一类可用于活性分子递送的可降解脂质体及其纳米复合物

本发明涉及用于活性分子递送的可降解脂质体化合物，优选为用于生物活性分子递送的脂质体化合物，所述脂质体化合物能够高效递送活性分子，包括但不限于核酸、蛋白质以及小分子药物等，降低或最小化治疗相关毒性。本发明涉及使用所述可降解脂质体递送核酸的方法或者使用所述可降解脂质体在递送核酸中的用途。本发明还涉及包含所述脂质体化合物和活性分子的纳米复合物，以及所述纳米复合物的药物组合物。

靶向性药物递送可提高药物针对疾病细胞的治疗选择性，最大程度降低递送载体以及生物活性分子对正常细胞的毒性以及药物的毒副作用等。生物大分子药物，如核酸和蛋白质等在重大、疑难疾病的治疗和/或预防呈现出广阔应用前景。然而，生物大分子药物易降解且无法自主进入哺乳细胞中，新型药物递送技术对于其生物治疗应用至关重要。发展新型药物递送载体，高效、安全地将生物大分子药物导入靶细胞中，并在病灶组织富集，对于提高生物药的治疗效果至关重要。例如，信使RNA(mRNA)需要进入靶细胞的细胞质以翻译产生功能性蛋白。然而，mRNA易降解，分子量大，亲水性强，无法自主进入细胞。因此，mRNA药物的生物治疗应用依赖安全、有效和稳定的递送系统，以保护核酸免遭降解，并促进mRNA的细胞摄取，控制mRNA在细胞内高效、选择性从载体中释放。病毒载体在基因药物递送及基因治疗方面获得了广泛关注和应用，是生物大分子药物递送的载体之一。然而，病毒载体递送基因药物时存在可包装的基因药物容量受限、免疫原性强、细胞毒性等问题。非病毒载体等纳米材料因毒性小、递送效率高等被广泛地应用于生物大分子药物递送，脂质体，无机纳米材料，金属-有机框架材料，高分子聚合物，蛋白质及肽类等在核酸和蛋白质药物的递送中均得到了应用。脂质体由于其优异的递送效率和良好的生物兼容性，已经被广泛应用于DNA、RNA等生物大分子递送中。当前，已有数种用于小干扰RNA递送的脂质体制剂获得临床应用许可，其中脂质纳米颗粒包封的mRNA疫苗被应用于预防新型冠状病毒感染。包封核酸的脂质体一般通过内吞作用进入细胞，需进一步从溶酶体逃逸，以释放核酸至细胞质表达相应的蛋白。目前已经发现脂质体纳米颗粒进行溶酶体逃逸的主要机制有两种：一是脂质体与溶酶体膜相互作用使溶酶体膜不稳定；二是脂质体作为质子海绵，为了电荷平衡和浓度平衡，负离子和水大量内流，导致溶酶体膨胀破裂。

高效调控生物大分子药物在靶细胞中的释放对于提高其药物递送及生物治疗效率至关重要。因此，发展适用于新型生物活性分子特别是核酸的递送载体，使其不仅能够将生物活性分子更高效地递送至靶点，例如靶细胞或靶器官，保护正常组织或细胞免受给药的损害，同时高效的在疾病细胞或者病灶组织中高效释放药物，将进一步提高生物大分子药物的递送效率，发展靶向性治疗策略，由此降低或最小化治疗相关毒性的风险。

发明内容

本发明提供一种纳米药物载体，该纳米药物载体为一种基于活性氧物质(ROS)响应的可降解脂质体，其能将药物活性分子更高效且选择性递送至靶点的疾病细胞，其不仅提高了药物活性分子在疾病细胞中的释放效率，且通过靶向病灶组织进一步降低了对正常细胞的药物毒性。

第一方面，本发明提供式(I)的脂质体，

其中

R

t和s各自独立地为0或1，当t或s为零时表示该部分直接为单键；

A

Ht在每次出现时各自独立地为-R

其中

R

X在每次出现时各自独立地为

其中

m、n、p、q和r各自独立地为1-6；

W是O、S或NR

L

L

V是脂族烃基、OR

其中R

Y和Z在每次出现时各自独立地为S或O；

R

R

R

以及式(I)骨架结构中的N原子任选被阳离子化；

条件是R

条件是所述化合物不是下述化合物之一：

在一些实施方案中，式(I)的脂质体为可离子化形式的，即式(I)骨架结构中的一个或多个N原子可被离子化。在进一步的实施方案中，所述式(I)的脂质体为可离子化形式的，由此形成下述结构

以及含有相应的抗衡离子，其中R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，t和s均为0；或者t为0且s为1；或者t为1且s为0。

在一些实施方案中，t和s均为0；R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，片段

●A

●A

●A

●A

其中星号*表示式(I)或(I-1)至(I-7)中末端N原子连接。

在一些实施方案中，片段

●-(CH

●-(CH

●-(CH

●-(CH

其中星号*表示式(I)或(I-1)至(I-7)中末端N原子连接。

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，X为

在一些实施方案中，Y和Z均为S；或者Y为S，以及Z为O；或者Y为O，以及Z为S；或者Y和Z均为O。

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在进一步的实施方案中，R

在一些实施方案中，所述胺头的pKa值大于4，优选大于6，更优选大于8。

在一些实施方案中，A

在一些实施方案中，所述式(I)的脂质体为

其中A

在一些实施方案中，所述式(I)的脂质体为

其中A

在一些实施方案中，所述式(I)的脂质体为

其中v为6-28，优选v为10；A

在一些实施方案中，所述式(I)的脂质体为

其中R

在一些实施方案中，示例性的脂质体如下：

本发明的式(I)的脂质体由于在Ht基团中含有缩酮响应单元(特别是当Y和Z均为S时的硫缩酮相应单元)，因而是生物可降解的，该类脂质体可高效结合mRNA并通过组装形成纳米结构，进入细胞后，选择性地对细胞内的氧化性环境响应并降解，进而高效释放mRNA、表达响应蛋白。更进一步地，本发明的发明人发现通过将式(I)化合物中骨架结构上N原子上保留至少一个氢原子(即未被Ht取代或其他基团取代)进一步提高了递送效率并且并可靶向性递送药物到病灶组织，降低了给药相关的毒性，例如对正常细胞的药物毒性，对肝脏的毒性等。

