基于智能控制的胞磷胆碱层析分离方法

技术领域

本发明属于生物化学分离技术领域，尤其涉及一种基于智能控制的胞磷胆碱层析分离方法。

背景技术

胞磷胆碱(CDP-C)为核苷衍生物，可改善头部外伤后或脑手术后意识障碍的意识状态及脑电图，促进脑卒中偏瘫病人的上肢运动功能的恢复，对促进大脑功能恢复、促进苏醒有一定作用。

胞磷胆碱(CDP-C)的制备方法如下：利用酿酒酵母的多种酶协同作用，使得5’-胞苷酸(5’-CMP)和磷酸胆碱生成胞磷胆碱(CDP-C)；此过程是一种需要提供能量ATP的多酶反应，它巧妙地利用了酵母糖酵解酶系，只要添加葡萄糖，磷酸缓冲液，酵母就会生成ATP的特点，从而使这供能生物反应不断进行；上述技术中，生物转化反应具有转化率高，无化学反应的异构体产生，生产成本低，只需要常温常压并在水相反应等优点；但是酵母在生物催化反应同时亦有许多细胞内溶物渗出，这样为后续分离纯化带来一定困难；一般生物转化反应以后，升温85-90℃，使酶灭活，蛋白质变性，然后用酵母离心机分离去除酵母和变性蛋白质；但是去除固体残渣后的反应液中除了含量CDP-C以外，尚有未反应的CMP，中间体胞苷二磷酸 (CDP)和胞苷三磷酸(CTP)，还有作为副产物的胞苷(CR)等产物；另外还有磷酸缓冲液，色素和可溶性蛋白质及酵母细胞自溶物等。

现阶段关于胞磷胆碱分离纯化的研究如下：文献1[上海师范大学生物系：生物化学与生物物理学报，1976.8(3)]、文献2[黄颖等：医药工业，1985.16(1)]以及文献3(邱蔚然等，中国专利CN 101096380 B)；其中文献1和文献2主要介绍了通过装有769活性炭的炭柱，将CDP-C、CMP、CDP、CTP、CR等核苷酸类物质全部吸附，而其他磷酸盐，可溶性蛋白质以及细胞自溶物大部分不被炭柱吸附，从而通过上样，水洗而去除，然后用10～50％乙醇加氨水或NaOH可以将CDP-C、CMP、CDP、CTP、CR、等洗脱下来，这样炭柱洗脱液就可以通过阴离子交换树脂层析分离；上述技术中，由于离子交换吸附强度不同，CR由于不吸附在柱上，上样、水洗时候已流出，洗脱时最先获得的是CDP-C，以后洗脱下来的是CMP、CDP、CTP 等混合物，但是阴离子交换树脂对色素等杂质吸附比较强，一般通过柱再生才能去除。文献3中通过大孔酚醛系弱酸树脂(HD-1)吸附除去大分子及阳离子，然后再用弱碱D315和强碱HZ201树脂串联层析分离；此种层析分离纯化设计比较巧妙，充分应用了生物转化溶液中各种物质特性，能获得纯度较高的CDP-C溶液，但是由于生物转化溶液中组分较多，分离周期较长(4～5天)而且需要至少每小时要检查流出液或洗脱液很多参数，需要熟练技术工人和化验员昼夜不停地检测分析；除此之外，整个工艺操作和分析繁杂，很容易造成人为误差，从而降低CDP-C的产品质量和收率。

发明内容

针对现有技术中存在的上述缺陷，本发明的目的是提供一种基于智能控制的胞磷胆碱层析分离方法，通过实时在线检测和智能化控制对层析分离工艺进一步改进，实现层析分离全流程无人化操作，过程控制更加精密便捷，从而提高工作效率，减少人为误差，降低劳动成本，使得层析分离过程更具追溯性，也保证了分离过程的高质量运行，并提高了CDP-C的产品质量和收率。本发明中通过核酸蛋白检测仪(简称检测仪)的实时在线检测，监控上样、水洗过程中是否有CDP-C流出，从而了解这一过程是否正常运转；通过定时在线取样和HPLC检测器分析，控制洗脱过程和收集CDP-C溶液。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明第一方面提供了一种基于智能控制的胞磷胆碱层析分离方法，包括以下步骤：

S10，炭柱上样，胞磷胆碱反应清液依次上样至由多根炭柱组成的柱层析系统中，经炭柱吸附后，采用核酸蛋白检测仪对每根炭柱流出液进行实时检测；

S20，炭柱水洗，上样结束后，对所述柱层析系统进行水洗，同时采用核酸蛋白检测仪对柱层析系统的流出液进行实时检测；

S30，炭柱洗脱，水洗结束后，采用洗脱液对柱层析系统进行分段洗脱，同时采用核酸蛋白检测仪和HPLC检测器对每根炭柱的流出液进行检测，直至所述柱层析系统的流出液中没有CDP-C；

