一种抗干扰能力强的高灵敏度血清锌测定试剂及制备方法

技术领域

本发明涉及医学检测技术领域，尤其涉及一种抗干扰能力强的高灵敏度血清锌测定试剂及制备方法。

背景技术

血清锌离子检测原理(吡啶偶氮类多元金属络合物法)：在特定浓度的抗蛋白、有机物干扰剂和金属掩蔽剂存在下，吡啶偶氮类多元金属络合物在碱性溶液中与锌反应，生产紫色复合物，在500nm～600nm波长处有最大吸收峰。通过测定标准浓度的锌离子生成的紫色复合物光度值，建立吸光度变化与浓度的标准曲线，可以计算出样本中锌离子浓度。人血清锌离子检测时，试剂对铜离子、铁离子、钙离子、镁离子等内源性金属离子干扰物质抗干扰能力弱，导致测试结果不准确。同时由于抗干扰剂选择不当，严重干扰吡啶偶氮类多元金属络合物对锌离子的结合反应，导致试剂灵敏度不高和检测结果不准确。并且试剂性能不稳定，满足不了通常体外诊断试剂效期需达到12月～18月的要求，因此致使试剂的使用效果不好。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗干扰能力强的高灵敏度血清锌测定试剂及制备方法，提升试剂的使用效果。

为实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种抗干扰能力强的高灵敏度血清锌测定试剂的制备方法，包括以下步骤：

按照配比称量第一原料和第二原料，分别加入对应的混合容器中进行搅拌溶解和混合，得到第一混合溶液；

将所述第一混合溶液的pH调节至8.0-9.0，并利用纯化水定量至配置量后进行过滤静置，得到第一试剂；

按照配比称量第三原料和第四原料，分别加入对应的混合容器中进行搅拌溶解和混合，得到第二混合溶液；

将所述第二混合溶液的pH调节至8.0-9.0，并利用纯化水定量至配置量后进行过滤静置，得到二试剂。

其中，按照配比称量第一原料和第二原料，分别加入对应的混合容器中进行搅拌溶解和混合，得到第一混合溶液，包括：

按照配比称量第一原料，并将所述第一原料加入含有质量比为75％-85％的纯化水的混合容器中进行搅拌至溶解；

按照配比称量第二原料，并将所述第二原料分为两批次加入另一个所述混合容器中进行搅拌溶解；

将所述第一原料溶液和所述第二原料溶液进行混合，得到第一混合溶液。

其中，将所述第一混合溶液的pH调节至8.0-9.0，并利用纯化水定量至配置量后进行过滤静置，得到第一试剂，包括：

判断所述第一混合溶液的pH值是否为8.0-9.0；

若不是，则利用盐酸溶液或氢氧化钠溶液进行调节；

利用纯化水定量至配置量后进行过滤静置，得到第一试剂。

其中，利用纯化水定量至配置量后进行过滤静置，得到第一试剂，包括：

利用纯化水定量至配置量，搅拌均匀后静置大于或等于15分钟；

利用0.4-1.0微米孔径的尼龙滤膜进行过滤，得到第一试剂。

第二方面，本发明提供一种抗干扰能力强的高灵敏度血清锌测定试剂，如第一方面所述的一种抗干扰能力强的高灵敏度血清锌测定试剂的制备方法应用于所述一种抗干扰能力强的高灵敏度血清锌测定试剂，

所述一种抗干扰能力强的高灵敏度血清锌测定试剂包括第一试剂和第二试剂，所述第一试剂与所述第二试剂的质量比为4:1；

所述第一试剂包括第一原料和第二原料，所述第一原料包括pH值为8.0～9.0缓冲液20～200mmol/L、酒石酸酸钾钠4～10g/L、钛铁试剂0.05～0.1g/L、吡咯烷二硫代氨基苯甲酸铵0.05～0.15g/L和防腐剂0.1～0.5g/L，所述第二原料包括丁二酮肟0.1～0.5g/L、水杨醛肟0.1～0.5g/L、无水乙醇5～10ml/L和非离子型表面活性剂1～5g/L；

所述第二试剂包括第三原料和第四原料，所述第三原料包括PH值为8.0～9.0的缓冲液20～200mmol/L和防腐剂0.1～0.5g/L，所述第四原料包括吡啶偶氮类多元金属络合物0.15～0.5g/L、非离子型表面活性剂5～10g/L和无水乙醇5～10ml/L。