第二方面，本发明提供制备R

其中所述变量R

具体地，本发明提供制备式(I)的脂质体的方法，其中R

使含有缩酮的丙烯酸酯CH

其中所述变量R

在一些实施方案中，所述方法中所述含有缩酮的丙烯酸酯与所述亲水胺的摩尔比比所述亲水胺中氨基上游离氢原子的摩尔数小1或小2，但是所述含有缩酮的丙烯酸酯与所述亲水胺的摩尔比大于1。在一些实施方案中，所述亲水胺含有2个伯氨基(-NH

在一些实施方案中，方法(a)中，对所述产物进行色谱纯化，得到期望的式(I)的脂质体，其中色谱纯化方法为本领域所熟知的。

在一些实施方案中，所述胺头的pKa值大于4，优选大于6，更优选大于8。所述方法中的所述亲水胺选自

在一些实施方案中，所述含有缩酮的丙烯酸酯CH

在一些实施方案中，所述亲水胺为

在一些实施方案中，所述反应为加成反应，优选为迈克尔加成反应(Michael addition reaction)。

在一些实施方案中，所述反应在60-85℃的温度进行。

本发明所述的含有缩酮的丙烯酸酯可以按照本领域已知的方法例如CN 110101665 A披露的方法合成。所述含有缩(硫)酮的丙烯酸酯为丙烯酸与含有缩(硫)酮的醇类化合物经酯化反应所得到的酯类化合物。

本发明的其它脂质体可以使用其它合适的起始材料通过上述合成路线和本领域中已知的其它路线制备。上文列出的方法可以包括另外的一个或多个步骤来添加或移除适当的保护基，以最终允许所述脂质体合成。此外，可以以替代的次序或顺序进行各个合成步骤，以得到所需的材料。可用于合成适用的脂质体的合成化学转化和保护基方法(保护和去保护)在本领域中是已知的。

第三方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括药用载体以及纳米复合物(nanocomplex)，其中纳米复合物包括本发明的式(I)的脂质体和药物活性分子。

在一些实施方案中，药物活性分子是小分子药物、蛋白质、肽、核酸、糖类或其组合，优选为核酸。在进一步的实施方案中，所述药物活性分子是mRNA。在更进一步的实施方案中，所述mRNA可为表达红色荧光蛋白的RFP mRNA,表达绿色荧光蛋白的GFP mRNA或者表达RAS蛋白酶DUF5的DUF5 mRNA在进一步的实施方案中，所述药物活性分子也可以是质粒DNA，如表达GFP的质粒DNA等。

在一些实施方案中，所述纳米复合物具有50至500nm(例如，50至300nm和50至180nm)的粒度。

在一些实施方案中，所述式(I)的脂质体为可离子化的。

在一些实施方案中，所述脂质体与所述药物活性分子经由非共价相互作用，共价键或它们二者结合。

在一些实施方案中，所述纳米复合物进一步含有其它脂质，选自胆固醇、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE,CAS:4004-05-1)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000,CAS:147867-65-0)或其组合。在进一步实施方案中，所述纳米复合物进一步含有胆固醇、二油酰磷脂酰乙醇胺和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000。在一实施方案中，本发明示例中脂质体:胆固醇:DOPE:DSPE-PEG2000的质量比为4:1:1:1或4:1:1:8)。

在一些实施方案中，本发明的纳米复合物如下制备：包括分别将本发明的脂质体、胆固醇、DOPE溶解在三氯甲烷中配成混合溶液，挥发成膜，再用无水乙醇超声溶解后滴加到含DSPE-PEG2000的醋酸钠缓冲溶液中，高速搅拌制备得到脂质体纳米颗粒。

在一些实施方案中，本发明的包括纳米复合物的药物组合物如下制备：将药物活性分子与质量为其5-20倍(脂质体与核酸的N/P比例范围为3:1-20:1)的所述纳米复合物混合孵育得到。在进一步的实施方案中，所述药物活性分子为mRNA。

第四方面，本发明提供一种递送核酸的方法，所述方法包括使用本发明的式(I)的脂质体递送核酸至靶细胞以在所述靶细胞内进行细胞内核酸药物释放；或者提供式(I)的脂质体作为药物递送载体的用途，其中所述药物为核酸；或者提供式(I)的脂质体作为药物递送载体在制备核酸药物中的用途，其中所述药物递送载体将所述核酸药物递送至靶细胞以在所述靶细胞内进行细胞内核酸药物释放。

在一些实施方案中，所述式(I)的脂质体为

其中

R

t和s各自独立地为0或1，当t或s为零时表示该部分直接为单键；

A

Ht在每次出现时各自独立地为-R

其中

R

X在每次出现时各自独立地为

其中

m、n、p、q和r各自独立地为1-6；

W是O、S或NR

L

L

V是脂族烃基、OR

其中R

Y和Z在每次出现时各自独立地为S或O；

R

R

R

以及式(I)骨架结构中的N原子任选被阳离子化；

条件是R

在一些实施方案中，式(I)的脂质体为可离子化形式的，即式(I)骨架结构中的一个或多个N原子可被离子化。在进一步的实施方案中，所述式(I)的脂质体为可离子化形式的，由此形成下述结构