S40，阴柱上样、水洗、洗脱，经步骤S30得到的炭柱洗脱液上样至阴离子交换柱中，然后对所述阴离子交换柱进行水洗、洗脱，通过HPLC检测器对阴离子交换柱的流出液进行定时检测，并收集CDP-C溶液，再将CDP-C溶液浓缩、结晶、干燥。

优选地，所述步骤S10中：

所述柱层析系统由3～5根炭柱串联或叠加组成，每根炭柱之间设有均设有单向阀；和/或

所述柱层析系统的多根炭柱经浓度为1mol/L的盐酸浸泡处理；和/或

所述炭柱上样过程如下：所述胞磷胆碱反应清液先进入所述柱层析系统的第一根炭柱，当第一根炭柱的流出液A260≥0.5时，所述胞磷胆碱反应清液再进入第二根炭柱，以此类推，直至所述柱层析系统的最后一根炭柱的流出液A260≥0.5时，上样结束。

优选地，所述步骤S20中：

所述炭柱水洗过程中，采用去离子水或纯化水对柱层析系统进行水洗，所述去离子水或纯化水的体积为所述柱层析系统中炭柱体积的5～10倍；和/或

所述炭柱水洗过程中，当柱层析系统流出液中A260＜0.5时，排废，反之则收集流出液。

优选地，所述步骤S30中：

所述洗脱液采用质量百分浓度为10～15％的乙醇和浓度为0.1mol/L的NaOH 溶液；和/或

所述炭柱洗脱过程如下：在分段洗脱中，采用采用核酸蛋白检测仪和HPLC检测器对所述柱层析系统的每根炭柱的流出液进行实时检测；当所述柱层析系统第一根炭柱的流出液中A260＜0.5时，结束对第一根炭柱的洗脱，以此类推，直至所述柱层析系统最后一根炭柱的流出液中A260＜0.5时，洗脱结束。

优选地，所述步骤S40中：

所述阴离子交换柱采用盐酸或NaOH溶液进行处理；和/或

所述阴柱上样过程中，采用核酸蛋白检测仪实时检测所述阴离子交换柱的流出液，当A260＜0.5时，则排废，反之则上样结束；和/或

所述阴柱水洗过程中，采用去离子水或纯化水对所述阴离子交换柱进行水洗，所述去离子水或纯化水的体积为所述阴离子交换柱中树脂体积的5～10倍；和/或

所述阴柱水洗过程中，采用核酸蛋白检测仪实时检测所述阴离子交换柱的流出液，当A260＜0.5时，则排废，反之则收集流出液；和/或

所述阴柱洗脱过程如下：采用质量百分浓度为1～3％的NaCl进行洗脱，通过 HPLC检测器对阴离子交换柱的流出液定时检测，收集浓度≥1g/L的CDP-C溶液。

本发明第二方面提供了一种基于智能控制的胞磷胆碱层析分离方法，包括以下步骤：

S11，上样，将胞磷胆碱反应清液依次上样至由弱酸阳离子交换柱和强碱阴离子树脂单元串联的柱层析系统中，经柱层析系统吸附后，采用核酸蛋白检测仪对柱层析系统的流出液进行实时检测；

S21，水洗，上样结束后，对所述柱层析系统进行水洗，同时采用核酸蛋白检测仪对柱层析系统的流出液进行实时检测；

S31，洗脱，水洗结束后，采用洗脱液对柱层析系统的强碱阴离子树脂单元进行分段洗脱，通过HPLC检测器对所述强碱阴离子树脂单元的流出液进行定时检测，并收集CDP-C溶液，再将CDP-C溶液浓缩、结晶、干燥。

优选地，所述步骤S11中：

所述柱层析系统中，所述弱酸阳离子交换柱与所述强碱阴离子树脂单元之间设有单向阀；所述强碱阴离子树脂单元由多根强碱阴离子交换柱串联或叠加组合而成，所述强碱阴离子交换柱之间均设有单向阀；和/或

所述胞磷胆碱反应清液的流速为200～400ml/h；和/或

所述上样过程如下：所述胞磷胆碱反应清液先进入弱酸阳离子交换柱，当弱酸阳离子交换柱的流出液A260≥0.5时，所述胞磷胆碱反应清液再进入所述强碱阴离子树脂单元的第一根强碱阴离子交换柱中，当第一根强碱阴离子交换柱的出液 A260≥0.5时，所述胞磷胆碱反应清液进入所述强碱阴离子树脂单元的第二根强碱阴离子交换柱中，以此类推，直至所述柱层析系统的最后一根强碱阴离子交换柱的流出液A260≥0.5时，上样结束。