其中，所述缓冲液包括N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸、N,N-二-羟乙基甘氨酸、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸-氢氧化钠、哌嗪-1,4-二乙磺酸-氢氧化钠中的一种或多种。

其中，所述非离子型表面活性剂包括脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚的一种或两种。

其中，所述防腐剂可以是甲基氯异噻唑啉酮和甲基异噻唑啉酮一种或两种。

本发明的一种抗干扰能力强的高灵敏度血清锌测定试剂及制备方法，所述一种抗干扰能力强的高灵敏度血清锌测定试剂包括第一试剂和第二试剂，所述第一试剂与所述第二试剂的质量比为4:1，按照配比称量第一原料和第二原料，分别加入对应的混合容器中进行搅拌溶解和混合，得到第一混合溶液；将所述第一混合溶液的pH调节至8.0-9.0，并利用纯化水定量至配置量后进行过滤静置，得到第一试剂；按照配比称量第三原料和第四原料，分别加入对应的混合容器中进行搅拌溶解和混合，得到第二混合溶液；将所述第二混合溶液的pH调节至8.0-9.0，并利用纯化水定量至配置量后进行过滤静置，得到二试剂提高试剂的使用效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明提供的一种抗干扰能力强的高灵敏度血清锌测定试剂的制备方法的步骤示意图。

图2是本发明提供的第一实施例与同类检测试剂临床结果相关性分析。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

请参阅图1，本发明提供一种抗干扰能力强的高灵敏度血清锌测定试剂的制备方法，包括以下步骤：

S101、按照配比称量第一原料和第二原料，分别加入对应的混合容器中进行搅拌溶解和混合，得到第一混合溶液。

具体的，按照配比称量第一原料，并将所述第一原料的所有配料依次加入含有质量比为75％-85％(占第一试剂配制所需总量75％-85％)的纯化水的混合容器中，逐一进行搅拌至完全溶解；按照配比称量第二原料，并将所述第二原料分为两批次加入另一个所述混合容器中进行搅拌溶解，即第一批次的所述第二原料搅拌至充分混合均匀后，再逐一加入第二批次的所述第二原料，直至完全溶解；然后将所述第一原料溶液和所述第二原料溶液进行充分混合，得到第一混合溶液。

S102、将所述第一混合溶液的pH调节至8.0-9.0，并利用纯化水定量至配置量后进行过滤静置，得到第一试剂。

具体的，测试所述第一混合溶液pH值是否在8.0-9.0，否则用盐酸溶液或氢氧化钠溶液调节至该范围内。

用纯化水定量至配制量，搅拌均匀，待溶液静置平衡至少15分钟，用0.4-1.0微米孔径尼龙滤膜过滤不溶物，即可得到第一试剂。

S103、按照配比称量第三原料和第四原料，分别加入对应的混合容器中进行搅拌溶解和混合，得到第二混合溶液。

具体的，按照配比称量第三原料，并将所述第三原料的所有配料依次加入含有质量比为75％-85％(占第三试剂配制所需总量75％-85％)的纯化水的混合容器中，逐一进行搅拌至完全溶解；按照配比称量第四原料，并将所述第四原料分为两批次加入另一个所述混合容器中进行搅拌溶解，即第一批次的所述第四原料搅拌至充分混合均匀后，再逐一加入第二批次的所述第四原料，直至完全溶解；然后将所述第三原料溶液和所述第四原料溶液进行充分混合，得到第二混合溶液。

