一种结直肠癌微肿瘤细胞模型的培养方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种结直肠癌微肿瘤细胞模型的培养方法。

背景技术

结直肠癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一。结直肠癌复发转移风险高，20-30％的患者初诊时即已出现转移病灶，超过50％的结直肠癌患者会在根治性治疗后数月到数年内出现不同程度的复发转移，这是结直肠癌患者的主要的死亡原因。

以经典的细胞毒性药物为基础的化疗治疗是结直肠癌的基本治疗手段之一，是提高患者长期生存率和复发转移风险的有效治疗方法。但是结直肠癌中最基础的化疗药物氟尿嘧啶的单药有效率仅有10-20％，联合其他药物的有效率也只能达到40％，经过化疗后仍有40％左右的患者会发生耐药导致的复发转移。结直肠癌中化疗疗效的个体差异很大，这就对结直肠癌的个体化治疗提出了新的要求。

近年来随着肿瘤诊断技术的进步、外科技术的发展和抗肿瘤治疗新方法的问世，结直肠癌的总体治疗效果已经获得了很大程度的改善，但是人类对这种疾病的发生、发展、复发转移等生物学过程，异质性、耐药性、肿瘤免疫相应机制仍然知之甚少。而且结直肠癌的病因和发生发展过程有很强的个体差异性，不能一概而论。因此将结直肠癌实体瘤原代细胞培养物作为模型进行个体化精准研究是结直肠癌研究领域乃至结直肠癌诊断治疗领域的趋势。因此开发一种能准确反应患者原病灶特性的肿瘤模型显得至关重要，而现有的原代肿瘤细胞培养技术主如2D培养，3D培养，重编程培养等几类，这些方法都不同程度的面临培养周期极长，培养成功率低，杂细胞难以去除，无法重现肿瘤微环境等问题。

发明内容

为了有效解决上述技术问题，本发明提供了一种新的结直肠癌微肿瘤模型培养技术及配套试剂，该技术的核心是：(1)用温和细胞解离试剂处理结直肠癌实体瘤组织，最大程度的保证了组织中各种类型细胞的活力；(2)配制特殊的无血清培养基，利用悬浮培养体系使结直肠癌组织中分离得到的各类型细胞自组装形成具有多种细胞成分的细胞团结构，称之为“结直肠癌微肿瘤模型”。

第一方面，本发明要求保护一种用于培养结直肠癌微肿瘤模型的培养基。

本发明要求保护的用于培养结直肠癌微肿瘤模型的培养基，由抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)、HEPES、GlutaMax、人重组蛋白EGF、人重组蛋白bFGF、人重组蛋白HGF、人重组蛋白Noggin、人重组蛋白R-spondin、人重组蛋白IL-2、人重组蛋白IL-15、SB202190(4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)、皮质醇、Forskolin(腺苷酸环化酶激动剂)、A83-01(3-(6-Methyl-2-pyridinyl)-N-phenyl-4-(4-quinolinyl)-1H-pyrazole-1-carbothioamide)、Primocin、N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine)、烟碱(Nicotinamide)、N2 supplement、霍乱毒素(Cholera Toxin)、B27、ITS-X(Insulin,Transferrin,Selenium,Ethanolamine Solution)、Y-27632和Advanced DMEM/F12培养基组成；

其中，所述抗菌抗真菌剂三抗中的青霉素的终浓度为100-200U/mL(如100U/mL)；所述抗菌抗真菌剂三抗中的链霉素的终浓度为100-200μg/mL(如100μg/mL)；所述抗菌抗真菌剂三抗中的两性霉素B的终浓度为250-250ng/mL(如250ng/mL)；所述HEPES的终浓度为8-12mM(如10mM)；所述GlutaMax的终浓度为0.8-1.2％(体积百分含量，如1％)；所述人重组蛋白EGF的终浓度为10-100ng/mL(如50ng/mL)；所述人重组蛋白bFGF的终浓度为10-50ng/mL(如20ng/mL)；所述人重组蛋白HGF的终浓度为5-25ng/mL(如20ng/mL)；所述人重组蛋白Noggin的终浓度为100-200ng/mL(如100ng/mL)；所述人重组蛋白R-spondin的终浓度为250-500ng/mL(如400ng/mL)；所述人重组蛋白IL-2的终浓度为10-100ng/mL(如20ng/mL)；所述人重组蛋白IL-15的终浓度为10-100ng/mL(如20ng/mL)；所述SB202190的终浓度为5-10μM(如10μM)；所述皮质醇的终浓度为20-50ng/mL(如25ng/mL)；所述Forskolin的终浓度为2-10μM(如5μM)；所述A83-01的终浓度为0.25-1.25μM(如1μM)；所述Primocin的终浓度为1％(体积百分含量)；所述N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine)的终浓度为0.5-2mM(如1mM)；所述烟碱(Nicotinamide)的终浓度为5-10mM(如10mM)；所述N2 supplement的终浓度为1％(体积百分含量)；所述霍乱毒素(Cholera Toxin)的终浓度为0.1-1nM(如0.5nM)；所述B27的终浓度为1.5-2.5％(体积百分含量，如2％)；所述ITS-X的终浓度为0.8-1.2％(体积百分含量，如1％)；所述Y-27632的终浓度为5-20μM(如10μM)；余量均为Advanced DMEM/F12培养基。以上各物质的终浓度均为在所述培养基中的终浓度。

进一步地，所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)组成如下：每毫升包含10000单位青霉素(碱)、10000μg链霉素(碱)和25μg两性霉素B。所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)为“Antibiotic-Antimycotic,100X”(如Gibco#15240062，或与其组成相同的其他产品)。所述“Antibiotic-Antimycotic,100X”每毫升包含10000单位青霉素(碱)、10000μg链霉素(碱)和25μg两性霉素B，利用0.85％盐液形式的青霉素G(钠盐)、硫酸链霉素和两性霉素B作为

