一种实时荧光核酸恒温扩增检测试剂合格性检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体为一种实时荧光核酸恒温扩增检测试剂合格性检测方法。

背景技术

新型冠状病毒(2019Novel Coronavirus,2019-nCoV)是一种RNA病毒，它的遗传物质是核糖核酸，其特异性核酸序列是区分这一病毒与其他病原体的标志物。而新型冠状病毒核酸检测目的就是为了在感染患者体内找到该病毒的存在。新型冠状病毒检测目前普遍采用的是核酸检测方法包括病毒RNA提取和第二代实时荧光定量PCR技术。实时荧光定量PCR技术已广泛应用于遗传病分子诊断、临床检验、动植物进出口检疫、食品安全监测、土壤微生物检测和亲子鉴定等众多领域。由于血液、食物、土壤等样本中含有大量抑制因子，如血红蛋白、高铁血红素、乳铁蛋白、腐植酸等，对常规Taq DNA聚合酶将产生明显的抑制作用。因此，必须先从这些待测样本分离提取核酸，然后用于 PCR扩增。核酸提取是核酸检测第一步，也是分子生物学中关键方法之一。为下游核酸检测提供基础，提取质量和完整性直接影响临床研究或诊断。

一般核酸提取过程包括两步：样品的裂解和纯化，传统的提取试剂由于取得率相对较低，且步骤较为繁杂，给提取工作带来一定影响，难以得到合格核酸样品，且在目前核酸检测应用最广的实时荧光PCR技术中，试剂大都不是即用型的，造成PCR检测普遍存在操作复杂、费事等问题，使用前需要有复杂的配置工作，容易造成试验的误差甚至失败，另外在检测时多在试验室环境下，在检测个阶段对仪器依赖性较高，不利于快速处理大量试验样本，为此我们提出一种实时荧光核酸恒温扩增检测试剂合格性检测方法以解决上述提出的问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种实时荧光核酸恒温扩增检测试剂合格性检测方法，基于对实时荧光核酸恒温扩增检测试剂灵敏度和稳定度的检测，实现对实时荧光核酸恒温扩增检测试剂合格性的检测，保证了实时荧光核酸恒温扩增检测试剂的有效性。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种实时荧光核酸恒温扩增检测试剂合格性检测方法，包括：

S1：利用实时荧光核酸恒温扩增检测试剂在多种设定环境下检测病毒样本，获得每种设定环境对应的测定结果，基于所述测定结果获得对应的试剂灵敏度和试剂稳定度；

S2：基于所述试剂灵敏度和所述试剂稳定度获得对应的合格性测定结果。

优选的，所述的一种实时荧光核酸恒温扩增检测试剂合格性检测方法，包括：所述荧光核酸恒温扩增检测试剂包括核酸裂解液、扩增反应试剂、扩增检测试剂以及荧光材料；

所述核酸裂解液包括：GuHCl、铵盐、乙二胺四乙酸、三羟甲基氨基甲烷、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、表面活性剂以及缓冲液，PH为4-4.5；

所述扩增反应试剂包括：缓冲液、解旋酶、氯化镁、甲酰胺、亚精胺、 UvsX蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白、dNTPs、Tris碱以及DNA聚合酶，PH 为7-7.2；

所述扩增检测试剂包括：Tris、EDTA、用于扩增靶核酸的引物对和探测靶核酸探针；

所述荧光材料为SYBR-green-I、SYTO-13、SYTO-82中的一种；

所述核酸裂解液包含0.5-2MGuHCl、0.01-2M铵盐、5-50mM乙二胺四乙酸、 10-100M三羟甲基氨基甲烷、1-20mM乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、0.1-5％表面活性剂以及20-500mM缓冲液，PH为4-4.5；

所述扩增反应试剂中的表面活性剂采为十二烷基硫酸钠、溴化十六烷基甲三胺、聚乙烯吡咯烷酮、月桂酰基氨酸钠中的任意一种。

优选的，所述的一种实时荧光核酸恒温扩增检测试剂合格性检测方法，包括：所述核酸裂解液中铵盐选自由硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、溴化铵和碘化铵组成的组。

