一种通过pH值快速判定普洱茶发酵程度的方法

技术领域

本发明属于普洱茶发酵技术领域，更具体地，涉及一种通过pH值快速判定普洱茶发酵程度的方法。

背景技术

普洱茶是云南地理标志产品，因其独特的滋味品质和良好的保健功效，日益受到国内外消费者的欢迎。普洱茶加工周期长，对发酵程度的掌握是决定产品品质的关键。目前，对普洱茶发酵程度的判断，主要采用以下两种方式，一种是依靠制茶人的感官评价来进行发酵程度判断及过程控制，此方式必须依赖有经验的制茶师，局限性强且主观性大，不能满足茶叶自动化、标准化、连续化生产的要求；另一种是对发酵过程中茶叶主要物质组分含量进行检测分析，但步骤复杂，组分多，时间长，对发酵程度的判断不具有时效性。因此，寻找一种方便、快捷的方法来判断普洱茶的发酵程度，对于指导建立普洱茶精准控制的标准化生产具有重要意义。

中国申请专利201010039123.8公开了一种普洱茶渥堆发酵程度的判定方法，主要是通过检测发酵过程中挥发性成分的变化，从而判断发酵程度，该方法相比于感官评价，更具有科学性和一致性，但每批次发酵需多次采用气相色谱-质谱(GC-MS)检测，成本相对较高，且多数实验室并不拥有GC-MS设备，难以实施；论文《色差技术在普洱茶品质控制中的应用研究》主要是利用色差技术，建立了茶褐素含量与色差值的相关性，从而判定不同普洱茶产品品质，该方法相对于茶褐素的检测，更加简单、便捷，但是该方法主要是针对茶褐素含量较高且固定的产品去检测分析，而在普洱茶发酵过程中，茶褐素含量随着茶红素和茶黄素逐渐转化而增加，因此，如何更有效且准确的表征茶褐素含量，需要进一步探讨。中国申请专利201911045673.8公开了一种快速判断六堡茶渥堆发酵程度的方法，主要是建立了pH值与茶多酚含量之间的关系，在一定范围内，随着pH值的下降，茶多酚含量逐渐降低，根据茶多酚含量的范围确定六堡茶发酵程度，轻度发酵茶多酚含量约为23～26％，中度发酵茶多酚含量约为20～23％，重发酵茶多酚含量约为18～20％，该方法无需昂贵设备，易于实现，但该方法主要建立了高含量茶多酚与pH值线性关系，而对普洱茶来说，产品标准要求茶多酚含量低于15％，发酵前期茶多酚含量下降明显，而发酵中后期茶多酚含量变化不显著，主要是茶褐素含量的变化，因此，很难通过pH值与茶多酚的关系去指示普洱茶的发酵程度。因此，亟需建立快速判断普洱茶发酵程度的方法，保证普洱茶发酵过程参数调控的时效性，使产品稳定生产。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明目的在于提供一种通过pH值快速判定普洱茶发酵程度的方法，其中，通过选取特定的参数(尤其是选取作为拟合数据来源的特定阶段内的特定参数，如没食子酸的含量、茶褐素的含量、茶叶pH值)，利用参数之间的线性关系，能够快速预测茶褐素含量，从而有效指示普洱茶的发酵程度(例如，茶褐素含量低于8％为轻发酵，8～12％为发酵适中，高于12％为重发酵)。基于本发明，尤其可根据普洱茶发酵罐发酵过程特定阶段茶褐素含量与茶叶pH值之间的变化关系，预测茶褐素含量；而茶叶pH值的测量简单、便捷，对于待预测的普洱茶发酵体系，只需根据测得的茶叶pH值，即可预测出茶褐素含量，进而确定普洱茶发酵程度，方法简单、时效性佳。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种通过pH值快速判定普洱茶发酵程度的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)使用目标容量的发酵罐，对接种微生物的普洱茶原料进行发酵，同时按预先设定的时间间隔监测发酵过程中没食子酸(GA)和茶褐素(TB)的含量，得到多组没食子酸含量-茶褐素含量数据；

(2)记监测过程中没食子酸(GA)的含量达到最大值以后的阶段为拟合数据来源的特定阶段，利用该特定阶段所对应的若干组没食子酸含量-茶褐素含量数据，进行线性拟合，得到茶褐素含量随没食子酸含量变化的拟合关系y＝k*x+b，其中，y对应茶褐素含量，x对应没食子酸含量，k和b为线性拟合得到的常量；

