如表2所示，GSTP1基因SNP位点：

g.45441933G>C(SNP1)的基因型GG、GC和CC频率分别为0.75、0.21和0.04，等位基因G与C频率分别为0.855和0.145；

g.45441935G>A(SNP2)的基因型GG、GA和AA频率分别为0.17、0.33和0.50，等位基因G与A频率分别为0.335和0.665；

g.45441937G>A(SNP3)的基因型GG、GA和AA频率分别为0.17、0.27和0.56，等位基因G与A频率为0.305和0.695；

g.45441998C>T(SNP4)的基因型CC、CT和TT频率为0.92、0.08和0，等位基因C与T频率为0.96和0.04；

g.45442078G>C(SNP5)的基因型GG、GC和CC频率为0.12、0.45、0.43，等位基因G与C频率为0.345和0.655；

g.45442471C>G(SNP5)的基因型CC、CG和GG频率为0.22、0.37、0.41，等位基因C与G频率为0.405和0.595；

g.45442616C>T(SNP7)的基因型CC、CT和TT频率为0.02、0.25和0.73，等位基因C与T频率为0.145和0.855；

g.45444249A>G(SNP8)的基因型AA、AG和GG频率为0、0.22和0.78，等位基因A与G频率为0.11和0.89；

g.45444424G>A(SNP9)的基因型GG、GA和AA频率为0.15、0.49和0.36，等位基因G与A频率为0.395和0.605；

g.45444484A>C(SNP10)的基因型AA、AC和CC频率为0.66、0.34和0，等位基因A与C频率为0.83和0.17；

g.45444613G>A(SNP11)的基因型GG、GA和AA频率为0.84、0.16和0，等位基因G与A频率为0.92和0.08。

表2 SNP位点的基因型频率和等位基因频率

实施例3雷琼黄牛GSTP1基因与屠宰后1和24小时肉色性状的关联分析一、实验方法

实施例2的100头2岁龄健康雷琼黄牛，在屠宰后，取每头牛12至13肋骨间背部最长肌0.5KG，测定屠宰1小时肉色性状，并置4度冰箱中排酸24小时后，测定其排酸24h肉色性状。

具体检测方法如下：

试验牛屠宰后1小时和24小时，分别切取雷琼黄牛新鲜肌肉，使用色差仪随机测定5个不同位置肌肉截面的肉色，获得亮度值L*、红度值a*和黄度值b*，并计算饱和度C＝(a*

二、实验结果

表3为GSTP1基因鉴定到的11个SNP位点与雷琼黄牛屠宰1小时肉色性状的关联分析结果。在g.45441933G>C位点中，GG基因型个体的L

表3：雷琼黄牛GSTP1基因SNP位点与屠宰1小时肉色性状的关联分析

L*

表4为GSTP1基因鉴定到的11个SNP位点与雷琼黄牛屠宰24小时肉色性状的关联分析。在g.45441935G>A位点中，GG和GA基因型个体的L

表4雷琼黄牛GSTP1基因SNP位点与肌肉排酸24小时肉色性状的关联分析

L*

综上所述，GSTP1基因的g.45441933G>C、g.45444249A>G、g.45444424G>A、g.45444613G>A位点与雷琼黄牛屠宰后1小时的肉色性状存在显著相关(p<0.05)，g.45441935G>A、g.45441998C>T、g.45442471C>G、g.45444424G>A、g.45444484A>C位点与雷琼黄牛肌肉排酸24小时的肉色性状存在显著相关(p<0.05)，表明上述8个位点与雷琼黄牛肉色性状显著相关，其突变位点可作为的分子标记。

实施例4一种雷琼黄牛肉色性状的评估方法

一、实验方法

对雷琼黄牛肉基因组进行PCR扩增，其中核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示的引物对位点g.45441933G>C、g.45441935G>A和g.45441998C>T进行扩增；

核苷酸序列如SEQ ID NO:3～4所示的引物对位点g.45442471C>G进行扩增；

核苷酸序列如SEQ ID NO:7～8所示的引物对位点g.45444249A>G、g.45444424G>A、g.45444484A>C和g.45444613G>A进行扩增。

扩增体系为：25μLGreen Taq Mix、2μL引物F(10μM)、2μL引物R(10μM)、5μLl DNA模板、16μL ddH

扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸1min，循环40次，72℃延伸5min，放在4℃下保存。

PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测后，进行测序。

二、结果判读

其中，g.45441933G>C位于NC_037356.1：45441933，即ARS-UCD1.2版本的牛基因组第29染色体的第45441933位；

g.45444249A>G位于NC_037356.1：45444249，即ARS-UCD1.2版本的牛基因组第29染色体的第45444249位；

g.45444424G>A位于NC_037356.1：45444424，即ARS-UCD1.2版本的牛基因组第29染色体的第45444424位；

g.45444613G>A位于NC_037356.1：45444613，即ARS-UCD1.2版本的牛基因组第29染色体的第45444613位；

g.45441935G>A位于NC_037356.1：45441935，即ARS-UCD1.2版本的牛基因组第29染色体的第45441935位；

g.45441998C>T位于NC_037356.1：45441998，即ARS-UCD1.2版本的牛基因组第29染色体的第45441998位；

g.45442471C>G位于NC_037356.1：45442471，即ARS-UCD1.2版本的牛基因组第29染色体的第45442471位；

g.45444484A>C位于NC_037356.1：45444484，即ARS-UCD1.2版本的牛基因组第29染色体的第45444484位。

g.45441933G>C，其基因型为GG的个体屠宰后一小时亮度值显著高于基因型为GC的个体。

g.45444249A>G，其基因型为AG的个体屠宰后一小时亮度值显著高于基因型为GG的个体；其基因型为AG的个体屠宰后一小时黄度值显著高于基因型为GG的个体。

g.45444424G>A，其基因型为GG的个体屠宰后一小时亮度值显著低于基因型为GA或AA的个体；其基因型为GG的个体屠宰后一小时黄度值显著低于基因型为GA或AA的个体；其基因型为GG的个体屠宰后一小时色相角度值显著低于基因型为GA或AA的个体；其基因型为GG的个体屠宰后排酸24小时亮度值显著低于基因型为GA或AA的个体；其基因型为GG的个体屠宰后排酸24小时黄度值显著低于基因型为AA的个体；其基因型为GG的个体屠宰后排酸24小时色相角度值显著低于基因型为GA或AA的个体。

g.45444613G>A，其基因型为GG的个体屠宰后一小时亮度值显著低于基因型为GA的个体；其基因型为GG的个体屠宰后一小时黄度值显著低于基因型为GA的个体。

g.45441935G>A，其基因型为GG或GA的个体屠宰后排酸24小时亮度值显著高于基因型为AA的个体。

g.45442471C>G，其基因型为CC的个体屠宰后排酸24小时亮度值显著高于基因型为GG的个体。

g.45444484A>C，其基因型为AA的个体屠宰后排酸24小时亮度值显著高于基因型为AC的个体；

g.45441998C>T，其基因型为CC的个体屠宰后排酸24小时黄度值显著低于基因型为CT的个体；其基因型为CC的个体屠宰后排酸24小时色相角度值显著低于基因型为CT的个体。

实施例5一种雷琼黄牛肉色性状的评估试剂盒

一、组成

Green Taq Mix、核苷酸序列如SEQ ID NO:1～2所示的引物、核苷酸序列如SEQ IDNO:3～4所示的引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:7～8所示的引物和ddH

二、使用方法

同实施例4。