以及含有相应的抗衡离子，其中R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，t和s均为0；或者t为0且s为1；或者t为1且s为0。

在一些实施方案中，t和s均为0；R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，片段

●A

●A

●A

●A

其中星号*表示式(I)或(I-1)至(I-7)中末端N原子连接。

在一些实施方案中，片段

●-(CH

●-(CH

●-(CH

●-(CH

其中星号*表示式(I)或(I-1)至(I-7)中末端N原子连接。

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，X为

在一些实施方案中，Y和Z均为S；或者Y为S，以及Z为O；或者Y为O，以及Z为S；或者Y和Z均为O。

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在一些实施方案中，R

在进一步的实施方案中，R

在一些实施方案中，所述胺头的pKa值大于4，优选大于6，更优选大于8。

在一些实施方案中，A

在一些实施方案中，所述式(I)的脂质体为

其中A

在一些实施方案中，所述式(I)的脂质体为

其中A

在一些实施方案中，所述式(I)的脂质体为

其中v为6-28，优选v为10；A

在一些实施方案中，所述式(I)的脂质体为

其中R

在一些实施方案中，示例性的脂质体如下：

在一些实施方案中，所述靶细胞为癌细胞、病原体感染的细胞或介导疾病的细胞；例如选自内皮细胞、上皮细胞、肌细胞、脑细胞、神经细胞、皮肤细胞、毛细胞、祖细胞和周细胞。

在一些实施方案中，所述核酸选自寡聚核苷酸、适配体、单链DNA、双链DNA、质粒DNA(plasmid)、短异构体、反义分子、小干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、microRNA(miRNA)、dsRNA(double-strand RNA)、shRNA(small/short hairpin RNA)、转移RNA(tRNA)、信使RNA(mRNA)、small activating RNA以及circRNA和本领域已知的其他形式的RNA分子。

在一些实施方案中，所述核酸是以纳米复合物形式存在的。在一些实施方案中，所述纳米复合物进一步含有其它脂质。

在本发明中，A

定义

术语“脂族烃基(aliphatic)”是指饱和或不饱和的、直链或支链的、无环的、环状的或多环的烃部分(hydrocarbon moiety)。例子包括但不限于，烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基部分。

术语“烷基”包括选自包含1至30，例如1至24，1至18个，例如1至12个，进一步例如1至10个，更进一步例如1至8个或1至6个或1至4个碳原子的直链和支链饱和烃基的烃基。一价烷基或烷基的例子包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基(icosyl)和三十烷基(triacontyl)等等。 二价烷基，即亚烷基的例子包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基、亚壬基、亚癸基、亚十一烷基、亚十二烷基、亚十三烷基、亚十四烷基、亚十五烷基、亚十六烷基、亚十七烷基、亚十八烷基、亚十九烷基、亚二十烷基(icosylene)和亚三十烷基(triacotylene)等等。

一价基团为从相应烃部分脱去一个氢原子所形成的基团。二价基团为从相应烃部分脱去两个氢原子所形成的基团。

术语“烯基”包括选自包含至少一个C＝C双键和2至30，例如2至24，2至18个，例如2至8个，进一步例如2至6个碳原子的直链和支链烃基的烃基。烯基，例如C2-6烯基的例子包括但不限于乙烯基(ethenyl/vinyl)、丙-1-烯基、丙-2-烯基、2-甲基丙-1-烯基、丁-1-烯基、丁-2-烯基、丁-3-烯基、丁-1,3-二烯基、2-甲基丁-1,3-二烯基、己-1-烯基、己-2-烯基、己-3-烯基、己-4-烯基、己-1,3-二烯基、十二碳烯基、十四碳烯基、十六碳烯基、十八碳烯基等。

术语“炔基”包括选自包含至少一个C≡C三键和2至30，例如2至24，2至18个，例如2至8个，进一步例如2至6个碳原子的直链和支链烃基的烃基。炔基，例如C2-6炔基的例子包括但不限于乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基(炔丙基)、1-丁炔基、2-丁炔基和3-丁炔基。

术语“环烷基”包括选自包含单环和多环(例如双环和三环)基团的饱和环烃基的烃基，包括稠合、桥连或螺环烷基。环烷基可以包含3至30个，3至12个，例如3至10个，进一步例如3至8个，进一步例如3至6个、3至5个或3至4个碳原子。进一步地，举例来说，环烷基可以选自包含3至12个，例如3至10个，进一步例如3至8个、3至6个碳原子的单环基团。单环环烷基的例子包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基、环十一烷基和环十二烷基。术语“环烯基”是指含有至少一个双键的非芳香族的、环状的烃部分，如环己烯基、亚环己烯基。术语“环炔基”是指含有至少一个三键的非芳香族的、环状的烃部分，环辛炔基和亚环辛炔基。类似地，亚环烷基、亚环烯基和亚环炔基为相应的二价基团。