在本发明的具体实施例中，所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)的品牌货号为Gibco#15240062；所述HEPES的品牌货号为Gibco#15630080；所述GlutaMax的品牌货号为Gibco#35050061；所述人重组蛋白EGF的品牌货号为Peprotech AF-100-15-100；所述人重组蛋白bFGF的品牌货号为Peprotech AF-100-18B-50；所述人重组蛋白HGF的品牌货号为Peprotech AF-100-39-100；所述人重组蛋白Noggin的品牌货号为上海近岸#CB89；所述人重组蛋白R-spondin的品牌货号为上海近岸#CX83；所述人重组蛋白IL-2的品牌货号为Peprotech 200-02；所述人重组蛋白IL-15的品牌货号为Peprotech 200-015；所述SB202190的品牌货号为Sigma#S7067；所述皮质醇的品牌货号为Sigma#H0888；所述Forskolin的品牌货号为Selleck#S2449；所述A83-01的品牌货号为Tocris#2939；所述Primocin的品牌货号为Invivogene#ant-pm-1；所述N-acetyl-L-cysteine的品牌货号为Sigma#A9165；所述Nicotinamide的品牌货号为Sigma#N0636；所述N-2Supplement的品牌货号为Gibco#17502001；所述Cholera Toxin的品牌货号为Listlab#100B；所述B27的品牌货号为Gibco#12587010；所述ITS-X的品牌货号为Gibco#51500056；所述Y-27632的品牌货号为MCE#129830-38-2；所述Advanced DMEM/F12培养基的品牌货号为Gibco#12634010。

进一步地，所述培养基的存在形式可为两种：

其一，所述培养基为由所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)、所述HEPES、所述GlutaMax、所述人重组蛋白EGF、所述人重组蛋白bFGF、所述人重组蛋白HGF、所述人重组蛋白Noggin、所述人重组蛋白R-spondin、所述人重组蛋白IL-2、所述人重组蛋白IL-15、所述SB202190(4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)、所述皮质醇、所述Forskolin(腺苷酸环化酶激动剂)、所述A83-01(3-(6-Methyl-2-pyridinyl)-N-phenyl-4-(4-quinolinyl)-1H-pyrazole-1-carbothioamide)、所述Primocin、所述N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine)、所述烟碱(Nicotinamide)、所述N2 supplement、所述霍乱毒素(Cholera Toxin)、所述B27、所述ITS-X(Insulin,Transferrin,Selenium,Ethanolamine Solution)、所述Y-27632和所述Advanced DMEM/F12培养基混合而成的溶液。

所述培养基配制好后需用0.22μM针头式滤器(Millipore SLGP033RS)过滤除菌，在4℃可以保存两周。

其二，所述培养基中的各组分单独存在，使用时按照配方进行配制。

更进一步地，其中的人重组蛋白EGF、人重组蛋白bFGF、人重组蛋白HGF、人重组蛋白Noggin、人重组蛋白R-spondin、人重组蛋白IL-2、人重组蛋白IL-15可以储液(母液)形式存在(-80℃可长期保存)，具体可为1000倍储液(母液)。SB202190、皮质醇、Forskolin、N-acetyl-L-cysteine、Nicotinamide和Y-27632可以储液(母液)形式存在(-20℃可长期保存)，具体可为1000倍储液(母液)。Cholera Toxin可以储液(母液)形式存在(-20℃可长期保存)，具体可为10000倍储液(母液)。A83-01可以储液(母液)形式存在(-20℃可长期保存)，具体可为100000倍储液(母液)。

1000×人重组蛋白EGF储液由人重组蛋白EGF、BSA和PBS组成，其中所述人重组蛋白EGF的终浓度为20μg/mL，所述BSA的终浓度为0.01g/mL，余量均为PBS。

1000×人重组蛋白bFGF储液由人重组蛋白bFGF、BSA和PBS组成，其中所述人重组蛋白bFGF的终浓度为20μg/mL，所述BSA的终浓度为0.01g/mL，余量均为PBS。

1000×人重组蛋白HGF储液由人重组蛋白HGF、BSA和PBS组成，其中所述人重组蛋白HGF的终浓度为20μg/mL，所述BSA的终浓度为0.01g/mL，余量均为PBS。

1000×人重组蛋白Noggin储液由人重组蛋白Noggin、BSA和PBS组成，其中所述人重组蛋白Noggin的终浓度为100μg/mL，所述BSA的终浓度为0.01g/mL，余量均为PBS。

1000×人重组蛋白R-spondin储液由人重组蛋白R-spondin、BSA和PBS组成，其中所述人重组蛋白R-spondin的终浓度为250μg/mL，所述BSA的终浓度为0.01g/mL，余量均为PBS。

1000×人重组蛋白IL-2储液由人重组蛋白IL-2、BSA和PBS组成，其中所述人重组蛋白IL-2的终浓度为20μg/mL，所述BSA的终浓度为0.01g/mL，余量均为PBS。

1000×人重组蛋白IL-15储液由人重组蛋白IL-15、BSA和PBS组成，其中所述人重组蛋白IL-15的终浓度为20μg/mL，所述BSA的终浓度为0.01g/mL，余量均为PBS。

上述七种1000倍储液中，所述BSA是可以100倍储液(母液)形式存在(现配现用)，具体由BSA和PBS组成，其中BSA(Sigma#A1933)的终浓度为0.1g/mL，余量均为PBS。

另外，1000×SB202190储液由SB202190和DMSO组成，其中所述SB202190的终浓度为10mM，余量均为DMSO。

1000×皮质醇储液由皮质醇、无水乙醇和超纯水组成，其中所述皮质醇的终浓度为25μg/mL，所述无水乙醇的终浓度为5％(体积百分含量)，余量均为超纯水。

1000×Forskolin由Forskolin和DMSO组成，其中Forskolin的终浓度为10mM，余量均为DMSO。

100000×A83-01储液由A83-01和DMSO组成，其中所述A83-01的浓度为25mM，余量均为DMSO。

1000×N-acetyl-L-cysteine储液由N-acetyl-L-cysteine和超纯水组成，其中所述N-acetyl-L-cysteine的浓度为0.5M，余量均为超纯水。

1000×Nicotinamide储液由Nicotinamide和超纯水组成，其中所述Nicotinamide的浓度为5M，余量均为超纯水。

10000×Cholera Toxin储液由Cholera Toxin和Cholera Toxin溶解液组成，其中所述Cholera Toxin的终浓度为10μM，余量均为Cholera Toxin溶解液。所述Cholera Toxin溶解液组成如下：每10mL所述Cholera Toxin溶解液中含有Tris(1M)pH 7.0 0.05M，NaCl0.2M，叠氮化钠3mM，EDTA(0.5M)pH 8.0 1mM，余量均为超纯水。

1000×Y-27632由Y-27632和超纯水组成，其中Y-27632的终浓度为10mM，余量均为超纯水。

第二方面，本发明要求保护一种用于培养结直肠癌微肿瘤模型的成套试剂。

本发明要求保护的用于培养结直肠癌微肿瘤模型的成套试剂，由前文第一方面中所述培养基如下中的全部或部分组成：样本解离液、样本保存液、样本清洗液、细胞消化液、消化终止液和细胞冻存液。

