制备病毒载体的方法

优先权

本申请要求2019年12月10日提交的美国临时申请序列号62/946,082在35 USC§119下的优先权权益，该申请通过引用整体并入本文并用于所有目的。

技术领域

本公开总体上涉及过程过滤系统，更具体地涉及使用切向流过滤的系统。

背景技术

通常进行过滤以分离、澄清、改性和/或浓缩流体溶液、混合物或悬浮液。在生物技术和制药行业，过滤对于新药、诊断和其他生物产品的成功生产、处理和测试是至关重要的。例如，在使用动物或微生物细胞培养物制造生物制品的过程中，进行过滤是为了从培养介质中澄清、选择性去除和浓缩某些成分，或者在进一步处理之前改性介质。过滤也可用于通过将灌注培养物维持在高细胞浓度来提高产率。

生物制剂的制造过程已经通过大量的过程强化得到了进步。生产重组蛋白、病毒样颗粒(VLP)、基因治疗颗粒和疫苗的真核细胞和微生物细胞培养物现在都包括可以达到100e

病毒载体的下游纯化通常以分批方式进行。分批方式纯化可以导致较低的生产率、产品质量的变化、高的设备占地面积以及较高的生产成本。虽然已经报道了基于多柱的病毒载体的连续色谱纯化，但是这种方法可能涉及复杂的阀门切换和高的过程失败几率。这些基于多柱的方法还经常需要昂贵的树脂，这增加了生产成本。

基于沉淀的纯化比色谱纯化更便宜。这样的纯化先前已报道用于具有所有先前提到的缺点的分批方式。

发明内容

本公开描述了用于病毒载体的连续下游纯化的沉淀的用途。这种方法比多柱色谱方法更稳定且更便宜。

本公开在其各个方面总体上涉及制备病毒载体的方法，以及相关的装置和系统。根据本公开的实施方案(包括本文所述的那些)，可以特别地提高用于制备和纯化病毒载体的方法的有效性和效率。

在一个方面，制备病毒载体的方法可以包括使包含病毒载体和杂质的溶液通过中空纤维过滤器系统流入切向流过滤装置的进料通道。该溶液可以包含足以导致病毒载体沉淀但不导致杂质沉淀的量的盐。中空纤维过滤器系统产生的截留物可以再溶解。切向流过滤后，病毒载体可以进入渗透物。

在本文所述的各种实施方案或其他实施方案中，所述盐可以是磷酸钙。再溶解的步骤可以包括加入EDTA盐水。切向流过滤可以包括交替切向流过滤或切向流深度过滤。该方法可以包括使溶液流过器皿(vessel)，其中(a)该器皿将盐混合到溶液中，且(b)该器皿的特征在于停留时间的窄分布。

在一个方面，纯化病毒载体的方法可以包括使包含病毒载体和杂质的溶液流入切向流过滤装置的进料通道。该溶液可以包含足以导致杂质沉淀但不导致病毒载体沉淀的量的盐。沉淀的杂质可以不进入渗透物，而病毒载体可以进入渗透物。

在各个实施方案中,可以丢弃截留物。该盐可以包括季铵化合物。该盐可以包括十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。该方法可以包括使溶液流过器皿，其中(a)该器皿可以将盐混合到溶液中，且(b)该器皿的特征可以在于停留时间的窄分布。该器皿可以是螺旋流逆变反应器或搅拌釜反应器。切向流过滤装置可以是交替切向流(ATF)过滤装置或切向流深度过滤装置。

在一个方面，制备病毒载体的方法可以包括使包含病毒载体和杂质的溶液流过包含第一截留物通道和第一渗透物通道的第一过滤器。截留物可以从第一过滤器的第一截留物通道流入切向流过滤过滤器的第二截留物通道。截留物可以从第一过滤器的第一截留物通道再溶解。该溶液可以包含足以导致病毒载体基本上沉淀但不导致杂质沉淀的量的盐。病毒载体进入切向流过滤器的第二渗透物通道。

在各个实施方案中，所述盐可以是磷酸钙。再溶解可以进一步包括向截留物中加入EDTA盐水。切向流过滤器可以包括交替切向流(ATF)过滤器或切向流深度过滤器。该溶液可以流过器皿，其中(a)该器皿将盐混合到溶液中，(b)该器皿的特征在于停留时间的窄分布，且(c)该溶液从该器皿流向第一过滤器。可以包括第二过滤器。第二过滤器可包括与第一截留物通道流体连通的第三截留物通道。第二过滤器可包括与第一截留物通道流体连通的第三渗透物通道。第一混合器可以在第一截留物通道的上游。第二混合器可以在第三截留物通道的上游。缓冲剂可以流入第二混合器。第一过滤器和第二过滤器可各自包括平板盒、螺旋缠绕纤维过滤器或中空纤维过滤器。