优选的，所述的一种实时荧光核酸恒温扩增检测试剂合格性检测方法，包括：所述核酸裂解液中表面活性剂选自由Span-80、Span-20、十二烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸锂、十二烷基硫酸钠、Tween 20、Triton X-100、NP40、十二烷基肌氨酸钠和CTAB组成的组。

优选的，所述的一种实时荧光核酸恒温扩增检测试剂合格性检测方法，包括：所述核酸裂解液中缓冲液由氯化锂、十二烷基硫酸锂、Triton X-100、乙二胺四乙酸、柠檬酸以及水组成。

优选的，所述的一种实时荧光核酸恒温扩增检测试剂合格性检测方法，包括：所述扩增反应试剂包括：1-100mM缓冲液、10ng/μL解旋酶、1-100mM 氯化镁、0.5ng/μl甲酰胺、0.5ng/μl亚精胺、50-300ng/μlUvsX蛋白、 50-300ng/μlUvsY蛋白、50-300ng/μl单链结合蛋白、50mM-100mM dNTPs、 10mM-0mM Tris碱以及5-100ng/μl；5-100ng/μlDNA聚合酶；

所述扩增反应缓冲液包含Tris-HCl、MgCl2、PVP40、KCl、甘油、醋酸锌二水合物、dNTP、NTP，pH为7.0。

优选的，所述的一种实时荧光核酸恒温扩增检测试剂合格性检测方法，包括：所述扩增检测试剂中的引物包括基于RNA聚合酶启动子序列的正向引物和基于非RNA聚合酶启动子序列的反向引物；

所述正向引物包含位于5'末端的RNA聚合酶启动子序列和位于3'末端的正向靶核酸结合序列，所述反向引物包含反向靶核酸结合序列。

优选的，所述的一种实时荧光核酸恒温扩增检测试剂合格性检测方法，包括：所述扩增检测试剂中的探针包括与靶核酸特异性互补的5’特异性序列和3’polyA序列。

所述的一种实时荧光核酸恒温扩增检测试剂合格性检测方法，S1：利用实时荧光核酸恒温扩增检测试剂在多种设定环境下检测病毒样本，获得每种设定环境对应的测定结果，基于所述测定结果获得对应的试剂灵敏度和试剂稳定度，包括：

基于预设浓度梯度稀释所述实时荧光核酸恒温扩增检测试剂，获得多个同容量的待检测试剂；

设定第一实验环境，在所述第一实验环境中将所述待检测试剂和所述病毒样本分别进行混合，同时，记录实验过程中的第一实时荧光扩增曲线；

确定出所述第一实时荧光扩增曲线中实时荧光扩增值第一次大于第一阈值时对应的横坐标值作为对应梯度浓度值对应的的第一反应时间；

分析每条第一实时荧光扩增曲线对应的实时变化率，将所述实时变化率的平均值作为对应浓度对应的第一荧光扩增变化率；

确定出每条第一实时荧光扩增曲线对应的极大值点，将所述极大值点对应的横坐标值作为对应浓度对应的第一稳定时间；

将所有第一实时荧光扩增曲线统一融合于同一坐标系中，获得第一融合图像，基于预设方法确定出所述第一融合图像中的多个第一横坐标值，确定出所述第一横坐标值在所述第一融合图像中对应的多个第一样本点，获得每个第一横坐标值对应的第一样本点集合，基于所有第一横坐标值对应的第一样本点集合获得对应的第一样本点总集合；

基于不同预设浓度梯度对应的第一反应时间、第一荧光扩增变化率和第一稳定时间以及所述第一样本点总集合，获得对应的第一测定结果；

在所述第一实验环境中将预设量的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂和预设梯度拷贝模板值对应的病毒样本分别进行混合，同时，记录实验过程中的第二实时荧光扩增曲线；

确定出所述第二实时荧光扩增曲线中实时荧光扩增值第一次大于第一阈值时对应的横坐标作为对应拷贝模板值对应的第二反应时间；

分析每条第二实时荧光扩增曲线对应的实时变化率，将所述实时变化率的平均值作为对应拷贝模板值对应的第二荧光扩增变化率；

确定出每条第二实时荧光扩增曲线对应的极大值点，将所述极大值点对应的横坐标值作为对应拷贝模板值对应的第二稳定时间；

将所有第二实时荧光扩增曲线统一融合于同一坐标系中，获得第二融合图像，基于预设方法确定出所述第二融合图像中的多个第二横坐标值，确定出所述第二横坐标值在所述第二融合图像中对应的多个第二样本点，获得每个第二横坐标值对应的第二样本点集合，基于所有第二横坐标值对应的第二样本点集合获得对应的第二样本点总集合；