术语“杂脂族烃基(heteroaliphatic)”是指含有至少一个选自N、O、P、B、S、Si、Sb、Al、Sn、As、Se和Ge的杂原子的脂族部分。本发明的杂脂族烃基包括含有至少一个选自N、O、P、B、S、Si、Sb、Al、Sn、As、Se和Ge的杂原子的烷基、烯基或炔基，以及含有至少一个选自N、O、P、B、S、Si、Sb、Al、Sn、As、Se和Ge的杂原子的环烷基、环烯基或环炔基部分。环状杂脂族烃基包括3员至7员单环环状杂脂族烃基和7员至12员二环环状杂脂族烃基，所述环状杂脂族烃基含有1-3个或多个，例如1-3个选自氧、氮和硫的杂环子。在一些实施方案中，所述环状杂脂族烃基为包含1-3个选自氧、氮和硫的杂环子的3员至7员单环环状杂脂族烃基。环状杂脂族烃基包括但不限于吡咯烷基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、吡喃基、吗啉基、环氧乙烷基、氮杂环丙烯基、环硫乙烷基、氮杂环丁基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁基、二硫杂环丁基、二氢吡啶、四氢吡啶、硫代吗啉、高哌嗪基、高哌啶基、氮杂环庚烷基、氧杂环庚烷基、硫杂环庚烷基、氧硫杂环己烷基、二氧杂环庚烷基、氧硫杂环庚烷基、氮氧杂环庚烷基、二硫杂环庚烷基、氮硫杂环庚烷基、二氮杂环庚烷、氮硫杂环己烷基、氧氮杂卓、二氮杂卓、硫氮杂卓、二氢噻吩基、二氢吡喃基、二氢呋喃基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、吡咯啉基、吲哚啉基、二氧杂环己烷基、二氧环戊基、吡唑啉基、吡唑烷基、二噻烷基、二噻环戊基、嘧啶酮基、二氧代-硫代吗啉基、氮杂双环[3.1.0]己基、氮杂双环[4.1.0]庚烷基、氮杂双环[2.2.2]己基等。典型的杂脂族烃基为杂烷基，即含有至少一个N、O或S的杂原子的烷基，例如含有一个N原子的C

术语“脂族烃基氧基(oxyaliphatic)”是指-O-脂族烃基。脂族烃基氧基的例子包括甲氧基，乙氧基，正丙氧基，异丙氧基，正丁氧基，异丁氧基，仲丁氧基和叔丁氧基。

术语“芳基(芳香烃基，aryl)”是指C6单环、C10二环、C14三环、C20四环或C24五环的芳香环体系。芳基的例子包括苯基，亚苯基，萘基，亚萘基，蒽基，亚蒽基，芘基和亚芘基。

术语“杂芳基(杂芳族烃基，heteroaryl)”是指具有一个或多个杂原子(如O，N，S或Se)的芳族5-8元单环，8-12元双环，11-14元三环和15-20元四环的环体系。杂芳基的实例包括呋喃基、亚呋喃基、芴基、亚芴基、吡咯基、亚吡咯基、噻吩基、亚噻吩基、噁唑基、亚唑基、咪唑基、亚咪唑基、苯并咪唑基、亚苯并咪唑基、噻唑基、亚噻唑基、吡啶基、亚吡啶基、嘧啶基、亚嘧啶基、喹唑啉基、亚喹唑啉基、喹啉基、亚喹啉基、异喹啉基、异亚喹啉基、吲哚基和亚吲哚基。

除非另有说明，本申请提及的脂族烃基、杂脂族烃基、脂族烃基氧基、烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基、亚炔基、环烷基、亚环烷基、环烯基、亚环烯基、环炔基、亚环炔基、杂环烷基、亚杂环烷基、杂环烯基、亚杂环烯基、芳基和杂芳基包括取代和未取代的部分二者。环烷基、亚环烷基、环烯基、亚环烯基、环炔基、亚环炔基、杂环烷基、亚杂环烷基、杂环烯基、亚杂环烯基、芳基和杂芳基上的可能取代基包括、但不限于、C

术语“药物活性分子”是指任何意在用于疾病的医学诊断、治愈、治疗或预防的化学物质，包括小分子和大分子药物。

术语“小分子物质”是指具有小于800道尔顿(例如，小于500道尔顿)的分子量的有机化合物，包括寡肽、寡糖和寡核苷酸。

术语“大分子药物”包括“肽”或“蛋白质”，是指通过酰胺键连接在一起的天然或非天然氨基酸的聚合物，其具有800道尔顿以上的分子量。

术语“核酸”是指通过磷酸二酯键连接在一起的核苷酸的聚合物。这些聚合物都可以被化学修饰。具体地，所述核酸包括任何形式的核酸分子，包括但不限于寡聚核苷酸、适配体、单链DNA、双链DNA、质粒DNA(plasmid)、短异构体、反义分子、小干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、microRNA(miRNA)、dsRNA(Dicer-substrate RNA)、shRNA(small/short hairpin RNA)、转移RNA(tRNA)、信使RNA(mRNA)、small activating RNA以及circRNA和本领域已知的其他形式的RNA分子。术语“核酸药物”是指上述具有疾病治疗功能的核酸分子。所述核酸分子作为核酸药物还可以包含任何其它可药用的载体或赋形剂。

术语“药物递送系统”是指用于将药物(特别是核酸)给药至有此需要的受试者，例如人或动物的组合物。在一些实施方案中，药物递送系统包含本发明的脂质体和/或其它脂质体作为药物递送载体，能够将包封药物(核酸)的脂质体递送至人或动物中感兴趣的部位， 优选地选择性地递送至靶细胞，例如癌细胞中，而不是递送至身体或器官的其他部位；更优选地通过内吞作用递送至靶细胞。

术语“药物递送载体”是指在药物递送过程中将药物释放至体内，例如靶细胞，以增强药物的选择性、功效、安全性和/或药代动力学的物质。

术语“靶细胞”是指通过药物递送系统被递送有药物的细胞，通常是指癌细胞、病原体感染的细胞或介导疾病的细胞；例如选自内皮细胞、上皮细胞、肌细胞、脑细胞、神经细胞、皮肤细胞、毛细胞、祖细胞和周细胞。