所述样本保存液可用于样本离体后的暂时保存，可以在有样本离体后，短时间内维持样本中细胞的活性。所述样本保存液配制好后4℃可保存1个月。

所述样本清洗液可用于样本的清洗和消毒。所述样本清洗液需现配现用。

所述样本解离液可用于样本的解离。所述样本解离液需现配现用，其中的胶原酶I、胶原酶II和胶原酶IV可以储液(母液)形式-20℃长期保存，具体可为10倍储液(母液)。10×胶原酶I储液由所述胶原酶I和PBS组成；其中所述胶原酶I的终浓度为2000U/mL；余量均为PBS。10×胶原酶II储液由所述胶原酶II和PBS组成；其中所述胶原酶II的终浓度为2000U/mL；余量均为PBS。10×胶原酶IV储液由所述胶原酶IV和PBS组成；其中所述胶原酶IV的终浓度为2000U/mL；余量均为PBS。所述胶原酶I、所述胶原酶II和所述胶原酶IV的酶活定义见后文。

所述细胞消化液可用于细胞团块的消化和传代，可以将结直肠癌肿瘤团块消化成单个细胞。所述细胞消化液需现配现用。

所述消化终止液可用于终止样本解离或细胞消化过程。所述消化终止液配制好后可在4℃保存一个月。

所述样本解离液由胶原酶I、胶原酶II、胶原酶IV和PBS组成；其中，所述胶原酶I的终浓度为150-250U/mL(如200U/mL)；所述胶原酶II的终浓度为150-250U/mL(如200U/mL)；所述胶原酶IV的终浓度为150-250U/mL(如200U/mL)；余量均为PBS。

其中，用蛋白酶的酶活来定义胶原酶(所述胶原酶I或所述胶原酶II或所述胶原酶IV)的单位U：在37℃，pH 7.5的条件下，用1U蛋白酶处理胶原酶(所述胶原酶I或所述胶原酶II或所述胶原酶IV)5小时，可以释放L-亮氨酸1μmol。

在本发明的具体实施例中，所述胶原酶I的品牌货号为Gibco#17100-017；所述胶原酶II的品牌货号为Gibco#17101-015；所述胶原酶IV的品牌货号为Gibco#17104-019；所述PBS的品牌货号为Gibco#21-040-CVR。

所述样本保存液由胎牛血清、抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)、HEPES和HBSS组成；其中，所述胎牛血清的终浓度为1-5％(体积百分含量，如2％)；所述抗菌抗真菌剂三抗中的青霉素的终浓度为100-200U/mL(如100U/mL)；所述抗菌抗真菌剂三抗中的链霉素的终浓度为100-200μg/mL(如100μg/mL)；所述抗菌抗真菌剂三抗中的两性霉素B的终浓度为250-250ng/mL(如250ng/mL)；所述HEPES的终浓度为8-12mM(如10mM)；余量均为HBSS。

进一步地，所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)组成如下：每毫升包含10000单位青霉素(碱)、10000μg链霉素(碱)和25μg两性霉素B。所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)为“Antibiotic-Antimycotic,100X”(如Gibco#15240062，或与其组成相同的其他产品)。所述“Antibiotic-Antimycotic,100X”每毫升包含10000单位青霉素(碱)、10000μg链霉素(碱)和25μg两性霉素B，利用0.85％盐液形式的青霉素G(钠盐)、硫酸链霉素和两性霉素B作为

在本发明的具体实施例中，所述胎牛血清的品牌货号为Gibco#16000-044；所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)的品牌货号为Gibco#15240062；所述HEPES的品牌货号为Gibco#15630080；所述HBSS的品牌货号为Gibco#14170161。

所述样本清洗液由抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)和PBS组成；其中，所述抗菌抗真菌剂三抗中的青霉素的终浓度为100-200U/mL(如100U/mL)；所述抗菌抗真菌剂三抗中的链霉素的终浓度为100-200μg/mL(如100μg/mL)；所述抗菌抗真菌剂三抗中的两性霉素B的终浓度为250-250ng/mL(如250ng/mL)；余量均为PBS。

进一步地，所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)组成如下：每毫升包含10000单位青霉素(碱)、10000μg链霉素(碱)和25μg两性霉素B。所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)为“Antibiotic-Antimycotic,100X”(如Gibco#15240062，或与其组成相同的其他产品)。所述“Antibiotic-Antimycotic,100X”每毫升包含10000单位青霉素(碱)、10000μg链霉素(碱)和25μg两性霉素B，利用0.85％盐液形式的青霉素G(钠盐)、硫酸链霉素和两性霉素B作为

在本发明的具体实施例中，所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)的品牌货号为Gibco#15240062；所述PBS的品牌货号为Gibco#21-040-CVR。

所述细胞消化液组成如下：每10mL所述细胞消化液中含有4-6mL(如5mL)Accutase，终浓度为5mM的EDTA，1.5-2.5mL(如2mL)TrypLE Express，余量为PBS。

进一步地，所述Accutase为“StemPro

在本发明的具体实施例中，所述Accutase的品牌货号为Gibco#A11105-01；所述0.5MEDTA的品牌货号为Invitrogen#AM9261；所述TrypLE Express的品牌货号为Gibco#12604013；所述PBS的品牌货号为Gibco#21-040-CVR。

所述消化终止液由胎牛血清、抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)和DMEM培养基组成；其中，所述胎牛血清的终浓度为8-12％(体积百分含量，如10％)；所述抗菌抗真菌剂三抗中的青霉素的终浓度为100-200U/mL(如100U/mL)；所述抗菌抗真菌剂三抗中的链霉素的终浓度为100-200μg/mL(如100μg/mL)；所述抗菌抗真菌剂三抗中的两性霉素B的终浓度为250-250ng/mL(如250ng/mL)；余量均为DMEM培养基。

进一步地，所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)组成如下：每毫升包含10000单位青霉素(碱)、10000μg链霉素(碱)和25μg两性霉素B。所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)为“Antibiotic-Antimycotic,100X”(如Gibco#15240062，或与其组成相同的其他产品)。所述“Antibiotic-Antimycotic,100X”每毫升包含10000单位青霉素(碱)、10000μg链霉素(碱)和25μg两性霉素B，利用0.85％盐液形式的青霉素G(钠盐)、硫酸链霉素和两性霉素B作为

在本发明的具体实施例中，所述胎牛血清的品牌货号为Gibco#16000-044；所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)的品牌货号为Gibco#15240062；所述DMEM培养基的品牌货号为Gibco#11965-092。