优选地，所述强碱阴离子树脂单元由3～5根强碱阴离子交换柱串联或叠加组合而成。

优选地，所述步骤S21中：

所述水洗过程中采用去离子水或纯化水对柱层析系统进行水洗，所述去离子水或纯化水的体积为所述弱酸阳离子交换柱的体积的5～10倍；和/或

所述水洗过程中，当柱层析系统流出液中A260＜0.5时，排废，反之则收集流出液。

优选地，所述步骤S31中：

所述洗脱液的流速为30～60L/h；和/或

所述洗脱过程如下：采用质量百分浓度为1～3％、pH为1～3的NaCl溶液作为洗脱液进行分段洗脱，并通过HPLC检测器对所述强碱阴离子树脂单元的每一根强碱阴离子交换柱的流出液定时取样检测，当所述强碱阴离子树脂单元的流出液中检测出CDP-C且CDP-C的浓度≥1g/L时，收集CDP-C溶液。

本发明的有益效果如下：

1、本发明的基于智能控制的胞磷胆碱层析分离方法，通过实时在线检测和智能化控制对层析分离工艺进一步改进，实现层析分离全流程无人化操作，过程控制更加精密便捷，从而提高工作效率，减少人为误差，降低劳动成本，使得层析分离过程更具追溯性，也保证了分离过程的高质量运行，并提高了CDP-C的产品质量和收率；

2、本发明的基于智能控制的胞磷胆碱层析分离方法，通过核酸蛋白检测仪的实时在线检测，监控上样、水洗过程中是否有CDP-C流出，从而了解上述过程是否正常运转；通过定时在线取样和HPLC检测器检测，控制洗脱过程和收集CDP-C溶液；

3、本发明第一方面的基于智能控制的胞磷胆碱层析分离方法采用多根炭柱串联或叠加上样和洗脱，前者减少了反应液对其污染，可增加10％～15％上样量，后者可减少洗脱杂质，提高分离效率，澄清度T660≥90％；本发明第二方面的基于智能控制的胞磷胆碱层析分离方法，采用多根阴柱串联或叠加上样和洗脱，前者可增加10％～15％上样量，后者分离纯度≥99.2％，收率≥84.2％。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明基于智能控制的胞磷胆碱层析分离方法所用的多根炭柱/强碱阴离子交换柱叠加组成的柱层析系统的结构示意图；

图2为本发明基于智能控制的胞磷胆碱层析分离方法所用的多根炭柱/强碱阴离子交换柱串联组成的柱层析系统的结构示意图；

图3为本发明第一方面提供的智能控制的胞磷胆碱层析分离方法流程控制图。

具体实施方式

为了能更好地理解本发明的上述技术方案，下面结合实施例进一步说明本发明的技术方案。

结合图1、图2、图3所示，本发明第一方面和第二方面提供的一种基于智能控制的胞磷胆碱层析分离方法，均是采用在线检测和智能化控制工艺；

其中本发明第一方面是对现有的炭柱层析方法进行改进的，其总体构想为：当离心后去除酵母的胞磷胆碱反应清液或再经调酸、碱pH沉淀蛋白质的胞磷胆碱反应清液，通过炭柱，使CDP-C及其CMP、CDP、CTP、CR等几乎全部吸附在炭柱上，本发明中将原有的一根炭柱，改良为3～5根串联或叠加组成的柱层析系统，通过炭柱上样、炭柱水洗、炭柱洗脱后直接接阴离子交换柱上样、水洗和洗脱，最终得到纯度较高的CDP-C溶液；在上述过程中在每根炭柱和阴离子交换柱的出口流出液处连接核酸蛋白检测仪和HPLC检测器，利用核酸蛋白检测仪实时在线检测和控制炭柱上样、炭柱水洗和阴柱上样、阴柱水洗等过程，并通过在线定时取样和 HPLC检测器检测控制炭柱洗脱、阴柱洗脱和收集过程；本发明一种基于智能控制的胞磷胆碱层析分离方法整个过程中利用核酸蛋白检测仪的实时在线检测、在线定时取样和HPLC检测器检测，并通过控制系统控制各个过程平稳运行。