(3)针对待预测的普洱茶发酵体系，利用该拟合关系，只需根据测得的没食子酸含量，即可对待预测的普洱茶发酵体系中茶褐素含量进行预测；其中，该待预测的普洱茶发酵体系的发酵环境容量与目标容量相同。

按照本发明的再一方面，提供了一种通过pH值快速判定普洱茶发酵程度的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)使用目标容量的发酵罐，对接种微生物的普洱茶原料进行发酵，同时按预先设定的时间间隔监测发酵过程中茶叶pH值，以及按预先设定的时间间隔监测发酵过程中没食子酸(GA)和茶褐素(TB)的含量，得到多组没食子酸含量-茶褐素含量数据；其中，所述茶叶pH值等于对应的pH实际测得值减去1；

(2)记监测过程中茶叶pH值的含量达到最小值以后的阶段为拟合数据来源的特定阶段，利用该特定阶段所对应的若干组没食子酸含量-茶褐素含量数据，进行线性拟合，得到茶褐素含量随没食子酸含量变化的拟合关系y＝k*x+b，其中，y对应茶褐素含量，x对应没食子酸含量，k和b为线性拟合得到的常量；

(3)针对待预测的普洱茶发酵体系，利用该拟合关系，只需根据测得的没食子酸含量，即可对待预测的普洱茶发酵体系中茶褐素含量进行预测；其中，该待预测的普洱茶发酵体系的发酵环境容量与目标容量相同。

作为本发明的进一步优选，所述步骤(2)中，所述线性拟合是通过在另一发酵环境容量对应的拟合关系基础上，通过修正得到的。

按照本发明的另一方面，本发明提供了一种通过pH值快速判定普洱茶发酵程度的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)使用目标容量的发酵罐，对接种微生物的普洱茶原料进行发酵，同时按预先设定的时间间隔监测发酵过程中没食子酸的含量，以及按预先设定的时间间隔监测发酵过程中茶褐素的含量和茶叶pH值，得到多组茶褐素含量-茶叶pH值数据；其中，所述茶叶pH值等于对应的pH实际测得值减去1；

(2)记监测过程中没食子酸的含量达到最大值以后的阶段为拟合数据来源的特定阶段，利用该特定阶段所对应的若干组茶褐素含量-茶叶pH值数据，进行线性拟合，得到茶褐素含量随茶叶pH值变化的拟合关系y＝k*x+b，其中，y对应茶褐素含量，x对应茶叶pH值，k和b为线性拟合得到的常量；

(3)针对待预测的普洱茶发酵体系，利用该拟合关系，只需根据测得的茶叶pH值，即可对待预测的普洱茶发酵体系中茶褐素含量进行预测；其中，该待预测的普洱茶发酵体系的发酵环境容量与目标容量相同。

按照本发明的再一方面，本发明提供了一种通过pH值快速判定普洱茶发酵程度的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)使用目标容量的发酵罐，对接种微生物的普洱茶原料进行发酵，同时按预先设定的时间间隔监测发酵过程中茶褐素的含量和茶叶pH值，得到多组茶褐素含量-茶叶pH值数据；其中，所述茶叶pH值等于对应的pH实际测得值减去1；

(2)记监测过程中茶叶pH值的含量达到最小值以后的阶段为拟合数据来源的特定阶段，利用该特定阶段所对应的若干组茶褐素含量-茶叶pH值数据，进行线性拟合，得到茶褐素含量随茶叶pH值变化的拟合关系y＝k*x+b，其中，y对应茶褐素含量，x对应茶叶pH值，k和b为线性拟合得到的常量；

(3)针对待预测的普洱茶发酵体系，利用该拟合关系，只需根据测得的茶叶pH值，即可对待预测的普洱茶发酵体系中茶褐素含量进行预测；其中，该待预测的普洱茶发酵体系的发酵环境容量与目标容量相同。

作为本发明的进一步优选，所述步骤(2)中，所述线性拟合是通过在另一发酵环境容量对应的拟合关系基础上，通过修正得到的。

按照本发明的又一方面，本发明提供了一种预测普洱茶发酵过程中没食子酸含量的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)使用目标容量的发酵罐，对接种微生物的普洱茶原料进行发酵，同时按预先设定的时间间隔监测发酵过程中没食子酸的含量和茶叶pH值，得到多组没食子酸含量-茶叶pH值数据；其中，所述茶叶pH值等于对应的pH实际测得值减去1；