基于不同拷贝模板值对应的第二反应时间、第二荧光扩增变化率和第二稳定时间以及所述第二样本点总集合，获得对应的第二测定结果；

基于所述第一测定结果和所述第二测定结果计算出对应的试剂灵敏度和试剂稳定度。

优选的，所述的一种实时荧光核酸恒温扩增检测试剂合格性检测方法，基于所述第一测定结果和所述第二测定结果计算出对应的试剂灵敏度和试剂稳定度，包括：

基于所述第一测定结果中不同预设浓度梯度对应的第一反应时间、第一荧光扩增变化率，计算出对应的第一灵敏度；

基于所述第二测定结果中不同拷贝模板值对应的第二反应时间、第二荧光扩增变化率，计算出对应的第二灵敏度；

基于所述第一灵敏度和所述第二灵敏度计算出对应的试剂灵敏度；

从所述第一测定结果中每个第一横坐标值对应的第一样本点集合中确定出所述第一横坐标值对应的第一离群点；

确定出所述第一离群点对应的第一坐标值以及所有第一实时荧光扩增曲线中包含最多第一离群点对应的第一实时荧光扩增曲线中包含的第一离群点的第一总数和所述第一融合图像中包含的第一离群点的第二总数；

基于所述第一离群点对应的第一坐标值、所述第一总数和所述第二总数以及所述第一稳定时间，计算出对应的第一稳定度；

从所述第二测定结果中每个第二横坐标值对应的第二样本点集合中确定出所述第二横坐标值对应的第二离群点；

确定出所述第二离群点对应的第二坐标值以及每条第二实时荧光扩增曲线中包含的第二离群点的第三总数以及所述第二融合图像中包含的第二离群点的第四总数；

基于所述第二离群点对应的第二坐标值、所述第三总数和所述第四总数以及所述第二稳定时间，计算出对应的第二稳定度；

基于所述第一稳定度和所述第二稳定度计算出对应的试剂稳定度。

本发明提供了一种实时荧光核酸恒温扩增检测试剂合格性检测方法，具备以下有益效果：

1、该发明基于对实时荧光核酸恒温扩增检测试剂灵敏度和稳定度的检测，实现对实时荧光核酸恒温扩增检测试剂合格性的判断，保证了实时荧光核酸恒温扩增检测试剂的有效性。

2、该发明在对样本采集后通过核酸裂解液立即进行灭活裂解处理，可以常温运输并保证了RNA的完整性，减少了核酸检测的运输的成本和风险。

3、该发明通过在扩增反应试剂中添加亚精胺和甲酰胺，使试剂具备了抵抗抑制模板扩增物质的作用，可降低扩增引物的设计要求，无需考虑引物本身的GC含量及退火温度Tm值，进一步提高扩增产物的得率，同时能够减少或消除非特异扩增。

4、该发明通过在试剂中添加SYBR-green-I、SYTO-13、SYTO-82中任意一种的荧光材料，可根据荧光直接判读扩增结果，实现在非实验室环境下的核酸扩增检测及其结果判读，降低了对仪器以及技术的要求，简化了核酸检测过程。

5、该发明通过记录不同实验条件下实时荧光核酸恒温扩增检测试剂与样本病毒反应后后获得的实时荧光扩增曲线，并对获得的实时荧光扩增曲线进行分析，进而考虑到不同实验条件对应的情况，准确地确定出实时荧光核酸恒温扩增检测试剂的稳定性和灵敏性。

6、该发明通过对实时荧光扩增曲线分析获得的检测结果中的反应时间、荧光扩增变化率和稳定时间以及对第二样本点总集合分析获得的分析结果，准确地计算出实时荧光核酸恒温扩增检测试剂的稳定性和灵敏性。