在一个方面，浓缩病毒载体的方法可以包括使包含病毒载体和杂质的溶液流入中空纤维过滤器的第一截留物通道。截留物可以从中空纤维过滤器的第一截留物通道流入切向流过滤器的第二截留物通道。该溶液可以包含足以导致病毒载体基本上沉淀但不导致杂质沉淀的量的盐。基本沉淀的杂质可以截留在切向流过滤器的第二截留物通道中。病毒载体可以进入切向流过滤器的渗透物通道。

在各个实施方案中，所述盐可以是磷酸钙。通过向截留物中加入EDTA盐水，截留物可以从第一中空纤维过滤器的第一截留物通道中再溶解。切向流过滤器可以包括交替切向流(ATF)过滤器或切向流过滤器。该溶液可以流过器皿，其中(a)该器皿将盐混合到溶液中，(b)该器皿的特征在于停留时间的窄分布，且(c)该溶液从该器皿流向中空纤维过滤器。

在一个方面，纯化病毒载体的方法可以包括使包含病毒载体和杂质的溶液流入切向流过滤器的进料通道。该溶液可以包含足以导致杂质的基本上沉淀但不导致病毒载体沉淀的量的盐。基本上沉淀的杂质可以不进入切向流过滤器的渗透物中。病毒载体可以进入切向流过滤装置的渗透物中。

在各个实施方案中，将可以包含基本上沉淀的杂质的溶液从容器(container)流至废物。该盐可以包括季铵化合物。该盐可以包括十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。该溶液可以流过器皿，其中(a)该器皿将盐混合到溶液中，(b)该器皿的特征在于停留时间的窄分布，且(c)该溶液从该器皿流至容器。该器皿可以是螺旋流逆变反应器或搅拌槽反应器。切向流过滤器可以是交替切向流(ATF)过滤器或切向流过滤器。

附图说明

图1是根据本公开实施方案的用于纯化病毒载体的系统的示意图。

图2是根据本公开实施方案的用于浓缩病毒载体的系统的示意图。

图3是根据本公开实施方案的用于连续纯化病毒载体并使杂质沉淀的系统的示意图。

具体实施方式

综述

在基于沉淀的病毒载体的连续纯化中，使用了反应器和过滤系统。该反应器可以是连续搅拌釜反应器(CSTR)或卷曲螺旋反应器(CCR)。过滤系统可以作为交替切向流(ATF)过滤器、切向流过滤器(TFF)或切向流深度过滤器(TFDF)来运行。该方法可用于(i)纯化病毒载体，(ii)浓缩病毒载体，或(iii)从病毒载体进料中去除杂质。示例性的过滤器可以包括中空纤维过滤器，中空纤维过滤器具有例如对于TFDF运行而言约1kda至约15μm的孔径，或者对于以TFF或ATF方式中的一种或两种运行的TFDF过滤器而言具有更大的孔径。在本文所述的各种实施方案中，由于截留物通道内沿着过滤器的流动方向的变化，以ATF方式运行的TFF可以具有较少的结垢(与非ATF相比)。这可以提高过滤器的性能。在本文所述的各种实施方案中，TFDF可以允许更快的流速，但是它可以具有比TFF或ATF更低的过滤能力。

在某些实施方案中，混合溶液，并将所得材料通过重力、诱导压力(例如，磁力泵、蠕动泵或隔膜/活塞泵)或其他力流过系统。材料以取决于产品或存在的杂质的沉淀动力学的速率移动通过系统。一旦材料到达包含ATF、TFF、TFDF等的过滤系统，压力系统就推动材料通过过滤系统。在一些实施方案中，压力系统可以包括隔膜泵。

在某些实施方案中，可能的杂质可以由宿主细胞蛋白质和用于进料培养基中的营养物组成。

在某些实施方案中，该系统包含反应器，例如卷曲螺旋反应器，即螺旋流逆变反应器，或连续搅拌釜反应器。不希望被任何理论束缚，据信螺旋流逆变反应器起到增强径向混合的作用，产生窄的停留时间分布。卷曲螺旋反应器或连续搅拌釜反应器的使用取决于沉淀动力学。在一些实施方案中，混合的材料将流入一系列静态混合器和中空纤维过滤器中，以去除杂质。膜孔径可以变化，并且可以取决于系统中存在的病毒载体和沉淀物的尺寸。当材料流过一系列静态混合器和中空纤维过滤器时，从系统中去除废物并添加缓冲剂。这种系统的所得截留物含有沉淀物，该沉淀物在流过过滤系统之前被再溶解。过滤系统的部分可以包括ATF、TFF或TFDF操作，并且可以包括中空纤维、平板盒式过滤器或螺旋缠绕纤维过滤器。