S104、将所述第二混合溶液的pH调节至8.0-9.0，并利用纯化水定量至配置量后进行过滤静置，得到二试剂。

具体的，测试所述第二混合溶液pH值是否在8.0-9.0，否则用盐酸溶液或氢氧化钠溶液调节至该范围内。

用纯化水定量至配制量，搅拌均匀，待溶液静置平衡至少15分钟，用0.4-1.0微米孔径尼龙滤膜过滤不溶物，即可得到第二试剂。

本发明提供一种抗干扰能力强的高灵敏度血清锌测定试剂，所述的一种抗干扰能力强的高灵敏度血清锌测定试剂的制备方法应用于所述一种抗干扰能力强的高灵敏度血清锌测定试剂，

所述一种抗干扰能力强的高灵敏度血清锌测定试剂包括第一试剂和第二试剂，所述第一试剂与所述第二试剂的质量比为4:1；

所述第一试剂包括第一原料和第二原料，所述第一原料包括pH值为8.0～9.0缓冲液20～200mmol/L、酒石酸酸钾钠4～10g/L、钛铁试剂0.05～0.1g/L、吡咯烷二硫代氨基苯甲酸铵0.05～0.15g/L和防腐剂0.1～0.5g/L，所述第二原料包括丁二酮肟0.1～0.5g/L、水杨醛肟0.1～0.5g/L、无水乙醇5～10ml/L和非离子型表面活性剂1～5g/L；所述第二试剂包括第三原料和第四原料，所述第三原料包括PH值为8.0～9.0的缓冲液20～200mmol/L和防腐剂0.1～0.5g/L，所述第四原料包括吡啶偶氮类多元金属络合物0.15～0.5g/L、非离子型表面活性剂5～10g/L和无水乙醇5～10ml/L。

在本实施方式中，试剂一的作用是内源性干扰物质掩蔽(金属、蛋白、有机物质)，同时可调节反应过程中PH值，试剂二是吡啶偶氮类多元金属络合物溶液，两者在检测时组成完整的检测试剂，反应体系PH值为8.0～9.0。试剂一与试剂二反应比例为4：1。所述第一试剂包括第一原料和第二原料，所述第一原料包括pH值为8.0～9.0缓冲液20～200mmol/L、酒石酸酸钾钠4～10g/L、钛铁试剂0.05～0.1g/L、吡咯烷二硫代氨基苯甲酸铵0.05～0.15g/L和防腐剂0.1～0.5g/L，所述第二原料包括丁二酮肟0.1～0.5g/L、水杨醛肟0.1～0.5g/L、无水乙醇5～10ml/L和非离子型表面活性剂1～5g/L；所述第二试剂包括第三原料和第四原料，所述第三原料包括PH值为8.0～9.0的缓冲液20～200mmol/L和防腐剂0.1～0.5g/L，所述第四原料包括吡啶偶氮类多元金属络合物0.15～0.5g/L、非离子型表面活性剂5～10g/L和无水乙醇5～10ml/L。

所述缓冲液可以为PH在8.0～9.0范围内的GOOD’S生物缓冲液，如N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸(TAPS)、三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、N,N-二-羟乙基甘氨酸(Bicine)、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸-氢氧化钠(HEPES-NaOH)、哌嗪-1,4-二乙磺酸-氢氧化钠(PIPES-NaOH)缓冲液的一种或多种；所述非离子型表面活性剂作为蛋白解离剂和增溶剂，可以是脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚的一种或几种混合，如脂肪醇聚氧乙烯(7)醚(AEO7)、曲拉通X-100或两者混合使用。所述防腐剂可以是甲基氯异噻唑啉酮(CMIT)和甲基异噻唑啉酮(MIT)一种或两者混合物，如牛莎PC-300抑菌剂、ProClin300防腐剂。所述的吡啶偶氮类多元金属络合物可以是2-(5-溴-2-吡啶基偶氮)-5-[N-丙基-N-(3-磺丙基)氨基]苯酚二钠盐(5-Br-PAPS)、2-(5-硝基-2-吡啶偶氮基)-5-(N-丙基-N-磺丙氨基)苯酚二钠盐(Nitro-PAPS)、2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-(二乙氨基)苯酚(5-Br-PADAP)、2-(3,5-二溴-2-吡啶偶氮)-5-二甲氨基酚(3,5-diBr-DMPAP)中的一种或多种。

第一实施例

一种抗干扰能力强的高灵敏度血清锌测定试剂

试剂一：

试剂组分

试剂二：

试剂组分

制备方法：

试剂一的配制

(1)混合容器中加入占试剂一配制所需总量约80％的纯化水，分别准确称取全批量TAPS、酒石酸酸钾钠、钛铁试剂、吡咯烷二硫代氨基苯甲酸铵、牛莎PC-300抑菌剂，依次加到混合容器中，逐一搅拌至完全溶解。