附图说明

图1为本发明中一种实时荧光核酸恒温扩增检测试剂合格性检测方法流程示意图；

图2为本发明中一个实验过程记录获得的实时荧光扩增曲线示意图；

图3为本发明中两条实时荧光扩增曲线融合图像示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

本发明提供一种技术方案：一种实时荧光核酸恒温扩增检测试剂合格性检测方法，参考图1，包括：

S1：利用实时荧光核酸恒温扩增检测试剂在多种设定环境下检测病毒样本，获得每种设定环境对应的测定结果，基于所述测定结果获得对应的试剂灵敏度和试剂稳定度；

S2：基于所述试剂灵敏度和所述试剂稳定度获得对应的合格性测定结果。

该实施例中，多种设定环境包含在预设实验环境下(例如室温环境下) 根据预设设置的浓度梯度设置实时荧光核酸恒温扩增检测试剂的浓度和预设设置的梯度拷贝模板的病毒样本。

该实施例中，病毒样本即为包含病毒的DNA样本。

该实施例中，测定结果即为包含实时荧光扩增曲线分析获得的各种数据。

该实施例中，试剂灵敏度即为实时荧光核酸恒温扩增检测试剂的灵敏度。

该实施例中，试剂稳定度即为实时荧光核酸恒温扩增检测试剂的稳定度。

该实施例中，基于所述试剂灵敏度和所述试剂稳定度获得对应的合格性测定结果即为：当试剂灵敏度大于灵敏度阈值且试剂稳定度大于稳定度阈值时，则判定实时荧光核酸恒温扩增检测试剂合格，否则，判定实时荧光核酸恒温扩增检测试剂不合格。

以上技术的有益效果为：基于对实时荧光核酸恒温扩增检测试剂灵敏度和稳定度的检测，实现对实时荧光核酸恒温扩增检测试剂合格性的判断，保证了实时荧光核酸恒温扩增检测试剂的有效性。

所述荧光核酸恒温扩增检测试剂包括核酸裂解液、扩增反应试剂、扩增检测试剂以及荧光材料；

所述核酸裂解液包括：GuHCl、铵盐、乙二胺四乙酸、三羟甲基氨基甲烷、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、表面活性剂以及缓冲液，PH为4-4.5，在对样本采集后通过核酸裂解液立即进行灭活裂解处理，实现常温运输并保证了RNA的完整性，减少了运输的成本和风险。

所述扩增反应试剂包括：缓冲液、解旋酶、氯化镁、甲酰胺、亚精胺、 UvsX蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白、dNTPs、Tris碱以及DNA聚合酶，PH 为7-7.2，通过在扩增反应试剂中添加亚精胺和甲酰胺，使试剂具备了抵抗抑制模板扩增物质的作用，可降低扩增引物的设计要求，无需考虑引物本身的 GC含量及退火温度Tm值，进一步提高扩增产物的得率，同时能够减少或消除非特异扩增。

所述扩增检测试剂包括：Tris、EDTA、用于扩增靶核酸的引物对和探测靶核酸探针；

所述荧光材料为SYBR-green-I、SYTO-13、SYTO-82中的一种，通过在试剂中添加SYBR-green-I、SYTO-13、SYTO-82中任意一种的荧光材料，可根据荧光直接判读扩增结果，实现在非实验室环境下的核酸扩增检测及其结果判读，降低了对仪器以及技术的要求，简化了核酸检测过程。

所述核酸裂解液包含0.5-2MGuHCl、0.01-2M铵盐、5-50mM乙二胺四乙酸、 10-100M三羟甲基氨基甲烷、1-20mM乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、0.1-5％表面活性剂以及20-500mM缓冲液，PH为4-4.5；

所述扩增反应试剂中的表面活性剂采为十二烷基硫酸钠、溴化十六烷基甲三胺、聚乙烯吡咯烷酮、月桂酰基氨酸钠中的任意一种。

所述核酸裂解液中铵盐选自由硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、溴化铵和碘化铵组成的组，优选所述铵盐为氯化铵。

所述核酸裂解液中表面活性剂选自由Span-80、Span-20、十二烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸锂、十二烷基硫酸钠、Tween 20、Triton X-100、NP40、十二烷基肌氨酸钠和CTAB组成的组，优选组合为TritonX-100和Span-80。