(2)记监测过程中没食子酸的含量达到最大值以后的阶段为拟合数据来源的特定阶段，利用该特定阶段所对应的若干组没食子酸含量-茶叶pH值数据，进行线性拟合，得到没食子酸含量随茶叶pH值变化的拟合关系y＝k*x+b，其中，y对应没食子酸含量，x对应茶叶pH值，k和b为线性拟合得到的常量；

或者，记监测过程中茶叶pH值的含量达到最小值以后的阶段为拟合数据来源的特定阶段，利用该特定阶段所对应的若干组没食子酸含量-茶叶pH值数据，进行线性拟合，得到没食子酸含量随茶叶pH值变化的拟合关系y＝k*x+b，其中，y对应没食子酸含量，x对应茶叶pH值，k和b为线性拟合得到的常量；

(3)针对待预测的普洱茶发酵体系，利用该拟合关系，只需根据测得的茶叶pH值，即可对待预测的普洱茶发酵体系中没食子酸含量进行预测；其中，该待预测的普洱茶发酵体系的发酵环境容量与目标容量相同。

作为本发明的进一步优选，所述步骤(2)中，所述线性拟合是通过在另一发酵环境容量对应的拟合关系基础上，通过修正得到的。

按照本发明的最后一方面，本发明提供了上述方法在普洱茶生产中的应用。

通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，本发明利用普洱茶发酵过程中没食子酸的含量、茶褐素的含量、茶叶pH值参数，利用参数之间的线性关系，能够快速预测茶褐素含量。

茶褐素含量是判断普洱茶发酵程度的关键指标，针对普洱茶发酵程度的判断，本发明通过pH值的变化快速预测茶褐素含量变化的方法，建立了茶褐素、没食子酸含量变化和茶叶pH值变化的关系，尤其可通过茶叶pH值预测茶褐素含量，方法简单、快速。

本发明预测方法抗干扰性好，由于所使用的参数，即，茶褐素含量、没食子酸含量、茶叶pH值，均是对应着发酵过程中的物质转化，某一具体发酵过程所使用的原料量、菌种的种类、菌种的接种量、发酵过程中的通气量、温度、湿度等对拟合关系的影响基本可以忽略。因此，本发明建立的特定发酵阶段(即，没食子酸的含量达到最大值以后的阶段)茶褐素含量和pH值之间的线性关系，通过检测pH值大小，即可预测普洱茶发酵过程中茶褐素含量高低，快速判断发酵程度。

基于本发明，可以使用5m

综上，本发明建立的方法，能够快速，有效，准确的判定普洱茶的发酵程度，显著节约了时间和经济成本，保证了普洱茶发酵过程参数调控的时效性，使产品稳定生产，为普洱茶标准化生产奠定基础。

附图说明

图1是5m

图2是0.5m

图3是没食子酸标准品的HPLC图谱。

图4是普洱茶样品没食子酸检测HPLC图谱。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

总的来说，以5m

(1)对5m

(2)取发酵过程样品检测没食子酸和茶褐素含量。根据发酵过程中特定阶段普洱茶没食子酸与茶褐素含量之间的线性关系，判定普洱茶发酵程度，其中特定阶段是指发酵过程中没食子酸含量达到最高值以后的阶段(不同批次没食子酸含量达到最高值的时间点略有差异)。

表1：5m

注：GA-没食子酸，TB-茶褐素。该表所对应的样品其发酵程序具体如下：

第0至1天，温度控制为28℃，无菌空气通气量控制为6L/min；

第2至4天，温度控制为32℃，无菌空气通气量控制为8L/min；

第5至7天，温度控制为36℃，无菌空气通气量控制为22L/min；

第8至10天，温度控制为38℃，无菌空气通气量控制为25L/min；

第11至17天，温度控制为37℃，无菌空气通气量控制为30L/min；

第18至25天，温度控制为42℃，无菌空气通气量控制为15L/min。

如表1所示，GA含量达到最高值时，对应发酵期的第7天，此后即进入特定阶段。由表1的实验数据不难得出，在普洱茶发酵过程中，当没食子酸含量达到最高点后，没食子酸含量与茶褐素含量的变化关系如图1所示，其线性关系为y＝-0.1656*x+17.3266，R