在某些实施方案中，该系统包含反应器，例如卷曲螺旋反应器，即螺旋流逆变反应器，或连续搅拌釜反应器。病毒载体在这样的反应器中沉淀，且得到的混合物流经中空纤维过滤器。所得的截留物含有沉淀物，并且可以再溶解以流过过滤系统。过滤系统的部分可以包括ATF、TFF或TFDF操作，并且可以包括中空纤维、平板盒式过滤器或螺旋缠绕纤维过滤器。

在某些实施方案中，该系统含有反应器，例如卷曲螺旋反应器，即螺旋流逆变反应器，或连续搅拌釜反应器。含有杂质的溶液在所述反应器中混合，使杂质沉淀。所得混合物具有从系统中去除的沉淀的杂质，且所得溶液流过过滤系统。过滤系统的部分可以包括ATF、TFF或TFDF操作，并且可以包括中空纤维、平板盒式过滤器或螺旋缠绕纤维过滤器。

在某些实施方案中，该系统用于蛋白质、纳米颗粒和病毒(例如，AAV、慢病毒；病毒样颗粒、微粒、微载体、微球体、纳米颗粒等)。

在某些实施方案中，病毒载体被沉淀。不希望被任何理论束缚，据信沉淀病毒载体允许通过过滤从溶液中去除病毒载体，沉淀的病毒载体在截留物中。该方法用于病毒载体的纯化、病毒载体的浓缩或类似过程。

在一些实施方案中，杂质被沉淀。然后从混合物中去除沉淀的杂质，且所得溶液流过过滤系统。

在一些实施方案中，不纯的病毒载体与沉淀剂(即磷酸钙、硫酸铵)在生物反应器(特别是卷曲螺旋反应器或连续搅拌釜反应器)中混合。沉淀剂特别地使病毒载体沉淀。溶液流过一系列静态混合器和中空纤维过滤器。不希望被任何理论束缚，使用这种系列是为了增加病毒载体的沉淀并从系统中去除这些病毒载体。从过滤器中收集含有沉淀物的截留物，并加入溶液(即0.1M EDTA盐水)以再溶解病毒载体。过滤再溶解的溶液以产生纯的病毒载体。

在一些实施方案中，稀释的病毒载体与沉淀剂(即磷酸钙)在生物反应器(特别是卷曲螺旋反应器或连续搅拌釜反应器)中混合。沉淀剂特别地使病毒载体沉淀。溶液流过中空纤维过滤器。所得的截留物含有沉淀的病毒载体，且所得的渗透物作为废物被除去。将沉淀物再溶解并过滤，产生浓缩的病毒载体。

在某些实施方案中，不纯的病毒载体与沉淀剂(即十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、溴化度米芬等)在反应器(特别是卷曲螺旋反应器或连续搅拌釜反应器)中混合。沉淀剂特别地使溶液中的杂质沉淀。混合后，从混合物中除去杂质，其中过滤含有病毒载体的溶液，产生纯化的产物。

在某些实施方案中，可能需要进一步的下游处理以去除微量的杂质。在一些实施方案中，细胞培养物流体在用于所述系统之前，应该是澄清的。如果连接到连续澄清系统，上游生物反应器可以直接整合到所述系统中。

图1图示了用于制备和纯化病毒载体的示例性系统。系统100包括反应器106，例如卷曲螺旋反应器，该反应器连接到第一混合器和第二混合器108、109以及第一中空纤维过滤器和第二中空纤维过滤器110、111的系统(例如，串联的中空纤维和混合器的组合可称为可在ATF或TFF中操作的“级”)。尽管图示了两个级，但是可以使用任何数量的级(例如，0、1、2、3、4、10等)。使用的级数将取决于产量要求。级数的增加增加了产品产量，但也增加了系统成本。将不纯的病毒载体102和盐104(例如磷酸钙、硫酸铵、另一种沉淀剂等)加入到反应器106中，以形成和/或混合成溶液，用于流过系统100。溶液可从反应器106流到设置于第一中空纤维过滤器110上游的第一混合器108。第一混合器108被配置为将溶液与下游渗透物混合(如下所述)。第一混合器108的产物可流入第一中空纤维过滤器110。第一中空纤维110通过第一渗透物通道116将一些杂质过滤掉进入废物中。第一中空纤维过滤器110的第一截留物通道与设置于第二中空纤维过滤器111上游的第二混合器109流体连通。第二混合器109被配置为将来自第一截留物通道的截留物与缓冲剂118混合，以帮助沉淀加入第二混合器109的病毒载体。第二混合器109的产物可流入第二中空纤维过滤器111。第二中空纤维过滤器111通过第二渗透物通道117过滤掉一些杂质(例如，不期望的物质)和未沉淀的病毒载体，该第二渗透物通道117可流至第一混合器108，用于如上所述的进一步处理。在各个实施方案中，过滤器的孔径可以取决于沉淀物和产物的粒径。缓冲剂流速与入口进料流速的比率可以取决于所需的产物产量。增加缓冲剂流速与入口进料流速的比率可以增加产物产量，但是可能需要额外的缓冲剂，并且可能稀释产品。第二中空纤维过滤器111的第二截留物通道与容器112流体连通，使得第二截留物通道的产物可流入容器112。含有沉淀的病毒载体的容器112可通过加入盐水120(例如，约0.1M EDTA盐水等)来基本上再溶解成溶液。容器112内的再溶解溶液可流过第三过滤器114(例如，ATF，TFF，TFDF操作中的过滤器)。第三过滤器114通过第三渗透物通道122过滤出基本上纯化的病毒载体。