本发明第二方面是对文献3所采用的HD-1弱酸树脂-D301(或D345)弱碱树脂-201×7(HZ201)强碱树脂的组合进一步改进，其总体构想为：采用由弱酸阳离子交换柱和强碱阴离子树脂单元串联的柱层析系统，弱酸阳离子交换柱可采用HD-1，强碱阴离子树脂单元可采用多个由201×7(HZ201)串联(参见图1)或叠加(参见图2)组合而成，改进后胞磷胆碱反应清液通过上述的柱层析系统后，蛋白质、色素、阳离子吸附在HD-1树脂柱中，CMP和CDP-C吸附在HZ201树脂中，采用5～ 10倍HD-1体积的去离子水或纯化水进行水洗，其作用在于：一是顶洗柱中残留的反应液，二是将不吸附的杂质冲洗干净；水洗结束，断开HD-1柱，单独对由201×7 串联或叠加的强碱阴离子树脂单元洗脱；在上述过程中在弱酸阳离子交换柱和每根阴离子交换柱的出口流出液处连接核酸蛋白检测仪和HPLC检测器，利用核酸蛋白检测仪实时在线检测和控制上样、水洗过程，并通过在线定时取样和HPLC检测器检测控制洗脱和收集过程。

上述所用的核酸蛋白检测仪可采用国内已有的核酸蛋白检测仪，比如上海沪西HD-21-1，量程为0.1-2(单位)；在上样、水洗过程中由于流出液CDP-C浓度较低，可以直接实现在线检测；而在洗脱过程，由于CDP-C浓度较高，需要稀释500-1000 倍才能测定，此时需要智能机械臂定时(一般是每小时)在线取样、稀释，再加入带有自动进样装置的HPLC检测器测定。检测数据通过控制系统114计算，并转换为控制信号，CDP-C浓度(g/L)以及其峰面积％(纯度)等参数，根据流速、时间等作出洗脱曲线图，并自动收集所需分离溶液；其中CDP-C浓度C＝CDP-C的实测图谱峰面积×CDP-C的标准浓度/CDP-C的标准图谱峰面积。

结合图1、图2所示，本发明第一方面提供的一种基于智能控制的胞磷胆碱层析分离方法，利用胞磷胆碱层析分离系统对胞磷胆碱反应清液进行层析分离，其中胞磷胆碱层析分离系统包括柱层析系统、上样机构、水洗机构、洗脱机构、检测机构、控制系统115、阴离子交换柱和收集器。

结合图1或图2所示，柱层析系统由多根炭柱串联或叠加组合而成(比如3～ 5根炭柱串联或叠加组成，本发明以4根炭柱1#、2#、3#、4#为例)，每根炭柱之间设有单向阀，即1#、2#、3#、4#之间分别设置单向阀3、5、7、9(参见图1或图2)；每根炭柱均采用经浓度为1mol/L的盐酸浸泡处理4小时或过夜；柱层析系统的每根炭柱的进口段均与上样机构、水洗机构、洗脱机构连通，其管道上均设有单向阀，即单向阀1、10、11、12(参见图1或图2)；每根炭柱的出口处还设有排废管道，排废管道上均设有单向阀，即单向阀2、4、6、8(参见图1或图2)。

结合图1或图2所示，控制系统115包括控制上样机构的上样控制器111、控制水洗机构的水洗控制器112以及控制洗脱机构的洗脱控制器113；其中上样控制器111根据控制系统115的上样指令进行将胞磷胆碱反应清液泵入柱层析系统中，上样指令包括上样时间、上样量、泵的流速以及单向阀的启闭等；水洗控制器112 根据控制系统115的水洗指令将去离子水泵入柱层析系统中进行水洗，其中水洗指令包括单向阀的启闭、去离子水的使用量、泵的流速等；洗脱控制器113根据控制系统115的洗脱指令将洗脱液泵入柱层析系统中进行洗脱，洗脱指令包括洗脱液的种类、浓度以及使用量、泵的流速、单向阀的启闭等；收集器110根据控制系统115 的收集指令将洗脱出来的核苷酸收集至对应容器中。

结合图1或图2所示，检测机构包括分别与根炭柱出液口连通的核酸蛋白检测仪14(简称检测仪)和第一HPLC检测器15以及与最后一根炭柱出液口连通的第二HPLC检测器16；第二HPLC检测器与最后一根强炭柱4#出液口的管道上设有单向阀9。

阴离子交换柱与柱层析系统串联，即与柱层析系统最后一根炭柱4#的出液口连接，同时该阴离子交换柱的进口端与水洗机构、洗脱机构连通，其管道上同样设有单向阀；该阴离子交换柱的出液口分别与第二HPLC检测器16和核酸蛋白检测仪14连接；其中阴离子交换柱可采用树脂201×8，或与之相近的其他牌号如：717 等。

检测机构对每根炭柱以及阴离子交换柱的流出液进行检测，并将检测信息传递给控制系统115；控制系统115接收检测机构的检测信息，并根据检测信息生成水洗指令、洗脱指令和收集指令；控制系统115分别与上样机构、水洗机构、洗脱机构、柱层析系统、收集器、检测机构通过电信号来连接。