为提高线性回归方程的泛化能力，将其应用在0.5m

修正方法如下：

y＝k*x+b

对每一个已知数据，自变量x，都有一个拟合值y′

y′

令：

得到预测回归方程式：y＝k*x+b

即y＝-0.1656*x+9.05。

表2：0.5m

注：该表所对应的样品其发酵程序具体如下：

第0至3天，温度控制为28℃，无菌空气通气量控制为0.5L/min；

第4至6天，温度控制为36℃，无菌空气通气量控制为2.0L/min；

第7至9天，温度控制为36℃，无菌空气通气量控制为2.5L/min；

第10至12天，温度控制为38℃，无菌空气通气量控制为2.5L/min；

第13至14天，温度控制为38℃，无菌空气通气量控制为2.0L/min。

表3：成对样本检验

结果显示，测定没食子酸含量后根据线性方程计算出的茶褐素预测值和茶褐素实测值之间统计量|t|＝0.027，P值＝0.979＞0.05，说明测定没食子酸后根据修正后的线性方程计算出的茶褐素预测值和茶褐素实测值之间无显著性差异，即测定没食子酸后根据修正后的线性方程计算茶褐素含量是可行的。

(3)取发酵过程样品检测茶叶pH值。发酵过程茶叶pH值等于pH值测得值减去1。根据发酵过程中特定阶段茶叶pH值和没食子酸含量之间的关系，间接判定普洱茶发酵程度，其中，特定阶段是指发酵过程中没食子酸含量达到最高值以后的阶段(不同批次没食子酸含量达到最高值的时间点略有差异)，没食子酸含量与茶叶pH值呈现负相关，也可以用茶叶pH值达到最小值以后的阶段为特定阶段。

表4：0.5m

注：该表所对应的样品其发酵程序具体如下：

第0至3天，温度控制为28℃，无菌空气通气量控制为0.8L/min；

第4至6天，温度控制为36℃，无菌空气通气量控制为2.0L/min；

第7至8天，温度控制为36℃，无菌空气通气量控制为2.5L/min；

第9至10天，温度控制为38℃，无菌空气通气量控制为2.5L/min；

第11至14天，温度控制为38℃，无菌空气通气量控制为2.2L/min；

第15至16天，温度控制为37℃，无菌空气通气量控制为2.5L/min；

第17至18天，温度控制为37℃，无菌空气通气量控制为3.0L/min。

如表4所示，GA含量达到最高值时，对应的是发酵期的第4天，此后即进入特定阶段。由以上实验数据不难看出，在普洱茶发酵过程中，当没食子酸含量达到最高点后，茶叶pH值与没食子酸含量的变化关系如图2所示，其线性关系为y＝-9.913*x+59.024，R

(4)建立茶褐素含量和茶叶pH值关系。将0.5m

为验证该方法的可行性，取0.5m

表5：0.5m

注：该表中的“温度/℃”、“无菌空气通气量/L/min”均是指对应样本所处发酵阶段的具体发酵参数条件。

表6：成对样本检验

应用案例1

(1)菌种制备：

参考中国申请专利201810064877.5，普洱茶发酵用的能够用于食品生产的微生物是指黑曲霉(Aspergillus niger3.350)、米曲霉(Aspergillus oryzae AS3.042)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis1389)、酿酒酵母、产阮假丝酵母以及乳酸菌，可在无菌条件下挑取保藏的微生物少许，接入相应的琼脂培养基上培养，其中黑曲霉、米曲霉、酿酒酵母、产阮假丝酵母可接入PDA固体培养基，在28℃培养条件下培养；枯草芽孢杆菌可接入LB固体培养基，在37℃培养条件下培养；乳酸菌可接入MRS固体培养基，在37℃培养条件下培养。将每种微生物分别培养后用适量无菌水制备成孢子或菌液，使每种微生物的孢子或菌个数的终浓度约为1×10

其中培养基的配置可以采用如下方法：

PDA固体培养基：将洗净后去皮的马铃薯200g，切碎，加水1000mL，煮沸后半小时，趁热用纱布过滤后，加葡萄糖20g，分装后再加入琼脂20g/L。121℃灭菌15min。

LB固体培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、蒸馏水1L、琼脂15-20g，pH值调整为7.4。121℃灭菌15min。

MRS固体培养基：10g蛋白胨、10g牛肉浸粉、5g酵母浸粉、20g葡萄糖、1mL吐温80、2g磷酸氢二钾、5g三水合乙酸钠、2g柠檬酸铵、0.2g七水硫酸镁、0.05g四水合硫酸锰、1L蒸馏水，pH值调整为6.2-6.6。121℃灭菌15min。