(2)在另一混合容器中分别准确称取全批量无水乙醇、曲拉通X-100，充分混合均匀后逐一加入和溶解全批量的丁二酮肟、水杨醛肟，待充分搅拌溶解后与步骤(1)配制的溶液进行充分混合。

(3)测试pH值是否在8.5±0.05，否则用6mol/L盐酸溶液或10mol/L氢氧化钠溶液调节至该范围内。

(4)用纯化水定量至配制量，搅拌均匀，待溶液静置平衡15min，用0.8微米孔径尼龙滤膜过滤不溶物即可。

试剂二的配制

(1)混合容器中加入占试剂二配制所需总量约80％的纯化水，准确称取全批量TAPS、牛莎PC-300抑菌剂搅拌至完全溶解。

(2)在另一混合容器中分别准确称取全批量无水乙醇、曲拉通X-100，充分混合均匀后加入全批量的5-Br-PAPS，待充分搅拌溶解后与步骤(1)配制的溶液进行充分混合。

(3)测试pH值是否在8.4±0.05，否则用6mol/L盐酸溶液或10mol/L氢氧化钠溶液调节至该范围内。

(4)用纯化水定量至配制量，搅拌均匀，待溶液静置平衡15min，用0.8微米孔径尼龙滤膜过滤不溶物即可。

第二实施例

一种抗干扰能力强的高灵敏度血清锌测定试剂

试剂一：

试剂组分

试剂二：

试剂组分

制备方法

试剂一的配制

(1)混合容器中加入占试剂一配制所需总量约80％的纯化水，分别准确称取全批量HEPES、NaOH、酒石酸酸钾钠、钛铁试剂、吡咯烷二硫代氨基苯甲酸铵、ProClin300防腐剂，依次加到混合容器中，逐一搅拌至完全溶解。

(2)在另一混合容器中分别准确称取全批量无水乙醇、AEO7，充分混合均匀后逐一加入和溶解全批量的丁二酮肟、水杨醛肟，待充分搅拌溶解后与步骤(1)配制的溶液进行充分混合。

(3)测试pH值是否在8.0±0.05，否则用6mol/L盐酸溶液或10mol/L氢氧化钠溶液调节至该范围内。

(4)用纯化水定量至配制量，搅拌均匀，待溶液静置平衡15min，用0.8微米孔径尼龙滤膜过滤不溶物即可。

试剂二的配制

(1)混合容器中加入占试剂二配制所需总量约80％的纯化水，准确称取全批量HEPES、NaOH、ProClin300防腐剂搅拌至完全溶解。

(2)在另一混合容器中分别准确称取全批量无水乙醇、AEO7，充分混合均匀后加入全批量的Nitro-PAPS，待充分搅拌溶解后与步骤(1)配制的溶液进行充分混合。

(3)测试pH值是否在8.4±0.05，否则用6mol/L盐酸溶液或10mol/L氢氧化钠溶液调节至该范围内。

(4)用纯化水定量至配制量，搅拌均匀，待溶液静置平衡15min，用0.8微米孔径尼龙滤膜过滤不溶物即可。

第三实施案例

试剂一：

试剂组分

试剂二：

试剂组分

制备方法

试剂一的配制

(1)混合容器中加入占试剂一配制所需总量约80％的纯化水，分别准确称取全批量Tricine、酒石酸酸钾钠、钛铁试剂、吡咯烷二硫代氨基苯甲酸铵、ProClin300防腐剂，依次加到混合容器中，逐一搅拌至完全溶解。

(2)在另一混合容器中分别准确称取全批量无水乙醇、AEO7、曲拉通X-100，充分混合均匀后逐一加入和溶解全批量的丁二酮肟、水杨醛肟，待充分搅拌溶解后与步骤(1)配制的溶液进行充分混合。