所述细胞冻存液由Advanced DMEM/F12培养基、DMSO和1％甲基纤维素溶液组成；其中，所述Advanced DMEM/F12培养基、所述DMSO和所述1％甲基纤维素溶液的体积配比为20:2:(0.8-1.2)(如20:2:1)；所述1％甲基纤维素溶液是浓度为1g/100ml的甲基纤维素水溶液。

在本发明的具体实施例中，所述Advanced DMEM/F12培养基的品牌货号为Gibco#12634010；所述DMSO的品牌货号为Sigma#D2438；所述甲基纤维素的品牌货号为Sigma#M7027。

第三方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的培养基或前文第二方面中所述成套试剂在培养结直肠癌微肿瘤模型中的应用。

第四方面，本发明要求保护一种培养结直肠癌微肿瘤模型的方法。

本发明要求保护的培养结直肠癌微肿瘤模型的方法，可包括如下步骤：

(a1)用前文第二方面所述的样本解离液对结直肠癌实体瘤组织进行解离处理；

(a2)利用第一方面所述培养基悬浮培养步骤(a1)解离出来的细胞，形成细胞团，即得结直肠癌微肿瘤模型。

进一步地，步骤(a1)中，可按照包括如下步骤的方法用所述样本解离液对所述结直肠癌实体瘤组织进行解离：按1mL所述样本解离液不超过0.5mg组织的用量，将剪碎后的所述结直肠癌实体瘤组织用所述样本解离液在37℃条件下进行样本解离，解离时间15分钟至2小时(如1小时)。

进一步地，步骤(a2)中，可按照包括如下步骤的方法用所述培养基悬浮培养(a1)解离出来的细胞：使用低吸附表面(low-attachment-surface)的细胞培养容器，利用所述培养基悬浮培养(a1)解离出来的细胞，37℃，5％CO

其中，初始接种密度可为10

进一步地，步骤(a2)中培养的时间为3-5天。

进一步地，在步骤(a1)之前，还可包括如下对所述结直肠癌实体瘤组织进行解离前处理的步骤：用体积百分含量为70-75％(如75％)的乙醇清洗结直肠癌实体瘤组织样本表面10-30秒；用前文第二方面中所述样本清洗液清洗所述结直肠癌实体瘤组织样本5-10次(如5次)，用无菌的PBS溶液清洗所述结直肠癌实体瘤组织样本5-10次(如5次)；然后除去所述结直肠癌实体瘤组织样本中的杂质、结缔组织、脂肪组织、坏死组织等影响原代细胞培养的成分。

对所述结直肠癌实体瘤组织进行解离前处理的步骤需要在冰上操作，整个操作步骤需要在10分钟内完成。

进一步地，进行所述解离前处理的所述结直肠癌实体瘤组织样本的离体时间为12小时以内，且在进行所述解离前处理之前一直保存于前文第二方面中所述样本保存液中。

进一步地，在步骤(a1)中，用所述样本解离液对所述结直肠癌实体瘤组织进行解离处理后还可包括如下步骤：用8-15倍(如10倍)体积的前文第二方面中所述消化终止液终止解离反应，收集细胞悬液；用100μm或40μm无菌细胞滤网过滤所述细胞悬液，去除组织残片和粘连细胞；800-1000g(如800g)室温离心10-15分钟(如10分钟)，弃去上清；后用3-5mL(如5mL)无菌PBS重悬细胞；再800-1000g(如800g)室温离心10-15分钟(如10分钟)，弃去上清；然后用前文第一方面中所述培养基重悬细胞沉淀。

第五方面，本发明要求保护一种获得结直肠癌实体瘤原代细胞的方法。

本发明要求保护的获得结直肠癌实体瘤原代细胞的方法，是从利用前文第四方面中所述方法得到的结直肠癌微肿瘤模型中分离得到结直肠癌实体瘤原代细胞。

具体可包括如下步骤：

(b1)采用细胞消化液(如前文所述细胞消化液)对所述结直肠癌微肿瘤模型进行消化处理，得到单细胞；

进一步地，还包括终止消化的步骤。如采用前文所述消化终止液终止消化。

(b2)从步骤(b1)所得单细胞中分选出CD326阳性细胞，即得所述结直肠癌实体瘤原代细胞。

进一步地，可通过CD326磁珠分选CD326阳性细胞。

在上述各方面中，所述结直肠癌具体可为原发性结直肠癌，病理分期为II期或III期，各种病理分型的结直肠癌或结直肠癌转移病灶，手术标本重量超过20mg的样本。

在本发明中，以上所有的所述PBS均可为1×PBS，pH7.3-7.5。其具体组成如下：溶剂为水，溶质及浓度为：KH

本发明提供了一种从新鲜结直肠癌实体瘤组织中提取培养结直肠癌微肿瘤模型的方法和配套试剂，该方法具有以下优点：

1、组织样本用量少，仅需20mg左右的结直肠癌手术样本；

2、培养周期短，仅需3-5天即可获得10

3、培养稳定性高，用本方法对合格的结直肠癌手术标本进行体外培养的成功率高达80％；

4、细胞类型丰富，结直肠癌微肿瘤模型可以保存原病灶中的肿瘤细胞、间质细胞和免疫细胞等多种细胞类型，很好地再现肿瘤微环境；

5、结直肠癌微肿瘤模型可以准确再现原病灶的病理亚型；

6、结直肠癌微肿瘤模型可以准确再现原病灶的遗传背景。

利用本发明方法得到的结直肠癌微肿瘤模型可以准确反应患者原病灶的各种特征，是肿瘤精准诊疗领域良好的科研实验模型和临床前实验模型。可以预见，这种培养方法在结直肠癌的研究和临床诊断治疗领域具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为结直肠癌微肿瘤模型形成过程前48小时的明场图片。标尺为200μm，100倍放大。

图2为结直肠癌微肿瘤模型及其对应的原病灶组织样本AB-PAS染色效果对比图。标尺为50μm，400倍放大。

图3为结直肠癌微肿瘤模型及其对应的原病灶组织样本多重免疫荧光染色效果对比图。标尺为50μm，400倍放大。

图4为分离纯化得到的结直肠癌原代肿瘤细胞明场图及免疫荧光染色结果。

图5为方案A、B、C三种培养基培养得到的结直肠癌微肿瘤模型及其对应的原病灶组织样本拷贝数变异分析(CNV)对比结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、配制用于培养结直肠癌微肿瘤模型的试剂

1、样本保存液(100mL)

样本保存液(100mL)的具体配方如表1所示。

表1、样本保存液(100mL)