结合图1或图2所示，胞磷胆碱层析分离系统还包括监控系统114，该监控系统114包括用于监控胞磷胆碱反应清液的层析分离过程的摄像装置以及与摄像装置连接的显示器。

结合图1、图2、图3所示，本发明第一方面提供的一种基于智能控制的胞磷胆碱层析分离方法，包括以下步骤：

S10，炭柱上样，胞磷胆碱反应清液依次上样至由多根炭柱组成的柱层析系统中，经炭柱吸附后，采用核酸蛋白检测仪对每根炭柱流出液进行实时检测；

具体过程如下：结合图1或图2所示，胞磷胆碱反应清液依次上样至由多根炭柱组成的柱层析系统中，其中上样控制器111控制单向阀1、2开启，同时采用核酸蛋白检测仪14对炭柱1#的流出液进行实时监测，当炭柱1#的流出液的A260≥0.5 时，上样控制器111自动关闭单项阀2，开启单向阀3、单项阀4，继续第二根炭柱 2#上样，当炭柱1#的流出液的A260≥0.5时，上样控制器111自动关闭单项阀4，开启单向阀5、单向阀6，以此类推，直至第四根炭柱1#的流出液的A260≥0.5时，上样结束；

此种操作可使得炭柱的柱效最高，且胞磷胆碱反应清液不是一开始就进入柱层析系统的每根炭柱1#、2#、3#、4#中的，而是炭柱1#吸附饱和后(即炭柱1#的流出液A260＜0.5时，其流出液的纯度差，浓度低，几乎不含CDP-C及其CMP、CDP、 CTP、CR等，当炭柱1#的流出液A260≥0.5时，流出液纯度好，浓度较高)，再连接炭柱2#，炭柱2#吸附饱和后再连接炭柱3#，炭柱3#吸附饱和后再连接炭柱4#，如此炭柱4#柱只约通过1/4胞磷胆碱反应清液，炭柱3#柱只约通过2/4胞磷胆碱反应清液，炭柱2#柱只约通过3/4胞磷胆碱反应清液，故而炭柱4#柱受反应液中其他物质污染最少，3#、2#柱污染也相对减少，这样柱效就有很大程度提升。当然，若无在线检测和自动控制靠人工操作是较难实施的，则本发明以前一直是所有柱或合并成一根，或两根柱串联上样，最终直接监测4#柱出口流出液情况，最多也就顺便测定一下其它柱流出情况，以便记录再案，提供参考。

S20，炭柱水洗，上样结束后，对柱层析系统进行水洗，同时采用核酸蛋白检测仪对柱层析系统的流出液进行实时检测；

具体过程如下：上样结束后，水洗控制器112控制水洗机构对柱层析系统进行水洗，在水洗过程中，采用5～10倍炭柱体积的去离子淋洗后自动停止水洗，同时采用核酸蛋白检测仪实时监测柱层析系统的最后一根炭柱4#的流出液，当流出液的 A260＜0.5时，排废，反之则收集流出液，同时说明上样量过多，应对上样量加以调整，可将信息反馈给控制系统115。

S30，炭柱洗脱，水洗结束后，采用洗脱液对柱层析系统进行分段洗脱，直至柱层析系统的流出液不再含有CDP-C；

具体过程如下：在水洗结束后，可采用质量百分浓度为10～15％的乙醇和浓度为0.1mol/L的NaOH溶液作为洗脱液，洗脱控制器113控制洗脱机构对柱层析系统进行分段洗脱，同时采用核酸蛋白检测仪14和第一HPLC控制器对柱层析系统的每根炭柱(1#、2#、3#、4#)的流出液进行实时检测；在炭柱洗脱过程中，打开单向阀1、3、5、7、9，当第一根炭柱1#的流出液中A260＜0.5时，则结束对第一根炭柱1#的洗脱，关闭单向阀1、3，打开单向阀10，当第二根炭柱2#的流出液中A260 ＜0.5时，则结束对第二根炭柱2#的洗脱，关闭单向阀5，打开单向阀11，以此类推直至最后一根炭柱4#的流出液中A260＜0.5时，分段洗脱结束；在上述分段洗脱的同时，可采用智能机械臂在线取样、稀释并通过第二HPLC控制器16定时对柱层析洗脱最后一根炭柱4#的流出液检测，收集CDP-C的色谱图的出峰时间以及浓度和峰面积，当CDP-C的浓度≥0.5g/L时，直接串联阴离子交换柱进行阴柱的上样、水洗和洗脱。

S40，阴柱上样、水洗、洗脱，经步骤S30得到的炭柱洗脱液上样至阴离子交换柱中，然后对阴离子交换柱进行水洗、洗脱，通过HPLC检测器定时检测阴离子交换柱的流出液，并收集CDP-C溶液，再将CDP-C溶液浓缩、结晶、干燥。