所述核酸裂解液中缓冲液由氯化锂、十二烷基硫酸锂、Triton X-100、乙二胺四乙酸、柠檬酸以及水组成，各组分优选含量如下：0.02-7M氯化锂， 0.02-7％十二烷基硫酸锂，0.05-6％Triton X-1000，1-100mM乙二胺四乙酸， 0.02-0.5M柠檬酸，余量为水。

所述扩增反应试剂包括：1-100mM缓冲液、10ng/μL解旋酶、1-100mM氯化镁、0.5ng/μl甲酰胺、0.5ng/μl亚精胺、50-300ng/μlUvsX蛋白、50-300ng/μlUvsY蛋白、50-300ng/μl单链结合蛋白、50mM-100mM dNTPs、 10mM-0mM Tris碱以及5-100ng/μl；5-100ng/μlDNA聚合酶；

所述扩增反应缓冲液包含Tris-HCl、MgCl2、PVP40、KCl、甘油、醋酸锌二水合物、dNTP、NTP，pH为7.0。

所述扩增检测试剂中的引物包括基于RNA聚合酶启动子序列的正向引物和基于非RNA聚合酶启动子序列的反向引物；

所述正向引物包含位于5'末端的RNA聚合酶启动子序列和位于3'末端的正向靶核酸结合序列，所述反向引物包含反向靶核酸结合序列，通过引物与探针的配合，可高效、特异性捕获2019-nCoV的RNA。

所述扩增检测试剂中的探针包括与靶核酸特异性互补的5’特异性序列和 3’polyA序列，所述靶核酸为表征目标微生物存在的特异性序列，更优选的是，所述目标微生物为2019-nCoV。

所述的一种实时荧光核酸恒温扩增检测试剂合格性检测方法，S1：利用实时荧光核酸恒温扩增检测试剂在多种设定环境下检测病毒样本，获得每种设定环境对应的测定结果，基于所述测定结果获得对应的试剂灵敏度和试剂稳定度，包括：

基于预设浓度梯度稀释所述实时荧光核酸恒温扩增检测试剂，获得多个同容量的待检测试剂；

设定第一实验环境，在所述第一实验环境中将所述待检测试剂和所述病毒样本分别进行混合，同时，记录实验过程中的第一实时荧光扩增曲线；

确定出所述第一实时荧光扩增曲线中实时荧光扩增值第一次大于第一阈值时对应的横坐标值作为对应梯度浓度值对应的的第一反应时间；

分析每条第一实时荧光扩增曲线对应的实时变化率，将所述实时变化率的平均值作为对应浓度对应的第一荧光扩增变化率；

确定出每条第一实时荧光扩增曲线对应的极大值点，将所述极大值点对应的横坐标值作为对应浓度对应的第一稳定时间；

将所有第一实时荧光扩增曲线统一融合于同一坐标系中，获得第一融合图像，基于预设方法确定出所述第一融合图像中的多个第一横坐标值，确定出所述第一横坐标值在所述第一融合图像中对应的多个第一样本点，获得每个第一横坐标值对应的第一样本点集合，基于所有第一横坐标值对应的第一样本点集合获得对应的第一样本点总集合；

基于不同预设浓度梯度对应的第一反应时间、第一荧光扩增变化率和第一稳定时间以及所述第一样本点总集合，获得对应的第一测定结果；

在所述第一实验环境中将预设量的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂和预设梯度拷贝模板值对应的病毒样本分别进行混合，同时，记录实验过程中的第二实时荧光扩增曲线；

确定出所述第二实时荧光扩增曲线中实时荧光扩增值第一次大于第一阈值时对应的横坐标作为对应拷贝模板值对应的第二反应时间；

分析每条第二实时荧光扩增曲线对应的实时变化率，将所述实时变化率的平均值作为对应拷贝模板值对应的第二荧光扩增变化率；

确定出每条第二实时荧光扩增曲线对应的极大值点，将所述极大值点对应的横坐标值作为对应拷贝模板值对应的第二稳定时间；

将所有第二实时荧光扩增曲线统一融合于同一坐标系中，获得第二融合图像，基于预设方法确定出所述第二融合图像中的多个第二横坐标值，确定出所述第二横坐标值在所述第二融合图像中对应的多个第二样本点，获得每个第二横坐标值对应的第二样本点集合，基于所有第二横坐标值对应的第二样本点集合获得对应的第二样本点总集合；