样本保存液配制完成后，用15mL离心管进行分装，每管5mL。分装后可于4℃保存1个月。

2、样本清洗液(100mL)

样本清洗液(100mL)的具体配方如表2所示。

表2、样本清洗液(100mL)

样本清洗液需现配现用。

3、样本解离液(10mL)

样本解离液(10mL)的具体配方如表3所示。

表3、样本解离液(10mL)

注：样本解离液现配现用。

表3中，胶原酶储液的配制如表4-6所示。

表4、10×胶原酶I储液(100mL)

10×胶原酶I储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，每管1mL。该储液可在-20℃长期保存。

表5、10×胶原酶II储液(100mL)

10×胶原酶II储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，每管1mL。该储液可在-20℃长期保存。

表6、10×胶原酶IV储液(100mL)

10×胶原酶IV储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，每管1mL。该储液可在-20℃长期保存。

表4、表5和表6中，用蛋白酶的酶活来定义胶原酶(所述胶原酶I或所述胶原酶II或所述胶原酶IV)的单位U：在37℃，pH 7.5的条件下，用1U蛋白酶处理胶原酶(所述胶原酶I或所述胶原酶II或所述胶原酶IV)5小时，可以释放L-亮氨酸1μmol。

4、细胞消化液(10mL)

细胞消化液(10mL)的具体配方如表7所示。

表7、细胞消化液(10mL)

细胞消化液现配现用。

5、消化终止液(100mL)

消化终止液(100mL)的具体配方如表8所示。

表8、消化终止液(100mL)

消化终止液配制后，可在4℃保存一个月。

6、结直肠癌微肿瘤模型培养基(100mL)

结直肠癌微肿瘤模型培养基(100mL)的具体配方如表9所示。

表9、结直肠癌微肿瘤模型培养基(100mL)

结直肠癌微肿瘤模型培养基配制完成后，用0.22μM针头式滤器(MilliporeSLGP033RS)过滤除菌，在4℃可以保存两周。

表9中，人重组蛋白储液的配制如表11-表17所示(BSA储液的配制如表10所示)，SB202190储液的配置如表18所示，皮质醇储液的配制如表19所示，Forskolin储液的配制如表20所示，A83-01储液的配制如表21所示，N-acetyl-L-cysteine储液的配制如表22所示，Nicotinamide储液的配制如表23所示，Cholera Toxin储液的配制如表24和表25所示，Y-27632储液的配制如表26所示。

表10、100×BSA溶液(1mL)

100×BSA溶液现配现用。

表11、1000×人重组蛋白EGF储液(5mL)

1000×人重组蛋白EGF储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，该储液可在-80℃长期保存。

表12、1000×人重组蛋白bFGF储液(2.5mL)

1000×人重组蛋白bEGF储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，该储液可在-80℃长期保存。

表13 1000×人重组蛋白HGF储液(5mL)

1000×人重组蛋白HGF储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，该储液可在-80℃长期保存。

表14、1000×人重组蛋白Noggin储液(5mL)

1000×人重组蛋白Noggin储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，该储液可在-80℃长期保存。

表15、1000×人重组蛋白R-spondin储液(4mL)

1000×人重组蛋白R-spondin储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，该储液可在-80℃长期保存。

表16、1000×人重组蛋白IL-2储液(5mL)

1000×人重组蛋白IL-2储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，该储液可在-80℃长期保存。

表17、1000×人重组蛋白IL-15储液(5mL)

1000×人重组蛋白IL-15储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，该储液可在-80℃长期保存。

表18、1000×SB202190储液(1.51mL)

1000×SB202190储液配制后，用0.5mL无菌离心管分装，该储液可在-20℃长期保存。

表19、1000×皮质醇储液(100mL)

1000×皮质醇储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，该储液可在-20℃长期保存。

表20、1000×Forskolin储液(2.44mL)

1000×Forskolin储液配制后，用0.5mL无菌离心管分装，该储液可在-20℃长期保存。

表21、100000×A83-01储液(1.05mL)

1000×A83-01储液配制后，用0.5mL无菌离心管分装，该储液可在-20℃长期保存。

表22、1000×N-acetyl-L-cysteine储液(5mL)

1000×N-acetyl-L-cysteine储液配制后，用0.5mL无菌离心管分装，该储液可在-20℃长期保存。

表23、1000×Nicotinamide储液(4mL)

1000×Nicotinamide储液配制后，用0.5mL无菌离心管分装，该储液可在-20℃长期保存。

表24、10000×Cholera Toxin储液(1.17mL)

1000×Cholera Toxin储液配制后，用0.5mL无菌离心管分装，该储液可在-20℃长期保存。

表24中的Cholera Toxin溶解液的具体配方见表25。

表25、Cholera Toxin溶解液(10mL)

Cholera Toxin溶解液配制后，用0.5mL无菌离心管分装，该液可在-20℃长期保存。

表26、1000×Y-27632储液(3.125mL)

1000×Y-27632储液配制后，用0.5mL无菌离心管分装，该储液可在-80℃长期保存。

7、细胞冻存液

细胞冻存液的具体配方如表27所示。

表27、细胞冻存液

细胞冻存液现配现用。

表27中，1％甲基纤维素溶液的配制如表28所示。

表28、1％甲基纤维素溶液(10mL)

1％甲基纤维素溶液配制后可在4℃长期保存。

实施例2、结直肠癌术后标本的获取

1、与三甲医院合作，通过研究者发起的临床研究形式获取样本，合作的开展通过了正规的医学伦理审查。

2、主治医生按照医学指南规定的临床指征选择入组患者，并根据术中临床指征选择合适的样本用于体外培养，样本的选取标准为：原发性结直肠癌，病理分期为II期或III期，结直肠癌标本重量超过20mg的样本。

3、所有入组案例统一采用样本采集日期+患者住院号后四位的方式编码，例如2020年1月1日提供的样本，患者住院号为T001537474，则样本实验编号为202001017474。隐去患者的姓名、身份证号等与病人隐私相关的信息。医院提供样本时同时提供患者的病理分期分型、临床诊断等基本临床信息。

主治医生提供患者的性别、年龄、病史、家族史、吸烟史、病理分期分型、临床诊断等基本临床信息。隐去患者的姓名、身份证号等与病人隐私相关的信息，用统一的实验编号代替，实验编号的命名原则为采集样本的八位数字日期+患者住院号后四位。

4、手术中肿瘤组织离体后，由样本采集专员在手术室无菌环境中采集新鲜标本，采集样本需要选取新鲜血管丰富的部位，避免坏死组织、脂肪组织、纤维化组织等细胞活性差的部位。采集的样本置于事先4℃预冷的样本保存液(见实施例1)中。包含样本的样本保存管在冰上暂存，12小时内运输到实验室进行下一步操作，运输过程控制温度2-8℃。