具体过程如下：当炭柱洗脱结束后，直接串联阴离子交换柱上样，其中阴离子交换柱采用盐酸或NaOH溶液进行处理，一般转换成Cl型；在阴柱上样过程中，采用核酸蛋白检测仪对阴离子交换柱的流出液实时检测，当A260＜0.5时，则排废，反之则收集流出液，同时也说明了阴离子交换柱吸附饱和需要加大阴离子交换柱的用量或适当调整，可将信息反馈给控制系统115。阴柱上样完毕后，采用5～10倍阴离子交换柱中树脂体积的去离子水或纯化水对阴离子交换柱进行水洗后自动停止，同时采用核酸蛋白检测仪对阴离子交换柱的流出液实时检测，当A260＜0.5时，则排废，反之则收集流出液，同时也说明了阴离子交换柱吸附饱和需要加大阴离子交换柱的用量或适当调整，可将信息反馈给控制系统115。水洗结束后，采用质量百分浓度为1～3％的NaCl进行洗脱，同时可采用智能机械臂在线取样稀释并通过第二HPLC检测器16对阴离子交换柱的流出液定时检测，收集浓度≥1g/L的CDP-C 溶液；之后将收集的CDP-C溶液通过浓缩、结晶、干燥得到99％以上的CDP-C结晶。

CDP-C洗脱完毕后，采用pH＝2.0、质量百分浓度3～4％的NaCl溶液继续洗脱，流出液为CMP、CDP、CTP混合物，可浓缩至5～10％浓度可作为下批次原料使用。

结合图1、2所示，本发明第二方面所提供的一种基于智能控制的胞磷胆碱层析分离方法，利用胞磷胆碱层析分离系统对胞磷胆碱反应清液进行层析分离，其中胞磷胆碱层析分离系统包括柱层析系统、上样机构、水洗机构、洗脱机构、检测机构、控制系统115以及收集器。其中控制原理与本发明第一方面基本相同，区别点主要在于：本发明第二方面所用的柱层析系统是采用弱酸阳离子交换柱(比如HD-1) 与强碱阴离子树脂单元串联组合而成，其中弱酸阳离子交换柱与强碱阴离子树脂单元之间设有单向阀；强碱阴离子树脂单元由多根强碱阴离子交换柱串联或叠加组合而成，强碱阴离子交换柱之间均设有单向阀，结合图1、图2，强碱阴离子树脂单元采用多根HZ201，比如3～5根HZ201，下述方法中以4根HZ201为例进一步介绍，而第一方面所用的是由多根炭柱串联或叠加组合成柱层析系统后再串联阴离子交换柱。

结合图1、图2所示，本发明第二方面提供的一种基于智能控制的胞磷胆碱层析分离方法，包括以下步骤：

S11，上样，将胞磷胆碱反应清液依次上样至由弱酸阳离子交换柱和强碱阴离子树脂单元串联的柱层析系统中，经柱层析系统吸附后，采用核酸蛋白检测仪对柱层析系统的流出液进行实时检测；

具体过程如下：结合图1或图2所示，胞磷胆碱反应清液依次上样由弱酸阳离子交换柱(重生后的HD-1)和强碱阴离子树脂单元串联的柱层析系统中，弱酸阳离子交换柱与强碱阴离子树脂单元之间设有单向阀；强碱阴离子树脂单元采用多根强碱阴离子交换柱(由HZ201填充的1#、2#、3#、4#)串联或叠加组合而成，强碱阴离子交换柱之间设有单向阀，即1#、2#、3#、4#之间均设有单向阀3、5、7、 9；在上样过程中，胞磷胆碱反应清液的流速为200～400ml/h，胞磷胆碱反应清液先进入弱酸阳离子交换柱，蛋白质、色素、阳离子等被吸附在弱酸阳离子交换柱中，当弱酸阳离子交换柱的流出液A260≥0.5时，胞磷胆碱反应清液再进入强碱阴离子树脂单元的第一根强碱阴离子交换柱1#中，当第一根强碱阴离子交换柱1#的流出液A260≥0.5时，胞磷胆碱反应清液进入强碱阴离子树脂单元的第二根强碱阴离子交换柱2#中，以此类推，直至柱层析系统的最后一根强碱阴离子交换柱4#的流出液A260≥0.5时，上样结束。

S21，水洗，上样结束后，对柱层析系统进行水洗，同时采用核酸蛋白检测仪对柱层析系统的流出液进行实时检测；

具体过程如下：上样结束后，水洗控制器112控制水洗机构对柱层析系统进行水洗，在水洗过程中，采用5～10倍弱酸阳离子交换柱体积的去离子水或纯化水淋洗后自动停止，同时采用核酸蛋白检测仪实时检测柱层析系统的最后一根强碱阴离子交换柱4#的流出液，当流出液的A260＜0.5时，排废，反之则收集流出液，同时说明上样量过多，应对上样量加以调整，可将信息反馈给控制系统115。