术语“非共价相互作用”是指任何非共价结合，其包括离子相互作用、氢键合、范德华力相互作用和疏水相互作用。

图1示出了脂质体对RFP mRNA递送。

图2示出了BAmP-TK-12脂质体的构效关系研究。其中a)BAmP-TK-12和BAmP-NTK的化学结构；b)BAmP-TK-12和BAmP-NTK对RFP mRNA的包裹效率；c)BAmP-TK-12和BAmP-NTK对ROS刺激的mRNA释放；d)HeLa细胞中BAmP-TK-12和BAmP-NTK对Cy3-mRNA的递送效率；e)HeLa细胞中BAmP-TK-12和BAmP-NTK对RFP mRNA的递送效率。

图3示出了以21TK(即BAmP)为胺头的脂质体中疏水性脂质尾部个数对递送的影响。

图4示出了HeLa细胞中本发明的脂质体对不同剂量GFP mRNA的递送效率。

图5示出了BAmP-TK-12递送DUF5 mRNA抑制肿瘤细胞增殖，其中a)BAmP-TK-12递送DUF5 mRNA抑制含有KRAS

图6示出了BAmP-TK-12脂质体对DUF5 mRNA的活体递送及肿瘤抑制。a)BAmP-TK-12/DUF5 mRNA的活体分布。b)HCT-116荷瘤小鼠肿瘤相对体积增长曲线。c)实验终点小鼠肿瘤组织。d)肿瘤组织western blot实验。

图7示出了化合物TK-21(BAmP-TK-12)的NMR谱图。

图8示出了化合物TK-21-4(BAmP with 4 TK-12)的NMR谱图。

图9示出了BAmP-TK-12对pDHFR-GFP质粒(5185bp)的递送实验。

图10示出了BAmP-TK-12对pDNMT3A-GFP(9746bp)质粒的递送实验。

图11示出了本发明的脂质体对DUF5 mRNA和GFP mRNA的递送实验。

图12示出了BAmP-TK-12对P53 mRNA的递送实验。

图13示出了BAmP-TK-12对GFP蛋白质和GFP mRNA的递送实验。

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中胆固醇为麦克林公司产品，货号为C10006595,CAS:57-88-5。

以下实施例中DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)为芃硕生物公司产品，CAS:4004-05-1。

以下实施例中DSPE-PEG2000为芃硕生物公司产品，货号为E05275，CAS:147867-65-0。

以下实施例中质粒pDHFR-GFP，pDNMT3A-GFP为武汉淼灵生物科技有限公司产品。

以下实施例中GFP蛋白为北京索莱宝科技有限公司产品。

以下实施例中HeLa细胞、HCT-116细胞、SW480细胞、A549细胞为北京协和细胞中心产品。

以下实施例中Nu/Nu小鼠为北京维通利华实验动物技术有限公司产品。

实施例

实施例1：

实施例1a:脂质体合成

脂质体由亲水胺化合物及疏水尾部通过迈克尔加成反应合成，其中疏水尾部即为含有缩酮的丙烯酸酯，具体为含有缩硫酮的丙烯酸酯。其中含有缩硫酮的丙烯酸酯，即2-((2-((2-(十二烷氧基)乙基)硫基)丙烷-2-基)硫基)乙基丙烯酰酸酯如CN110101665A实施例1和2的方法制备。所制备的2-((2-((2-(十二烷氧基)乙基)硫基)丙烷-2-基)硫基)乙基丙烯酰酸酯的

然后使所制备的2-((2-((2-(十二烷氧基)乙基)硫基)丙烷-2-基)硫基)乙基丙烯酰酸酯与亲水胺化合物1,4-双(3-氨基丙基)哌嗪(1,4-Bis(3-aminopropyl)piperazine,CAS:7209-38-3，简称BAmP)以3.3:1的摩尔比混合，80℃加热24h，粗产物在硅胶柱上以二氯甲烷/甲醇为洗脱液进行纯化，得到脂质体TK-21(亦称为BAmP-TK-12)。

以类似的方法，以合适比例的相应亲水胺(对于含有氨基上四个游离氢原子的亲水胺而言，2-((2-((2-(十二烷氧基)乙基)硫基)丙烷-2-基)硫基)乙基丙烯酰酸酯与亲水胺的摩尔比为3.3:1；对于含有氨基上三个游离氢原子的亲水胺而言，2-((2-((2-(十二烷氧基)乙基)硫基)丙烷-2-基)硫基)乙基丙烯酰酸酯与亲水胺的摩尔比为2.4:1)，制备了相应的脂质体化合物。

实施例1b:脂质体复合物的制备

为了构建转染效率高、生物兼容性好的递送载体，发明人进行了脂质体复合物的制备，具体方法如下：分别将实施例1a所制备的脂质体，胆固醇，DOPE溶解在三氯甲烷中，配制浓度为10mg/mL的混合溶液；按比例取三者的混合溶液挥发成膜，再用无水乙醇超声溶解后滴加入含5mg/mL DSPE-PEG2000的醋酸钠缓冲溶液(200mM,pH＝5.2)中，2000rpm搅拌5分钟，制备得到脂质体复合物。本实施例选用实施例1a制备的脂质体(TK-2, TK-3,TK-5,TK-6,TK-7,TK-8,TK-10,TK-11,TK-13,TK-14,TK-15,TK-16,TK-17,TK-18,TK-20,TK-21，按照上述方法，组装出脂质体:胆固醇:DOPE:DSPE-PEG2000的质量比依次为16:4:4:1的16种脂质体复合物。