(3)测试pH值是否在8.7±0.05，否则用6mol/L盐酸溶液或10mol/L氢氧化钠溶液调节至该范围内。

(4)用纯化水定量至配制量，搅拌均匀，待溶液静置平衡15min，用0.8微米孔径尼龙滤膜过滤不溶物即可。

试剂二的配制

(1)混合容器中加入占试剂二配制所需总量约80％的纯化水，准确称取全批量Tricine、ProClin300防腐剂搅拌至完全溶解。

(2)在另一混合容器中分别准确称取全批量无水乙醇、AEO7，充分混合均匀后加入全批量的Nitro-PAPS，待充分搅拌溶解后与步骤(1)配制的溶液进行充分混合。

(3)测试pH值是否在8.7±0.05，否则用6mol/L盐酸溶液或10mol/L氢氧化钠溶液调节至该范围内。

(4)用纯化水定量至配制量，搅拌均匀，待溶液静置平衡15min，用0.8微米孔径尼龙滤膜过滤不溶物即可。

原理：吡啶偶氮类多元金属络合物在碱性溶液中与锌反应，生产紫色复合物，在500nm～600nm波长处有最大吸收峰。通过测定标准浓度的锌离子生成的紫色复合物光度值，建立吸光度变化与浓度的标准曲线，可以计算出样本中锌离子浓度。

将试剂一和试剂二37℃放置7天的稳定性负荷实验以及在4至8℃贮存温度下保存12个月的贮存稳定性实验中，试剂外观无明显变化，当按照本发明公开的测定方法进行检测时，试剂的测定锌离子的浓度上限可达160μmol/L，若样本中含有以下浓度的干扰物，对检测结果无影响：胆红素≤100μmol/L、血红蛋白≤1g/L、肝素钠≤5IU/mL、CU

本发明试剂可采用手工测试方法，也可以通过全自动生化分析仪等分析仪器对样本进行检测，具体采用一下方法：

表1锌测定试剂使用参数表

计算公式为：

其中，为了保证测试结果可靠性，要求在样本检测前需通过锌标准品或标准血清对试剂检测进行校准。

干扰性实验：使用添加法测试试剂的抗干扰性。干扰物按表2上标示的项目及浓度进行选择，按干扰浓度标示量的10倍配制干扰物质浓缩液，从中吸取1份浓缩液，并加入9份样本血清混合均匀，对照样本以相同体积的生理盐水代替干扰物浓缩液，每个样本测试3遍，计算平均值的相对偏差。判定：与空白对照测试结果偏差不超过±10％为不干扰。

表2锌测定试剂抗干扰验证

相关性验证：利用实施案例1配方配制试剂，与市场在售获国家药品监督局认可的某公司的血清锌测定试剂盒进行对照检测，在日立7180生化分析仪上同时检测临床样本测试样本100例并对两组测试结果进行相关性和配对T检验分析。结果显示如图2所示，两组数据线性相关系数R大于0.9750，T检验分析的P大于0.05，表明本试剂与同类检测试剂在临床测试结果上具有良好相关性且结果无明显差异性

本发明的有益效果为：

1)通过酒石酸酸钾钠、丁二酮肟、水杨醛肟、钛铁试剂、吡咯烷二硫代氨基苯甲酸铵五种金属络合剂联用，组成锌离子检测试剂的抗干扰剂体系，相比传统配方较大提升了试剂的整体抗干扰能力。其中吡咯烷二硫代氨基苯甲酸铵和水杨醛肟掩蔽铜离子、酒石酸酸钾钠掩蔽钙和镁离子、钛铁试剂掩蔽铁离子、吡咯烷二硫代氨基苯甲酸铵掩蔽铜离子、丁二酮肟掩蔽镍离子；检测体系可确保血清中主要内源干扰物CU

2)避免由于铜试剂等强金属络合剂在锌离子检测过程中与吡啶偶氮类多元金属络合物产生竞争性抑制，导致试剂检测灵敏度降低和测试不准确。

本发明的一种抗干扰能力强的高灵敏度血清锌测定试剂及制备方法，所述一种抗干扰能力强的高灵敏度血清锌测定试剂包括第一试剂和第二试剂，所述第一试剂与所述第二试剂的质量比为4:1，按照配比称量第一原料和第二原料，分别加入对应的混合容器中进行搅拌溶解和混合，得到第一混合溶液；将所述第一混合溶液的pH调节至8.0-9.0，并利用纯化水定量至配置量后进行过滤静置，得到第一试剂；按照配比称量第三原料和第四原料，分别加入对应的混合容器中进行搅拌溶解和混合，得到第二混合溶液；将所述第二混合溶液的pH调节至8.0-9.0，并利用纯化水定量至配置量后进行过滤静置，得到二试剂提高试剂的使用效果。

以上所揭露的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。