基于不同拷贝模板值对应的第二反应时间、第二荧光扩增变化率和第二稳定时间以及所述第二样本点总集合，获得对应的第二测定结果；

基于所述第一测定结果和所述第二测定结果计算出对应的试剂灵敏度和试剂稳定度。

该实施例中，预设浓度梯度稀释即为预先设置(根据实时荧光核酸恒温扩增检测试剂的可用浓度范围设置)的梯度变化的浓度值。

该实施例中，待检测试剂即为基于预设浓度梯度稀释实时荧光核酸恒温扩增检测试剂后获得的多个同容量的试剂。

该实施例中，第一实验环境例如在封闭空间中25度的环境。

该实施例中，第一实时荧光扩增曲线即为在第一实验环境中将待检测试剂和病毒样本分别进行混合后获得的对应的实时荧光扩增曲线。

该实施例中，第一反应时间即为第一实时荧光扩增曲线中实时荧光扩增值第一次大于第一阈值时对应的横坐标值。

该实施例中，第一阈值即为荧光反应结果可被肉眼识别时对应的最小实时荧光扩增值。

该实施例中，第一荧光扩增变化率即为每条第一实时荧光扩增曲线对应的实时变化率的平均值。

该实施例中，第一稳定时间即为每条第一实时荧光扩增曲线对应的极大值点对应的横坐标值。

该实施例中，第一融合图像即为将所有第一实时荧光扩增曲线统一融合于同一坐标系中后获得的图像。

该实施例中，预设方法例如每隔10毫秒选取一个横坐标值。

该实施例中，第一横坐标值即为基于预设方法从第一融合图像中确定出的多个横坐标值。

该实施例中，第一样本点即为第一横坐标值在第一融合图像中每条第一实时荧光扩增曲线上对应的坐标点。

该实施例中，第一样本点集合即为第一横坐标值对应的所有第一样本点构成的集合。

该实施例中，第一样本点总集合即为第一融合图像中所有第一横坐标值对应的第一样本点集合构成的集合。

该实施例中，第一测定结果包括：不同预设浓度梯度对应的第一反应时间、第一荧光扩增变化率和第一稳定时间以及第一样本点总集合融合获得的结果。

该实施例中，预设梯度拷贝模板值即为预先设定的梯度变化的拷贝模板值(根据实时荧光核酸恒温扩增检测试剂的可检测范围确定)。

该实施例中，第二实时荧光扩增曲线即为在第一实验环境中将预设量的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂和预设梯度拷贝模板值对应的病毒样本分别进行混合后获得的对应的实时荧光扩增曲线。

该实施例中，第二反应时间即为第二实时荧光扩增曲线中实时荧光扩增值第一次大于第二阈值时对应的横坐标值。

该实施例中，第二荧光扩增变化率即为每条第二实时荧光扩增曲线对应的实时变化率的平均值。

该实施例中，第二稳定时间即为每条第二实时荧光扩增曲线对应的极大值点对应的横坐标值。

该实施例中，第二融合图像即为将所有第二实时荧光扩增曲线统一融合于同一坐标系中后获得的图像。

该实施例中，第二横坐标值即为基于预设方法从第二融合图像中确定出的多个横坐标值。

该实施例中，第二样本点即为第二横坐标值在第二融合图像中每条第二实时荧光扩增曲线上对应的坐标点。

该实施例中，第二样本点集合即为第二横坐标值对应的所有第二样本点构成的集合。

该实施例中，第二样本点总集合即为第二融合图像中所有第二横坐标值对应的第二样本点集合构成的集合。

该实施例中，第二测定结果包括：不同拷贝模板值对应的第二反应时间、第二荧光扩增变化率和第二稳定时间以及第二样本点总集合。

以上技术的有益效果为：该发明通过记录不同实验条件下实时荧光核酸恒温扩增检测试剂与样本病毒反应后后获得的实时荧光扩增曲线，并对获得的实时荧光扩增曲线进行分析，进而考虑到不同实验条件对应的情况，准确地确定出实时荧光核酸恒温扩增检测试剂的稳定性和灵敏性。