将上述制备得到的16种脂质体复合物按照相同的方法递送RFP mRNA，检测RFP阳性细胞率以进行脂质体的筛选。具体方法如下：

在醋酸钠缓冲溶液(25mM,pH＝5.2)中加入含有0.33μg/mL RFP mRNA，与15倍质量的上述制备的16种脂质体复合物分别混合，混匀后孵育15分钟，完成脂质体/RFP mRNA自组装。各取50μL自组装体系加入到HeLa细胞中，孵育8h后更换新鲜培养基，于40h后用流式细胞仪分析RFP阳性细胞率。

结果见图1，表明16种脂质体均能进行RFP mRNA的递送，其中脂质体TK-21(又名BAmP-TK-12)的RFP阳性细胞率(见图1)最高。

实施例2：BAmP-TK-12脂质体构效关系研究

1.缩硫酮结构对于BAmP-TK-12的ROS刺激响应能力影响

本发明通过在脂质体的疏水性脂质尾部中引入能被ROS裂解的缩硫酮结构，使脂质体能够在细胞内ROS的刺激下发生降解从而释放包封的mRNA。为了验证缩硫酮结构对于BAmP-TK-12的ROS刺激响应能力影响，首先合成具有与其具有相同胺头结构BAmP但疏水性尾部中不含有缩硫酮的BAmP-NTK脂质体(结构式见图2A)。即将BAmP胺头及疏水尾部丙烯酸十八酯(CAS：4813-57-4)以1:3.3的摩尔比混合，80℃加热24h，粗产物在硅胶柱上以二氯甲烷/甲醇为洗脱液进行纯化得到脂质体BAmP-NTK。

为了比较BAmP-TK-12和BAmP-NTK对mRNA包封效率和ROS刺激响应能力，分别使用BAmP-TK-12和BAmP-TK与十五分之一于其质量的RFP mRNA在醋酸钠缓冲溶液(25mM,pH＝5.2)中自组装，孵育15min后使用iQuant broad range RNA quantitation kit(GeneCopoeia)测量未被包封的mRNA浓度。将等量mRNA直接溶于缓冲液中对应的浓度为100％对测量结果归一化，结果见图2B。BAmP-TK-12和BAmP-TK对mRNA的包封效率均接近100％。为了模拟疾病细胞中ROS刺激脂质体颗粒破裂释放mRNA的过程，在BAmP-TK-12/RFP mRNA和BAmP-TK/RFP mRNA中加入终浓度为25mM的H

为了比较BAmP-TK-12和BAmP-NTK对mRNA递送的性能，分别使用不同浓度BAmP-TK-12和BAmP-NTK与十五分之一于其质量的Cy3标记mRNA(Cy3-mRNA)在醋酸钠缓冲溶液(25mM,pH＝5.2)中自组装，孵育15min后加入HeLa细胞中。孵育8h后用流式细胞仪分析Cy3阳性细胞率。实验结果见图2D。结果表明在各浓度条件下，BAmP-TK-12和BAmP-NTK与mRNA复合物Cy3阳性细胞率接近，证明二者进入细胞效率相似。进一步，将BAmP-TK-12和BAmP-NTK如前述方法应用于RFP mRNA的递送，结果如图2E。通过比较RFP阳性细胞率可知，在各浓度条件下，由于BAmP-TK-12能够响应于HeLa细胞中偏高的ROS而破裂和释放mRNA，其递送效率均高于BAmP-NTK。

2.疏水长链个数对递送效率的影响

本发明通过将不同胺头与疏水性脂质尾部加成反应得到一系列脂质体，胺头中的N原子作为质子受体可被质子化，从而使该类脂质体纳米颗粒整体呈正电性，因而能够与呈负电性的mRNA及细胞膜、溶酶体膜发生静电相互作用，因此不完全被疏水尾部取代的N结构是使该脂质体能够有效包封和递送mRNA的重要原因。为了研究不同胺头结构如何影响脂质体的mRNA递送能力，合成含有3条缩硫酮疏水尾部的BAmP-TK-12和含有4条缩硫酮疏水尾部的TK-21-4(即含有4条缩硫酮疏水尾部的BAmP)，TK-21(BAmP-TK-12)的NMR谱图见图7，TK-21-4(BAmP with 4TK-12)的NMR谱图见图 8，并比较其mRNA递送能力。分别使用不同浓度BAmP-TK-12和TK-21-4与十五分之一于其质量的GFP mRNA在醋酸钠缓冲溶液(25mM,pH＝5.2)中自组装，孵育15min后加入HeLa细胞中。孵育8h后换液，36h后用流式细胞仪分析GFP阳性细胞率。实验结果见图3。结果表明在各浓度条件下，BAmP-TK-12均能高效地递送GFP mRNA，而TK-21-4无法递送GFP mRNA。实验证明，胺头中不完全被疏水尾部取代的N是使该脂质体能够有效包封和递送mRNA的重要原因。

3.不同脂质体的递送效率

为了进一步证明胺头中不完全被疏水尾部取代的N是使该脂质体能够有效包封和递送mRNA的重要原因，使用更多的胺头中有不完全取代的N的脂质体进行GFP mRNA递送。分别将脂质体TK-12,TK-19,TK-21,TK-22,TK-23,TK-24,TK-25与胆固醇，DOPE溶解在三氯甲烷中，配制浓度为10mg/mL的混合溶液；按比例取三者的混合溶液挥发成膜，再用无水乙醇超声溶解后滴加入含5mg/mL DSPE-PEG2000的醋酸钠缓冲溶液(200mM,pH＝5.2)中，2000rpm搅拌5分钟，制备得到脂质体复合物。本实施例所制备的TK-12,TK-19,TK-21,TK-22,TK-23,TK-24,TK-25之一，按照上述方法，组装出脂质体:胆固醇:DOPE:DSPE-PEG2000的质量比依次为16:4:4:1的7种脂质体复合物。在醋酸钠缓冲溶液(25mM,pH＝5.2)中加入含有37.5,75,150,300,600ng/mL GFP mRNA，与15倍质量的上述制备的7种脂质体复合物分别混合，混匀后孵育15分钟，完成脂质体/GFP mRNA自组装。各取50μL自组装体系加入到HeLa细胞中，孵育8h后更换新鲜培养基，于40h后用流式细胞仪分析GFP阳性细胞率。结果参见图4。实验证明胺头中有不完全取代的N的脂质体都能高效地递送mRNA。