图2图示了用于浓缩病毒载体的示例性系统。系统200包括连接到中空纤维过滤器208的反应器206，例如卷曲螺旋反应器。尽管图示了一个中空纤维过滤器208，但是可以使用任何数量的过滤器(例如，2、3、4、10等)。将稀释的病毒载体202和盐204(例如磷酸钙、硫酸铵、另一种沉淀剂等)加入到反应器206中，以形成和/或混合成溶液，用于流过系统200。溶液可从反应器206流至中空纤维过滤器208。中空纤维过滤器208通过可流至废物的渗透物通道214过滤掉一些杂质和未沉淀的病毒载体(例如，不期望的物质)。中空纤维过滤器208的第一截留物通道与容器210流体连通，使得基本上沉淀的病毒载体可从第一截留物通道流至容器210。含有沉淀的病毒载体的容器210可通过加入盐水220(例如，约0.1M EDTA盐水等)再溶解成溶液。容器210内的再溶解溶液可流过切向过滤器212(例如，以ATF方式、TFF方式、TFDF方式等操作)。切向过滤器212通过第二渗透物通道222过滤出基本上浓缩的病毒载体。切向过滤器212可连续操作，以通过第二渗透物通道222产生浓缩的病毒载体，而不向容器210中添加另外的流体，因为切向过滤器212的截留物可在容器210和切向过滤器212之间往复流动。以这种方式，切向过滤器212可以继续扩增从第二渗透物通道222产生的浓缩病毒载体，而无进一步的处理步骤和/或设备。

图3图示了用于使溶液中的杂质沉淀并纯化病毒载体的示例性系统。系统300包括反应器306，例如卷曲螺旋反应器。尽管未示出中空纤维过滤器(如本文所述)，但可与反应器306串联使用任意数量的过滤器(例如，1、2、3、4、5、6、8、10、15、20、50、100等)。将不纯的病毒载体302(例如，腺相关病毒(AAV)载体)和盐304(例如，CTAB、溴化度米芬、另一种沉淀剂等)加入到反应器306中，以形成和/或混合成溶液，用于流过系统300。溶液中的杂质(例如，不期望的物质)在反应器306中基本上沉淀，且混合溶液可从反应器306流至容器308。含有沉淀的杂质的容器308可流过切向过滤器310(例如，ATF、TFF、TFDF等)。切向过滤器310通过渗透物通道322过滤出基本上纯化的病毒载体。沉淀的杂质被截留在切向过滤器310的截留物通道中，并被保持或返回至容器308。容器308包括废物通道324，以接收(例如，“排出”)来自容器308的沉淀的杂质。可以使用泵、重力、计量阀、定时阀、手动阀、开放流动路径、受限流动路径、过滤器、其组合等使废物通道324流动。切向过滤器310可连续操作，以通过渗透物通道322产生纯化的病毒载体，因为切向过滤器310的截留物可在容器308和切向过滤器310之间往复流动。随着沉淀的杂质从反应器306流入容器308，沉淀的杂质进一步从容器308流入废物通道324。因此，可以在容器308中保持基本上一致的流体体积，使得过滤器310不过载，不耗尽待过滤的流体，并且保持基本一致的质量流率。从反应器306至容器308的流率、沉淀的杂质进入废物通道324的流率、以及流体从容器308进入过滤器310的截留物的流率的比率可以被设置成使得通过渗透物通道322生产纯化的病毒载体的系统300的连续操作被维持，而无进一步的处理步骤和/或设备。

结论

前述公开已经呈现了根据本公开的过滤系统的几个示例性实施方案。这些实施方案不旨在限制，并且本领域技术人员将容易理解，在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以对上述系统和方法进行各种添加或改进。此外，虽然前述公开主要集中在交替切向流过滤系统及其应用上，但是本领域技术人员将会理解，本公开的原理适用于包括中空纤维TFF和TFDF以及其他过滤系统的其他系统。