所述的一种实时荧光核酸恒温扩增检测试剂合格性检测方法，基于所述第一测定结果和所述第二测定结果计算出对应的试剂灵敏度和试剂稳定度，包括：

基于所述第一测定结果中不同预设浓度梯度对应的第一反应时间、第一荧光扩增变化率，计算出对应的第一灵敏度；

基于所述第二测定结果中不同拷贝模板值对应的第二反应时间、第二荧光扩增变化率，计算出对应的第二灵敏度；

基于所述第一灵敏度和所述第二灵敏度计算出对应的试剂灵敏度；

从所述第一测定结果中每个第一横坐标值对应的第一样本点集合中确定出所述第一横坐标值对应的第一离群点；

确定出所述第一离群点对应的第一坐标值以及所有第一实时荧光扩增曲线中包含最多第一离群点对应的第一实时荧光扩增曲线中包含的第一离群点的第一总数和所述第一融合图像中包含的第一离群点的第二总数；

基于所述第一离群点对应的第一坐标值、所述第一总数和所述第二总数以及所述第一稳定时间，计算出对应的第一稳定度；

从所述第二测定结果中每个第二横坐标值对应的第二样本点集合中确定出所述第二横坐标值对应的第二离群点；

确定出所述第二离群点对应的第二坐标值以及所有第二实时荧光扩增曲线中包含最多第二离群点对应的第二实时荧光扩增曲线中包含的第二离群点的第三总数和所述第二融合图像中包含的第二离群点的第四总数；

基于所述第二离群点对应的第二坐标值、所述第三总数和所述第四总数以及所述第二稳定时间，计算出对应的第二稳定度；

基于所述第一稳定度和所述第二稳定度计算出对应的试剂稳定度。

该实施例中，基于所述第一测定结果中不同预设浓度梯度对应的第一反应时间、第一荧光扩增变化率，计算出对应的第一灵敏度，包括：

式中，α1为第一灵敏度，n为预设浓度梯度对应的总个数，i为第i个预设浓度梯度，t

例如，n为2，t

该实施例中，基于所述第二测定结果中不同拷贝模板值对应的第二反应时间、第二荧光扩增变化率，计算出对应的第二灵敏度，包括：

式中，α

例如，m为2，t

该实施例中，基于所述第一灵敏度和所述第二灵敏度计算出对应的试剂灵敏度，包括：

式中，α

例如，α

该实施例中，基于所述第一离群点对应的第一坐标值、所述第一总数和所述第二总数以及所述第一稳定时间，计算出对应的第一稳定度，包括：

式中，β

例如，有两个第一离群点，则第一个第一离群点的坐标值为(3，4)，与第一个第一离群点相邻的前一坐标点为(2，3)，与第一个第一离群点相邻的后一坐标点为(4，4)，第二个第一离群点的坐标值为(5，6)，与第二个第一离群点相邻的前一坐标点为(4，5)，与第二个第一离群点相邻的后一坐标点为(6，6)，n为2，t

该实施例中，基于所述第二离群点对应的第二坐标值、所述第三总数和所述第四总数以及所述第二稳定时间，计算出对应的第二稳定度，包括：

式中，β

例如，有两个第二离群点，则第一个第二离群点的坐标值为(3，4)，与第一个第二离群点相邻的前一坐标点为(2，3)，与第一个第二离群点相邻的后一坐标点为(4，4)，第二个第二离群点的坐标值为(5，6)，与第二个第二离群点相邻的前一坐标点为(4，5)，与第二个第二离群点相邻的后一坐标点为(6，6)，m为2，t

该实施例中，基于所述第一稳定度和所述第二稳定度计算出对应的试剂稳定度，包括：

式中，β

例如，β

以上技术的有益效果为：该发明通过对实时荧光扩增曲线分析获得的检测结果中的反应时间、荧光扩增变化率和稳定时间以及对第二样本点总集合分析获得的分析结果，准确地计算出实时荧光核酸恒温扩增检测试剂的稳定性和灵敏性。

在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制；术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性，此外，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。