实施例3：BAmP-TK-12脂质体对DUF5 mRNA的胞内递送及抑制癌细胞增殖

1.BAmP-TK-12/DUF5 mRNA对结肠癌细胞HCT-116的抑制作用

编码DUF5蛋白的基因即DUF5基因，其蛋白质为V.vulnificus rtxA1 gene(GI:27366913；VV2_0479)3596-4079处片段，序列见PDB ID:5W6L。以pcDNA3.1作为载体重组克隆DUF5基因，得到DUF5蛋白的重组表达载体pcDNA3.1-DUF5质粒。以XhoI核酸内切酶(NEB)对pcDNA3.1-DUF5质粒进行线性化，以该线性化质粒作为模板用RiboMAX

如上述方法将不同剂量DUF5 mRNA或GFP mRNA与15倍于其质量的BAmP-TK-12脂质体在醋酸钠缓冲溶液(25mM,pH＝5.2)中混匀，孵育15min后加入结肠癌细胞中，使其终浓度为0，150，300，600ng/mL。孵育8h后检测细胞活力。使用

为了探究DUF5 mRNA对癌症细胞中RAS蛋白及其下游信号通路的影响，收集经过8h BAmP-TK-12/DUF5 mRNA或BAmP-TK-12/GFP mRNA孵育或未经处理的HCT-116细胞裂解液进行western blot实验。所使用一抗为anti-RAS(RAS Antibody,CST#3965),anti-Phospho-p44/42 MAPK(phosphorylated ERK1/2,Thr202/Tyr204,197G2,CST#4377),anti-p44/42 MAPK(ERK1/2,L34F12,CST#4696),anti-Phospho-Akt(Phospho-Akt,Thr308,CST#9275),anti-AKT(anti-pan-AKT,Abcam#ab8805),anti-β-Actin(anti-β-Actin,8H10D10,CST#3700)。所用二抗为anti-rabbit(anti-rabbit IgG,HRP-linked antibody,CST#7074)和anti-mouse(anti-mouse IgG,HRP-linked antibody,CST#7076)。实验结果见图5e，相比于 其他对照组，经过BAmP-TK-12/DUF5 mRNA处理后，HCT-116细胞中RAS被显著切割，进而引起p-ERK(磷酸化ERK蛋白)水平降低(ERK蛋白表达水平未受影响)，同时，p-AKT(磷酸化AKT蛋白)水平亦有所降低(AKT蛋白表达水平未受影响)。在此证明，DUF5mRNA被BAmP-TK-12递送进入含有KRASG13D突变的HCT-116细胞中后，翻译产生的DUF5蛋白特异性识别和切割RAS蛋白，阻断其激活ERK蛋白、AKT蛋白的磷酸化，从而抑制结肠癌细胞HCT-116的细胞活力和增殖过程，证明了DUF5对于RAS/RAF/MEK/ERK和PI3K/AKT信号通路的调控功能。

2.BAmP-TK-12/DUF5 mRNA对结肠癌细胞SW480和人非小细胞肺癌细胞A549的抑制作用

前述实验已经证明BAmP-TK-12/DUF5 mRNA对于含有KRAS

如1.中所述，将不同剂量DUF5 mRNA或GFP mRNA与15倍于其质量的BAmP-TK-12脂质体在醋酸钠缓冲溶液(25mM,pH＝5.2)中混匀，孵育15min后加入结肠癌细胞SW480或非小细胞肺癌细胞A549中，使mRNA终浓度为0，150，300，600ng/mL。孵育8h后检测细胞活力。另外收集经过处理8h后的细胞裂解液用于western blot实验。实验结果见图5b,c,d，相比于其他对照组，经过BAmP-TK-12/DUF5 mRNA处理后，SW480和A549细胞活力明显降低，在DUF5 mRNA浓度仅为150ng/mL时，经过8h快速杀伤细胞存活率即降至40％。其内在机制是RAS被DUF5蛋白切割，进而引起磷酸化ERK蛋白水平降低(ERK蛋白表达水平未受影响)，同时，磷酸化AKT蛋白水平亦有所降低(AKT蛋白表达水平未受影响)。

在此证明，DUF5 mRNA被BAmP-TK-12递送进入癌细胞中翻译产生DUF5蛋白，对含有G13D、G12V、G12S突变的RAS蛋白均可产生高效的切割作用，抑制了其对下游ERK、AKT蛋白的磷酸化激活过程，从而抑制不同类型癌细胞增殖，表明BAmP-TK-12/DUF5 mRNA对于多种RAS突变导致的癌症都具有广谱性的治疗作用。