S31，洗脱，水洗结束后，采用洗脱液对柱层析系统的强碱阴离子树脂单元进行分段洗脱，通过HPLC检测器对强碱阴离子树脂单元的流出液进行定时检测，并收集CDP-C溶液，再将CDP-C溶液浓缩、结晶、干燥。

具体过程如下：水洗结束后，断开弱酸阳离子交换柱，用质量百分浓度为1～ 3％、pH为1～3的NaCl溶液作为洗脱液对强碱阴离子树脂单元(强碱阴离子交换柱1#、2#、3#、4#)进行分段洗脱，控制洗脱液的流速为30-60L/h；在分段洗脱过程中，洗脱控制器113打开单向阀1、3、5、7、9，采用第一HPLC检测器和第二 HPLC检测器分别对强碱阴离子交换柱1#、2#、3#、4#的流出液进行检测，当第一根强碱阴离子交换柱1#流出液中检测出CDP-C的浓度＜0.05g/L时，则结束对第一根强碱阴离子交换柱1#的洗脱，关闭单向阀1，开启单向阀10，当第二根强碱阴离子交换柱2#流出液中检测出CDP-C的浓度＜0.05g/L时，则结束对第二根强碱阴离子交换柱2#的洗脱，关闭单向阀1，开启单向阀10，以此类推，直至最后一根强碱阴离子交换柱4#流出液中A260＜0.5时，分段洗脱结束，同时在分段洗脱过程中，通过第二HPLC检测器定时取样检测CDP-C的浓度，当CDP-C的浓度≥1g/L时收集CDP-C溶液，之后将收集的CDP-C溶液通过浓缩、结晶、干燥得到99％以上的 CDP-C结晶。

CDP-C洗脱完毕后，采用pH＝2.0、质量百分浓度3～4％的NaCl溶液继续洗脱，流出液为CMP、CDP、CTP混合物，可浓缩至5～10％浓度可作为下批次原料使用。

本发明第一方面采用多根炭柱串联或叠加上样和洗脱，前者减少了反应液对其污染，可增加10％～15％上样量，后者可减少洗脱杂质，提高分离效率，澄清度T660 ≥90％；本发明第二方面采用多根阴柱串联或叠加上样和洗脱，前者可增加10％～ 15％上样量，后者分离纯度≥99.2％，收率≥84.2％。

下面结合具体的例子对本发明的基于智能控制的胞磷胆碱层析分离方法进一步介绍。

实施例1

本实施例中采用改进后的多根炭柱串联或叠加分离纯化CDP-C反应液后再经过阴柱的层析分离方法；

本实施例中所用的基于智能控制的胞磷胆碱层析分离方法如下：

(1)CDP-C生物转化

在2.5m

(2)去除酵母和酸、碱蛋白

反应结束，升温至85～90℃，保温20min，然后迅速冷至40℃以下，用酵母离心机去除酵母，再分别调pH＝10.5～11.0、pH＝2.5～3.0，分别离心去除酸、碱蛋白，得到胞磷胆碱反应清液。

(3)炭柱上样、水洗和洗脱

在4根￠300×2500mm柱中装填150L 769炭，用1mol/L盐酸浸泡4小时，或过夜后，用500L纯水洗至pH＝2.5～3.0，并将4根炭柱(1#、2#、3#、4#)串联(如图2所示)或叠加(如图1所示)组合成柱层析系统，且每根炭柱的出口与核酸蛋白检测仪连接；然后将胞磷胆碱反应清液的pH调节至2.0～2.5后，依次上样至柱层析系统的炭柱1#、2#、3#、4#中，具体为：打开单向阀1、2，当第一根炭柱1# 的流出液A260≥0.5时，表示该炭柱1#吸附CDP-C已经饱和。此时将自动关闭单向阀2，开启单向阀3、4。胞磷胆碱反应清液经过炭柱1#、2#串联上样，当第二根炭柱2#的流出液A260≥0.5时，则将自动关闭单向阀4，开启单向阀5、6。当第3 根炭柱饱和时，则将自动关闭阀单向6，开启单向阀7、8；直至第4根炭柱饱和，炭柱上样结束；

然后用500L纯水洗涤柱层析系统。洗涤后，用15％乙醇-0.1mol/L NaOH洗脱。此时当炭柱1#柱出口A260≤0.5时，关闭单向阀1、2，开启单向10；当炭柱2#的 A260≤0.5时，关闭单向阀4、10，开启单向阀11；以此类推，直至炭柱4#≤0.5时，停止洗涤。炭柱洗脱液应连接智能机械臂，HPLC检测器、控制系统等，并计算有关参数，最终炭柱收率90％，CDP-C约29.7Kg，收集液透光率T660≥90％，色素 A430＝0.2。