(2)发酵罐灭菌：采用卧式固体发酵罐(可参见中国专利201621477335.3)，将普洱茶发酵罐内部及管道采用高温蒸汽进行灭菌，115℃维持30min；

(3)原材料预处理：将100kg普洱茶原料进行紫外预处理，紫外灯30W，紫外灯个数为40个，茶叶厚度约5cm，茶叶距离紫外灯的距离30cm，单只紫外灯的照射面积0.5m

(4)发酵罐接种发酵：将100kg预处理后的普洱茶，35L孢子或菌悬液在发酵罐外洁净间进行混合，混合均匀后转入灭菌后的发酵罐，在5m

发酵过程中，控制发酵罐内温度参数如表7，过每2-3天取样检测茶叶中的含水量，若茶叶中的含水量低于25％，通过雾化喷头补加无菌水，使茶叶中的含水量维持在30％，补水过程使发酵罐保持转动，转速10rpm，补水结束后继续转动发酵罐，维持5min，使补加的无菌水与罐内茶叶混合均匀；

表7：5m

(5)采用高效液相色谱法(HPLC)测定没食子酸含量，结果如表9所示。

标准曲线绘制：称取0.0011g没食子酸标准品，用少量50％甲醇超声溶解之后，加50％甲醇定容至10mL得到浓度为110ug/mL的母液。将母液进行逐步稀释得到55、27.5、11、5.5、1.1ug/mL浓度的标准液。用1mL一次性注射器从上述溶液中吸出适量溶液，过0.22μm膜后，做HPLC检测。

样品制备：参考GB/T8313-2018，并做适当修改，将普洱茶样品先用研钵简单碾碎，然后用粉碎机粉碎。准确称取样品粉末0.1000g，置于50mL尖底塑料离心管，加入7mL预热过的70％甲醇，于70℃下提取10min(中间每隔3分钟振荡一次，以保证充分提取)。然后以6000rpm离心5min，将上清液转移至25mL棕色容量瓶。残渣重新加入7mL预热过的70％甲醇，重复上述提取操作2次，合并三次的上清液于棕量瓶，加水定容至刻度。用1mL一次性注射器从上述溶液中吸出适量溶液，过0.22μm膜后，待做HPLC检测。每个样品做3个平行样，结果取平均值。

色谱条件

色谱柱：C18-Aq柱(4.6*250mm，5μm)；流动相：乙腈，10mL乙酸(HPLC级)+2mLEDTA(2mg/mL水溶液，分析纯EDTA)；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；检测波长：278nm；进样量：10μL；梯度洗脱，洗脱程序如表8。

表8：梯度洗脱程序

HPLC中使用的没食子酸标准曲线：y＝35.834*x-4.0575，R

图3、图4所示分别为没食子酸标准品的HPLC图谱和普洱茶样品没食子酸检测HPLC图谱。

根据上文中针对5m

表9：5m

应用案例2

(1)菌种制备：

普洱茶发酵用的能够用于食品生产的微生物是指黑曲霉(Aspergillusniger3.350)、米曲霉(Aspergillus oryzae AS3.042)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis1389)、酿酒酵母、产阮假丝酵母以及乳酸菌，可在无菌条件下挑取保藏的微生物少许，接入相应的琼脂培养基上培养，其中黑曲霉、米曲霉、酿酒酵母、产阮假丝酵母可接入PDA固体培养基，在28℃培养条件下培养；枯草芽孢杆菌可接入LB固体培养基，在37℃培养条件下培养；乳酸菌可接入MRS固体培养基，在37℃培养条件下培养。将每种微生物分别培养后用适量无菌水制备成孢子或菌液，使每种微生物的孢子或菌个数的终浓度约为1×10

其中培养基的配置可以采用如下方法：

PDA固体培养基：将洗净后去皮的马铃薯200g，切碎，加水1000mL，煮沸后半小时，趁热用纱布过滤后，加葡萄糖20g，分装后再加入琼脂20g/L。121℃灭菌15min。

LB固体培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、蒸馏水1L、琼脂15-20g，pH值调整为7.4。121℃灭菌15min。

MRS固体培养基：10g蛋白胨、10g牛肉浸粉、5g酵母浸粉、20g葡萄糖、1mL吐温80、2g磷酸氢二钾、5g三水合乙酸钠、2g柠檬酸铵、0.2g七水硫酸镁、0.05g四水合硫酸锰、1L蒸馏水，pH值调整为6.2-6.6。121℃灭菌15min。