实施例4：BAmP-TK-12脂质体对DUF5 mRNA的活体递送及肿瘤抑制

1.BAmP-TK-12/DUF5 mRNA的活体分布

以XhoI核酸内切酶对pcDNA3.1-DUF5质粒进行线性化，以该线性化质粒作为模板用HyperScribe

为获得结肠癌HCT-116细胞的异种移植荷瘤小鼠模型，在4-6周龄雌性Nu/Nu小鼠右侧腋下接种5.0ⅹ10

2.BAmP-TK-12/DUF5 mRNA对活体肿瘤的抑制作用

如1中所述构建结肠癌HCT-116细胞的异种移植荷瘤小鼠模型，当肿瘤体积达到100mm

由小鼠肿瘤体积相对增长曲线(见图6b)可知，给予BAmP-TK-12/GFP mRNA或PBS溶液尾静脉注射处理的小鼠肿瘤快速增殖，而给予BAmP-TK-12/DUF5 mRNA治疗的小鼠肿瘤体积较实验开始时仅略有增长。由小鼠肿瘤组织照片(见图6c)可知，在实验终点时，经过BAmP-TK-12/DUF5 mRNA治疗的小鼠肿瘤体积远小于对照组，证明BAmP-TK-12/DUF5 mRNA在活体层次有效地抑制了结直肠癌恶性肿瘤增殖。

剪取小鼠肿瘤组织外周部分，使用组织匀浆机研磨，得到肿瘤组织细胞裂解液用于western blot实验，所用抗体如前所述。Western blot实验(如图6d所示)表明BAmP-TK-12/GFP mRNA或PBS对小鼠肿瘤部位细胞中的RAS蛋白和其所调控的AKT、ERK及其磷酸化蛋白p-AKT和p-ERK表达量没有影响，而BAmP-TK-12/DUF5 mRNA通过切割RAS蛋白使得p-AKT和p-ERK表达量下降。在此证明，BAmP-TK-12/DUF5 mRNA在活体中介导了RAS蛋白的酶解和下游信号通路的失活从而实现抗肿瘤的功能。

实施例5：本发明的脂质体对不同质粒的递送实验

1.pDHFR-GFP(5185bp)质粒和pDNMT3A-GFP(9746bp)质粒递送实验：分别将脂质体TK-21与胆固醇，DOPE溶解在三氯甲烷中，配制浓度为10mg/mL的混合溶液；按比例取三者的混合溶液挥发成膜，再用无水乙醇超声溶解后滴加入含5mg/mL DSPE-PEG2000的醋酸钠缓冲溶液(200mM,pH＝5.2)中，2000rpm搅拌5分钟，制备得到脂质体复合物。脂质体复合物中脂质体:胆固醇:DOPE:DSPE-PEG2000的质量比依次为16:4:4:1。在醋酸钠缓冲溶液(25mM,pH＝5.2)中加入含有40、80、160、320、640ng/mL pDHFR-GFP(5185bp)质粒，与15倍质量的上述制备的TK-21脂质体复合物分别混合，混匀后孵育15分钟，完成TK-21/pDHFR-GFP质粒自组装。各取50μL自组装体系加入到HeLa细胞中，孵育8h后更换新鲜培养基，于40h后用流式细胞仪分析GFP阳性细胞率。结果参见图9。类似地，将上述制备的TK-21纳米脂质体复合物pDNMT3A-GFP(9746bp)质粒混合用于HeLa细胞递送，并检测GFP阳性细胞率。结果参见图10，结果表明本发明的脂质体，例如TK-21适用于有效递送多种长度的质粒。

实施例6：本发明的脂质体对不同mRNA的递送实验

1.DUF5 mRNA递送实验：分别将脂质体与胆固醇，DOPE溶解在三氯甲烷中，配制浓度为10mg/mL的混合溶液；按比例取三者的混合溶液挥发成膜，再用无水乙醇超声溶解后滴加入含5mg/mL DSPE-PEG2000的醋酸钠缓冲溶液(200mM,pH＝5.2)中，2000rpm搅拌5分钟，制备得到脂质体复合物。本实施例选用所制备的TK-12,TK-22,TK-23,TK-24,TK-25之一，按照上述方法，组装出脂质体:胆固醇:DOPE:DSPE-PEG2000的质量比依次为16:4:4:1的5种脂质体复合物。在醋酸钠缓冲溶液(25mM,pH＝5.2)中加入含有0.33μg/mL DUF5 mRNA或GFP mRNA，与15倍质量的所制备的5种脂质体复合物分别混合，混匀后孵育15分钟，完成脂质体/mRNA自组装。各取50μL自组装体系加入到HeLa细胞中，孵育8h后测定对应的细胞活力，并将细胞活力百分比归一化到空白孔。结果参见图11。

2.TK-21对p53 mRNA的递送实验：类似地，制备TK-21纳米脂质体复合物，与15分之一于TK-21质量的40、80、160、320、640ng/mL p53 mRNA混合用于HeLa细胞递送，孵育36h后检测细胞活力。结果见图12，证明TK-21能有效地递送p53 mRNA并对细胞产生杀伤效果，TK-21适用于有效递送多种功能性mRNA。

实施例7：本发明的脂质体对核酸和蛋白的递送实验

1.GFP蛋白质递送及其与核酸递送的比较:将TK-21与胆固醇，DOPE溶解在三氯甲烷中，配制浓度为10mg/mL的混合溶液；按比例取三者的混合溶液挥发成膜，再用无水乙醇超声溶解后滴加入含5mg/mL DSPE-PEG2000的醋酸钠缓冲溶液(200mM, pH＝5.2)中，2000rpm搅拌5分钟，制备得到脂质体复合物，其中TK-21:胆固醇:DOPE:DSPE-PEG2000的质量比依次为16:4:4:1。在DMEM缓冲溶液中加入上述制备的1.2，2.4，4.8，9.6，19.2μg/mL TK-21脂质体复合物，与0.6倍质量的GFP蛋白质分别混合，混匀后孵育15分钟，完成脂质体/GFP蛋白质自组装。各取50μL自组装体系加入到HeLa细胞中，孵育6h后用流式细胞仪分析GFP阳性细胞率。结果参见图13，其中在相同浓度的脂质体复合物情况下，本发明的脂质体递送核酸的能力要强于递送蛋白的能力。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。