4、阴柱上样、水洗和洗脱

在炭柱洗脱过程中，当炭柱4#出口A260≥0.5时，连接阴离子交换柱，直接上样，阴离子交换柱用量300L，树脂201×8，或与之相近的其他牌号如：717等；

树脂再生用1-2mol/L HCL，或NaOH，一般转换成CL型，上样时阴离子交换柱出口用核酸蛋白检测仪检测，A260≤0.5，若A260＞0.5，说明树脂交换吸附即将饱和需要加大树脂用量或作适当调整。上样完毕，用1500-2000L去离子水洗。

水洗结束，用1-3％NaCL洗脱，流速30-60L/h，出口用智能机械臂自动定时取样和第二HPLC检测器检测，每小时取样一次，智能机械臂稀释500-1000倍，放入第二HPLC检测器自动进样器，经第二HPLC检测器检测，控制系统换算成样品浓度和纯度(峰面积％)，其结果：浓度5％(W/V)，纯度96％，收集体积80L，收率约为95％，CDP-C约28.2Kg，

继续洗脱，流出液为CMP、CDP、CTP混合物，浓缩至5-10％浓度可作为下批次原料使用。

5、浓缩、结晶、干燥

洗脱液经减压升膜浓缩，可得到浓度40％(W/W)，CDP-C浓缩液，加活性炭脱色过滤，调pH7.5-8.0，然后升温至50℃，缓缓加入2-2.5倍95％乙醇，搅拌0.5-1 小时，便可获得CDP-C钠结晶，过滤后60℃真空干燥即可获得27KgCDP-C产品，含量99.2％。

实施例2

本实施例采用本发明第二方面提供胞磷胆碱层析分离系统，即柱层析系统采用弱酸阳离子交换柱(一根HD-1)与由4根HZ201叠加构成的强碱阴离子树脂单元串联组合而成；

4400mlCDP-C反应液，含CDP-C38g，CMP5.5g,磷酸盐165g，磷酸胆碱44g，硫酸镁10.7g，蛋白质118g。按顺序通过再生后的HD-1(H+)树脂1000ml(简称柱1)，柱尺寸为60ⅹ1000mm,每层装填树脂200ml(以下简称柱2)，HZ201树脂装填方式按图1，叠加方法。然后与HD-1柱串联上样，流速200-400ml/h。上样时开启单向阀1、2，1#的流出液经过核酸蛋白检测仪检测，当A260≥0.5时，关闭单向阀2，开启单向阀3、4，当2#的流出液A260≥0.5时，关闭单向阀4，开启单向阀5、6，当3#的流出液A260吸收值≥0.5时，关闭单向阀6，开启单向阀7、8，当4#流出液 A260≥0.5时，停止上样，由于工艺过程事先设计，并经实验验证，一般最终单阀8 出口的A260值不会≥0.5，故而会直至上样结束。然后用5000ml纯水串联水洗柱1 和柱2.

水洗结束，断开柱1，开启柱2阀单向1、3、5、7、9，关闭单向阀8，先用 4000ml、pH2.0，1％的氯化钠溶液洗柱2，当第一HPLC检测器检测到1#流出液中 CDP-C浓度≤0.5g/L时，关闭单向阀1，开启单向阀10，当第一HPLC检测器检测到2#出口流出液中CDP-C浓度≤0.5g/L时，关闭单向阀5，开启单向阀11，当第一 HPLC检测器检测到3#出口流出液中CDP-C浓度≤0.5g/L时，关闭单向阀7，开启单向阀12，直至洗脱CDP-C结束。

与此同时，第二HPLC检测器检测单向阀9出口，收集CDP-C浓度≥1g/L的部分。通过浓缩结晶干燥，最终获得32gCDP-C钠盐，收率84.2％，纯度99.2％。

CDP-C洗脱结束，改用pH3.0，3％氯化钠洗脱柱2，步骤方法同上。最终获得 CMP5g,收率91％。

实施例3

将柱2由叠加改为串联，按图2排列组合，所有操作步骤同上。

柱2使用串联方式，最终可获得实施例4相同效果；只是投料大，使用树脂多，则用串联方式较好，投料少，使用树脂量少时，叠加方式较好。

按上样量4400mlCDP-C反应液，含CDP-C38g，CMP5.5g进行层析分离纯化，最终可获得31.8gCDP-C，收率83.7％，纯度99％。获得CMP4.9g，收率89％。

本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求书范围内。