实施例3、结直肠癌组织样本解离前处理

下述操作需要在冰上操作，整个操作步骤需要在10分钟内完成。

下述操作中用到的手术器材，均需事先高温蒸汽灭菌(120℃，20分钟)，烘干后才能使用。

1、样本称重后用医用酒精(体积百分含量75％)清洗样本表面10到30秒。

2、用样本清洗液清洗样本5次，用无菌的PBS溶液清洗样本5次。

3、用眼科剪、眼科镊、手术刀等器材，小心将样本中的脂肪组织、结缔组织、坏死组织剥离。

实施例4、结直肠癌组织样本解离

下述实施例中用到的手术器材，均需事先高温蒸汽灭菌(120℃，20分钟)，烘干后才能使用。

1、用眼科剪将组织剪碎成0.5mm

2、用样本解离液(见实施例1)处理组织，样本大小不超过0.5mg的组织用1mL样本解离液，样本大小超过0.5mg的组织，组织重量每增加0.1mg需要增加0.1mL样本解离液。样本解离液处理条件为37℃，解离时间1小时。解离过程中每15分钟在显微镜下观察样本的解离情况，直到观察到大部分细胞从组织中脱落。

3、用10倍体积的消化终止液(见实施例1)终止解离反应，细胞悬液经100μm无菌细胞滤网过滤去除组织残片和粘连细胞后，800g室温离心10分钟，弃去上清。

4、用5mL无菌PBS重悬细胞，800g室温离心10分钟，弃去上清。

5、用结直肠癌微肿瘤模型培养基(见实施例1)重悬细胞沉淀，进行细胞计数，台盼蓝染色测定细胞活率，分离得到的细胞活率大于70％即可进行细胞接种培养。

实施例5、结直肠癌微肿瘤模型培养

1、使用低吸附表面(low-attachment-surface)进行结直肠癌微肿瘤模型悬浮培养，所用培养基即为实施例1表9中的结直肠癌微肿瘤模型培养基(其中，所述人重组蛋白EGF的终浓度为50ng/mL；所述人重组蛋白bFGF的终浓度为20ng/mL；所述人重组蛋白HGF的终浓度为20ng/mL；所述人重组蛋白Noggin的终浓度为100ng/mL；所述人重组蛋白R-spondin的终浓度为400ng/mL；所述人重组蛋白IL-2的终浓度为20ng/mL；所述人重组蛋白IL-15的终浓度为20ng/mL；所述SB202190的终浓度为10μM；所述皮质醇的终浓度为25ng/mL；所述Forskolin的终浓度为5μM；所述A83-01的终浓度为1μM；所述N-acetyl-L-cysteine的终浓度为1mM；所述Nicotinamide的终浓度为10mM；所述Cholera Toxin的终浓度为0.5nM；所述Y-27632的终浓度为10μM)，以六孔板为例，按每孔10

2、每天观察细胞状态，直至细胞形成直径100μm左右的团块，之后每2-3天更换一次培养基以维持结直肠癌微肿瘤生长状态。

如图1所示，在培养的最初48小时内，癌组织来源的多种不同类型细胞自发聚集，自组装形成100μm大小的细胞团块结构，我们称之为微肿瘤模型。微肿瘤细胞团总数量可以达到10

实施例6、结直肠癌微肿瘤模型和原病灶的AB-PAS染色对比鉴定

下述实施例中用到的试剂耗材说明：

AB-PAS染色试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司，#G1285)；

阳离子防脱玻片(北京中杉金桥生物科技有限公司)；

二甲苯、甲醇、丙酮(北京化学试剂公司，分析纯)；

中性树脂胶(北京益利精细化学品有限公司)。

1、收集结直肠癌原病灶组织块，黄豆粒大小(5mm见方组织块)；收集经实施例5操作获得的结直肠癌微肿瘤团块，室温2000rpm离心10min制成细胞沉淀。

2、将原病灶组织块和微肿瘤细胞沉淀团块分别进行脱水固定(脱水机标准程序，樱花Tissue0Tek VIP 5Jr1脱水机)。

3、将脱水固定好的原病灶组织块和微肿瘤细胞沉淀团块分别进行石蜡包埋(石蜡包埋机标准程序，徕卡Leica EG1150H石蜡包埋机)。

4、将包埋好的原病灶组织块和微肿瘤细胞沉淀团块蜡块分别进行切片，切片厚度5μm(徕卡Leica RM2245半自动转轮式切片机)。

5、将切片进行摊片(徕卡Leica HI1210摊片机)，附着在阳离子防脱玻片上进行烤片(徕卡Leica HI1220烤片机)，制成石蜡切片备用。

6、用AB-PAS染色试剂盒分别对原病灶和微肿瘤切片进行AB-PAS染色：脱蜡梯度乙醇复水后，阿利新蓝染色液染色10分钟，蒸馏水清洗玻片3次，每次1分钟。氧化剂氧化5分钟。Schiff试剂浸染10分钟，自来水清洗玻片3次。苏木精染液染色3分钟，自来水清洗玻片3次。100μL分化液分化5秒钟，自来水清洗玻片2次，蒸馏水清洗玻片1次。Scott反蓝液浸染3分钟后，梯度乙醇脱水。乙醇晾干后每张玻片滴加50μL二甲苯进行通透。等二甲苯晾干完全后，滴加一滴中性树脂胶，用盖玻片封片。

7、镜下观察染色效果，拍照。

图2展示了培养得到的结直肠癌微肿瘤模型及其对应的原病灶组织样本AB-PAS染色效果对比图。结直肠癌以腺癌为主，癌巢内有大量的腺细胞和粘液湖，可以看到结直肠癌微肿瘤模型能够很好的保留组织中的粘液湖结构，保持和原病灶相似的粘液分泌量，最大程度地再现原病灶的病理组织结构。