(2)发酵罐灭菌：将普洱茶发酵罐内部及管道采用高温蒸汽灭菌，115℃维持30min；(3)原材料预处理：将50kg普洱茶原料进行紫外预处理，紫外灯30W，紫外灯个数为20个，茶叶厚度约5cm，茶叶距离紫外灯的距离30cm，单只紫外灯的照射面积0.5m

(4)发酵罐接种发酵：

将50kg预处理后的普洱茶，3.5L孢子或菌悬液在发酵罐外洁净间进行混合，混合均匀后转入灭菌后的发酵罐，在0.5m

发酵过程中，控制发酵罐内温度参数如表10，通过每2-3天取样检测茶叶中的含水量，若茶叶中的含水量低于25％，通过雾化喷头补加无菌水，使茶叶中的含水量维持在30％，补水过程使发酵罐保持转动，转速10rpm，补水结束后继续转动发酵罐，维持5min，使补加的无菌水与罐内茶叶混合均匀；

表10：0.5m

(5)发酵过程茶叶pH值和茶褐素含量变化，结果如表11。

取发酵过程普洱茶样品1.00g，用碾钵粉碎，放入50mL小烧杯中，加入10mL的100℃去离子水、搅拌均匀，自然冷却至24-26℃，然后，将预先校准好的pH计插入冷却茶汤进行pH值测定。发酵过程茶叶pH值等于pH测得值减去1。

根据上文中针对0.5m

表11：0.5m

应用案例3

(1)菌种制备：

普洱茶发酵用的能够用于食品生产的微生物是指黑曲霉(Aspergillusniger3.350)、米曲霉(Aspergillus oryzae AS3.042)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis1389)、酿酒酵母、产阮假丝酵母以及乳酸菌，可在无菌条件下挑取保藏的微生物少许，接入相应的琼脂培养基上培养，其中黑曲霉、米曲霉、酿酒酵母、产阮假丝酵母可接入PDA固体培养基，在28℃培养条件下培养；枯草芽孢杆菌可接入LB固体培养基，在37℃培养条件下培养；乳酸菌可接入MRS固体培养基，在37℃培养条件下培养。将每种微生物分别培养后用适量无菌水制备成孢子或菌液，使每种微生物的孢子或菌个数的终浓度约为1×10

其中培养基的配置可以采用如下方法：

PDA固体培养基：将洗净后去皮的马铃薯200g，切碎，加水1000mL，煮沸后半小时，趁热用纱布过滤后，加葡萄糖20g，分装后再加入琼脂20g/L。121℃灭菌15min。

LB固体培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g、蒸馏水1L、琼脂15-20g，pH值调整为7.4。121℃灭菌15min。

MRS固体培养基：10g蛋白胨、10g牛肉浸粉、5g酵母浸粉、20g葡萄糖、1mL吐温80、2g磷酸氢二钾、5g三水合乙酸钠、2g柠檬酸铵、0.2g七水硫酸镁、0.05g四水合硫酸锰、1L蒸馏水，pH值调整为6.2-6.6。121℃灭菌15min。

(2)发酵罐灭菌：将普洱茶发酵罐内部及管道采用高温蒸汽灭菌，115℃维持30min；(3)原材料预处理：将50kg普洱茶原料进行紫外预处理，紫外灯30W，紫外灯个数为20个，茶叶厚度约5cm，茶叶距离紫外灯的距离30cm，单只紫外灯的照射面积0.5m

(4)发酵罐接种发酵：

将50kg预处理后的普洱茶，3.5L孢子或菌悬液在发酵罐外洁净间进行混合，混合均匀后转入灭菌后的发酵罐，在0.5m

发酵过程中，控制发酵罐内温度参数如表12，通过每2-3天取样检测茶叶中的含水量，若茶叶中的含水量低于25％，通过雾化喷头补加无菌水，使茶叶中的含水量维持在30％，补水过程使发酵罐保持转动，转速10rpm，补水结束后继续转动发酵罐，维持5min，使补加的无菌水与罐内茶叶混合均匀；

表12：0.5m

(5)发酵过程茶叶pH值和茶褐素含量变化，结果如表13。

具体的，根据上文中针对0.5m

表13：0.5m

本发明中“茶叶pH值”均是指pH测得值减去1(之所以减去1，是因为现有技术已知茶汤检测用的是水，与其他盐离子液的结果相差1；相关现有技术例如可参考：土壤pH值的测定——电位法，李海玲；红茶通氧发酵过程中发酵叶相变化分析，潘科)

另外，上述实施例仅为示例，例如，对于0.5m

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。