实施例7、结直肠癌微肿瘤模型和原病灶的多重免疫荧光染色鉴定

下述实施例中用到的试剂说明：

多聚甲醛(北京化学试剂公司，分析纯)，用超纯水溶解多聚甲醛粉末，制成4％(4g/100mL)多聚甲醛溶液；

甲醇、二甲基亚砜(北京化学试剂公司，分析纯)；

双氧水(北京化学试剂公司，35％)；

甲醇、二甲基亚砜、35％双氧水按照4:4:1(体积比)的比例混合制成丹氏漂洗液；

牛血清白蛋白(Sigma，#A1933)，用PBS溶液溶解牛血清白蛋白，制成3％(3g/100mL)的BSA溶液；

免疫荧光一抗抗体(Abcam#ab215838，abclonal#A19607，Biolegend#300434)；

免疫荧光二抗抗体(CST#4408s，CST#8889s)；

Hoechst染液(北京索莱宝生物科技有限公司，#C0021)；

以实施例6中获得的石蜡切片为材料，按以下步骤进行多重免疫荧光染色，三种抗体分别标记pan-CK表征上皮来源的肿瘤细胞，Vimentin标记间质细胞，CD3标记T细胞：

1、石蜡切片脱蜡复水后，用PBS清洗一遍，预冷的甲醇溶液处理1小时。

2、丹氏漂洗液室温处理2小时，依次用75％、50％、25％(体积百分含量)用PBS稀释的甲醇溶液处理，每次10分钟。

3、3％BSA溶液室温封闭2小时。

4、一抗混合稀释液(3％BSA溶液)4℃一抗过夜。

5、PBS溶液清洗切片5次，每次20分钟。

6、二抗混合稀释液(按1：2000的比例，用3％BSA溶液稀释)室温二抗2小时。

7、PBS溶液清洗切片5次，每次20分钟。

8、Hoechst染液，室温染色20分钟。

9、放淬灭封片剂封片，使用激光共聚焦显微镜观察染色情况并拍照。

图3展示了培养得到的结直肠癌微肿瘤模型及其对应的原病灶组织样本多重免疫荧光染色的效果图，可以看到结直肠癌微肿瘤模型中，不但保留了原病灶中panCK阳性(绿色荧光)的肿瘤细胞，同时还保存了Vimentin阳性的间质细胞(白色)和免疫细胞(T细胞蓝色)，最大程度的再现了原病灶的细胞多样性和微环境。证实了本方法培养得到的微肿瘤模型和原病灶在细胞组成方面的高度相似性。我们对10个结直肠癌微肿瘤样本及其对应的原病灶组织块进行多重免疫荧光染色鉴定，统计结果见表29。

表29、结直肠癌微肿瘤模型及其对应的原病灶组织样本多重免疫荧光染色鉴定

实施例8、从结直肠癌微肿瘤模型中分离结直肠癌原代肿瘤细胞

下述实施例中提及的细胞磁珠分选流程使用美天旎CD326磁珠阳选试剂盒(美天旎#130-061-101)。

1、收集经实施例5悬浮培养的结直肠癌微肿瘤模型，800g室温离心10分钟，弃上清。

2、用无菌的PBS溶液清洗细胞沉淀一次，800g室温离心10分钟，弃上清。

3、用细胞消化液(见实施例1)重选细胞沉淀，37℃消化5-30分钟，消化过程中每5分钟在显微镜下观察细胞团块消化情况，直到多数细胞团被消化为单细胞。

4、用10倍体积的消化终止液(见实施例1)终止消化，细胞悬液800g室温离心10分钟，弃上清。

5、消化得到的单细胞悬液用美天旎CD326磁珠阳选试剂盒进行分选得到CD326阳性的肿瘤细胞：用分选缓冲液(配方将表30)重悬细胞沉淀，细胞量少于10

表30、分选缓冲液

注：现配现用。

6、分选得到的CD326阳性细胞800g室温离心10分钟，弃上清。用含有10％血清的DMEM培养基，以10

实施例9、结直肠癌原代肿瘤细胞的传代

1、贴壁培养的结直肠癌原代肿瘤细胞，去培养基用无菌的PBS溶液清洗细胞。

2、0.05％的胰蛋白酶室温消化细胞30-300s，期间观察细胞状态，直到大部分细胞被消化为球形。

3、用10倍体积含有10％血清的DMEM培养基终止消化反应，收集细胞悬液800g室温离心10分钟，弃上清。

4、800g室温离心10分钟，弃去上清。

5、用含有10％血清的DMEM培养基重悬细胞沉淀，细胞计数。以10

经过实施例8的纯化步骤和实施例9的传代培养，可以得到高纯度的结直肠癌原代肿瘤细胞(图4)。

实施例10、结直肠癌原代细胞的冻存

经实施例8纯化培养后的结直肠癌原代肿瘤细胞经过2-3次传代扩增后，可以进行冻存：

1、贴壁培养的结直肠癌原代肿瘤细胞，去培养基用无菌的PBS溶液清洗细胞。

2、0.05％的胰蛋白酶室温消化细胞30-300s，期间观察细胞状态，直到大部分细胞被消化为球形。

3、用10倍体积含有10％血清的DMEM培养基终止消化反应，收集细胞悬液800g室温离心10分钟，弃上清。

4、800g室温离心10分钟，弃去上清。

5、用细胞冻存液(见实施例1)，按10

实施例11、结直肠癌原代细胞的复苏

液氮中保存的结直肠癌原代肿瘤细胞可以进行复苏：

1、提前五分钟准备37℃无菌水。

2、将冻存管从液氮中取出，在37℃无菌水中迅速融化细胞。

3、冻存管中的细胞转移至15ml离心管，补加十倍体积含有10％血清的DMEM培养基充分混匀，800g室温离心10分钟，弃去上清。

4、用含有10％血清的DMEM培养基重悬细胞沉淀，细胞计数。以10

实施例12、不同原代培养基结直肠癌微肿瘤结构形成能力比较

本实施例中所有样本原代培养的操作方法流程均完全一致(参照前文所述)，仅培养基配方有所区别。进行测试的各种原代培养基见表31。其中方案C为本发明中采用的配方，具体见表9。

表31、测试用原代培养基配方(100mL)

注：方案A中，所述人重组蛋白EGF的终浓度为50ng/mL；所述人重组蛋白bFGF的终浓度为20ng/mL；所述人重组蛋白HGF的终浓度为20ng/mL；所述人重组蛋白Wnt-3a的终浓度为200ng/mL；所述人重组蛋白Noggin的终浓度为100ng/mL；所述SB202190的终浓度为5μM；所述A83-01的终浓度为0.5μM；所述N-acetyl-L-cysteine的终浓度为1mM；所述Nicotinamide终浓度为5mM；所述皮质醇的终浓度为25ng/mL；所述Y-27632的终浓度为10μM。方案B中，所述人重组蛋白EGF的终浓度为50ng/mL；所述人重组蛋白bFGF的终浓度为20ng/mL；所述人重组蛋白HGF的终浓度为20ng/mL；所述人重组蛋白Wnt-3a的终浓度为200ng/mL；所述人重组蛋白R-spondin的终浓度为300ng/mL；所述SB202190的终浓度为5μM；所述A83-01的终浓度为0.5μM；所述N-acetyl-L-cysteine的终浓度为1mM；所述Nicotinamide终浓度为5mM；所述Cholera Toxin的终浓度为1nM；所述Y-27632的终浓度为10μM。方案C中，所述人重组蛋白EGF的终浓度为50ng/mL；所述人重组蛋白bFGF的终浓度为20ng/mL；所述人重组蛋白HGF的终浓度为20ng/mL；所述人重组蛋白Noggin的终浓度为100ng/mL；所述人重组蛋白R-spondin的终浓度为400ng/mL；所述人重组蛋白IL-2的终浓度为20ng/mL；所述人重组蛋白IL-15的终浓度为20ng/mL；所述SB202190的终浓度为10μM；所述皮质醇的终浓度为25ng/mL；所述Forskolin的终浓度为5μM；所述A83-01的终浓度为1μM；所述N-acetyl-L-cysteine的终浓度为1mM；所述Nicotinamide的终浓度为10mM；所述Cholera Toxin的终浓度为0.5nM；所述Y-27632的终浓度为10μM。

表32、方案D中的原代培养基(100mL)

注：所述人重组蛋白EGF的终浓度为50ng/mL；所述人重组蛋白bFGF的终浓度为20ng/mL；所述人重组蛋白HGF的终浓度为20ng/mL；所述人重组蛋白FGF-10的终浓度为20ng/mL；所述人重组蛋白Wnt-3a的终浓度为200ng/mL；所述人重组蛋白Noggin的终浓度为100g/mL；所述人重组蛋白R-spondin的终浓度为400ng/mL；所述人重组蛋白IL-2的终浓度为20ng/mL；所述人重组蛋白IL-15的终浓度为20ng/mL；所述CHIR99021的终浓度为3μM；所述SB202190的终浓度为10μM；所述A83-01的终浓度为1μM；所述N-acetyl-L-cysteine的终浓度为1mM；所述Nicotinamide的终浓度为10mM；所述Cholera Toxin的终浓度为1nM；所述Y-27632的终浓度为10μM；所述Gastrin的终浓度为10nM。

表33、方案E中的原代培养基(100mL)

注：所述人重组蛋白EGF的终浓度为50ng/mL；所述人重组蛋白bFGF的终浓度为20ng/mL；所述人重组蛋白MSP的终浓度为20ng/mL；所述人重组蛋白IL-2的终浓度为20ng/mL；所述人重组蛋白IL-15的终浓度为20ng/mL；所述人重组蛋白HGF的终浓度为20ng/mL；所述Forskolin的终浓度为5μM；所述Y-27632的终浓度为10μM。

五种原代细胞培养基方案各处理20例样本，按实施例3、4、5中所述方法进行样本处理和培养操作，培养3天后观察培养体系中形成细胞团结构的情况如表34所示。

表34、不同培养基培养情况

可以看到，利用方案A、B、C三种培养基都可以进行结直肠癌微肿瘤模型的培养，而方案D、E两培养基并不适合结直肠癌微肿瘤模型的形成。方案C培养基中形成的结直肠癌微肿瘤模型体积更大，较方案A和B培养基略有优势。

实施例13、不同原代细胞培养基形成的结直肠癌微肿瘤模型遗传背景比对

下述实施例中提及的DNA提取流程采用天根血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(DP304)进行。

下述实施例中提及的建库流程采用NEB DNA测序建库试剂盒(E7645)进行。

下述实施例中提及的高通量测序是指Illumina HiSeq X-ten测序平台。

本发明获取了实施例12得到的方案A、B、C三种培养基培养得到的结直肠癌微肿瘤模型与结直肠癌原发病灶样本，分别进行DNA提取，全基因组测序和拷贝数变异分析方法如下：

1、取结直肠癌原病灶组织块10mg和实施例12得到的方案A、B、C三种培养基培养得到的结直肠癌微肿瘤模型约10

2、原病灶和结直肠癌微肿瘤模型两组测序结果分别进行拷贝数变异分析(CNV)，比较原发结直肠癌肿瘤组织与各代结直肠癌微肿瘤模型之间的拷贝数变异，如图5所示。结果显示三种培养基培养得到的结直肠癌微肿瘤模型均可以很好的保留结直肠癌原发病灶的拷贝数变异特征。在维持原发病灶遗传背景方面，三种培养基并无显著差异。

实施例14、不同原代细胞培养基形成的结直肠癌微肿瘤模型细胞构成比对

本发明获取了实施例12得到的方案A、B、C三种培养基培养得到的结直肠癌微肿瘤模型与结直肠癌原发病灶样本，分别进行多重免疫荧光染色鉴定其细胞组成(方法见实施例7)。结果如表35所示。

表35、不同培养基中形成的结直肠癌微肿瘤模型细胞成分比较

可以看到，培养基A和B可以很好的保留原病灶中的肿瘤细胞，其形成的结直肠癌微肿瘤模型以较高纯度的肿瘤细胞形成。而培养基C除了能够维持原病灶中肿瘤细胞的活性以外，还可以很好的保存组织中存在的成纤维细胞和T细胞，在维持细胞多样性方面相较培养基A和B具有更大的优势。

因此本发明使用的结直肠癌实体瘤微肿瘤模型培养基(表9)可以最大程度的保护原病灶中的多种细胞类型，并在悬浮条件下促使其自发形成多细胞结构，构建极其接近原病灶特征的体外细胞模型。

实施例15、不同样本解离液培养成功率比较

本实施例中所有样本原代培养的操作方法流程均完全一致(参照前文所述)，仅样本解离液配方有所区别。进行测试的各种样本解离液见表36其中方案D为本发明中采用的配方，具体见表3。

表36、测试用样本解离液配方(10mL)

样本解离液现配现用。

选取10例结直肠癌实体瘤组织块重量超过100mg的样本，平均分成四份，分别用上述四种样本解离液，按实施例3、4、5中所述方法进行样本处理和培养操作。培养3天后观察培养体系中形成细胞团结构的情况如表37和表38所示：

表37、不同样本解离液结直肠癌微肿瘤形成数量统计

表38、不同样本解离液结直肠癌微肿瘤细胞团大小统计(以长径计单位μm)

可以看到，样本解离液配方对结直肠癌微肿瘤模型的形成能力以及微肿瘤细胞团的大小有一定的影响。本发明使用的样本解离液(表3)可以温和解离组织中的细胞，最大程度的保持细胞活性，提高微肿瘤模型的形成效率和质量。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。