一种用于检测PCV3的ELISA试剂盒

技术领域

本发明涉及家畜致病性病毒诊断技术领域，具体涉及一种用于检测PCV3的ELISA试剂盒。

背景技术

猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)目前已确认的有四种基因型：PCV1、PCV2、PCV3、PCV4。PCV1为非致病性病毒，后三种皆为致病性病毒。

感染PCV3的猪表现为猪皮炎和肾病综合征(PDNS)、繁殖障碍、呼吸道、胃肠道和神经系统疾病、多系统炎症、心肌炎等。PCV3基因组已通过PCR方法在口腔液和鼻拭子以及粪便、精液和初乳中检测到，通过直接接触的水平传播可能是主要的传播途径。PCV3的致病性和免疫机理目前尚不清楚，它的高发生率可能对全球养猪业构成潜在威胁，PCV3的广泛存在已引起世界各国养猪业的高度关注。

PCV3目前的检测方法中以PCR法准确性最高，但是PCR方法检测繁琐，对操作人员的技术要求较高，对仪器设备的要求也高，给推广应用带来不便。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够方便快速检测PCV3的ELISA试剂盒，检测灵敏度和特异性都非常高，检测结果准确。

本发明技术方案详述如下：

一种用于检测PCV3的ELISA试剂盒，包括PCV3 Cap蛋白抗原肽包被的ELISA板，所述PCV3 Cap蛋白抗原肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

可选或优选的，上述试剂盒中，所述PCV3 Cap蛋白抗原肽的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

可选或优选的，上述试剂盒中，所述PCV3 Cap蛋白抗原肽通过以下方法制备：

(1)以猪圆环病毒PCV3 LY株的组织病毒液提取DNA作为模板，以SEQ ID NO:3～4所示核苷酸序列为引物，进行PCR扩增，获得目的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

(2)将目的基因与载体PET-28a(+)分别经双酶切后再连接获得PET-Cap重组质粒；

(3)将PET-Cap重组质粒转入宿主菌大肠杆菌BL21，培养，鉴定阳性克隆；

(4)鉴定正确后，将宿主菌接种于含氨苄青霉素的LB培养基，37℃条件下振摇培养；

(5)培养至对数生长期，将培养温度降至30℃并加入IPTG至终浓度1.0mmol/L进行诱导培养4小时；

(6)将诱导培养表达的菌液取出，离心去上清，加入PBS重悬菌体，裂解破碎，按体积比1:1加入2×上样buffer煮沸10min，离心取上清；

(7)上清液用His标签纯化试剂盒对目的蛋白进行纯化，获得PCV3 Cap蛋白抗原肽。

可选或优选的，上述试剂盒中，所述PCV3 Cap蛋白抗原肽的包被方法如下：将PCV3Cap蛋白抗原肽用pH9.5的0.05mol/L的PBS稀释至12.5μg/mL，加入包被板中，100μL/孔，置4℃过夜，用PBS洗涤3次后，加入封闭液封闭过夜，次日，弃掉封闭液，湿度40％、室温条件下，自然干燥48小时，完成包被。

可选或优选的，以上任一所述试剂盒中，还包括：

阳性对照血清：用PCV3 LY株制备灭活疫苗，免疫SPF猪后采血获得血清，用PBS按1：200倍进行稀释；

阴性对照血清：SPF猪采血获得的血清；

样品稀释液：用PBS稀释的体积浓度3％的羊血清溶液；

酶标记二抗：用酶标抗体稀释液稀释10000倍制成的辣根过氧化物酶标记的羊抗猪抗体；

洗涤液：PBS；

底物溶液A：按柠檬酸1.6g、醋酸钠13.6g、体积浓度30％的双氧水0.3ml，加蒸馏水至500mL制成；

底物溶液B：乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)0.2g、柠檬酸0.95g、TMB 0.15g，溶解于50mL DMSO(二甲基亚砜)中，加蒸馏水定容至500mL制成；

终止液：2mol/L的硫酸溶液。

可选或优选的，上述试剂盒中，所述PBS按NaCl 8.0g、KCl 0.2g、Na

说明：

PET-28a(+)：一种表达载体，含有抗卡那霉素基因，对应的表达宿主菌是大肠杆菌，用于表达目的基因，基因组中含有蛋白标签N-His、N-T7或C-His，可用IPTG或乳糖及其类似物进行诱导表达。

大肠杆菌BL21：一种广泛蛋白表达用宿主菌，又称大肠杆菌BL21(DE3)菌。染色体上携带由lacUV5启动子控制的T7 RNA聚合酶基因，在IPTG诱导下可以高效表达T7启动子驱动的外源目的基因。

IPTG：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，化学式为C

上样buffer：上样缓冲液，也称loadingbuffer，上述步骤(6)中的上样buffer是指蛋白上样缓冲液，主要采用Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸)或Tris甘氨酸、与EDTA盐(乙二胺四乙酸二钠)，必要情况下还需添加SDS(十二烷基硫酸钠)、DTT(二硫苏糖醇)、溴酚蓝、甘油等。

封闭液：用于防止抗体与组织或Fc受体发生非特异性结合，以降低背景信号并减少假阳性。

PBS：phosphate buffer saline，磷酸缓冲盐溶液，一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的用于检测PCV3的ELISA试剂盒，使用独特的Cap蛋白抗原肽作为一抗进行ELISA板包被，能够通过现场采集血清就可检测是否有PCV3感染，特异性强、灵敏度高、可重复性好且检测速度快，检测更方便、更准确。

保藏信息：

名称：猪圆环病毒3型PCV3 LY株(简称PCV3 LY株)；

保藏单位：中国典型培养物保藏中心；

保藏地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072；

保藏编号：CCTCC NO.V202208；

保藏时间：2022年3月10日。

附图说明

图1为PCV3 ORF2基因核酸电泳，M:5000Marker；1.目的基因；2.阴性水对照。

图2为表达PCV3 Cap蛋白SDS-PAGE电泳，1.工程菌全菌诱导表达蛋白(未纯化)；2.工程菌未诱导表达蛋白；3.纯化后目的蛋白。

具体实施方式

下面结合较佳的具体实施例对本发明进行详细的描述，本发明所用到的化学药品或试剂，可以根据其功能选用已有的其它类型的产品，而不仅限于实施例的具体记载。对于实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。

实施例1制备PCV3 Cap单因子血清抗体

1、PCV3的Cap蛋白抗原制备

根据PCV3 ORF2基因两端的一段序列与表达性载体PET-28a(+)的多克隆酶切位点，设计针对PCV3 ORF2的如下特异性引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

PCV3 ORF2-F：5′-GGG GGA TCC ATG AGA CAC AGA GCT ATA TTC-3′(加入了BamHⅠ酶切位点)，

PCV3 ORF2-R：5′-GGG AAG CTT TTA GAG AAC GGA CTT GTA ACG-3′(加入了HindⅢ酶切位点)。

以发明人前期筛选到的一株猪圆环病毒3型的毒株PCV3 LY株(保藏编号CCTCCNO:V202208)的病毒培养液提取的DNA为模板，进行PCR扩增。扩增产物大小为645bp的目的基因，详见图1。

用DNA纯化回收试剂盒回收扩增的目的基因，同时将目的基因与载体PET-28a(+)双酶切、连接酶连接获得PET-ORF2重组质粒，将该重组质粒按常规方法转入表达性大肠杆菌BL21宿主菌，培养，挑取单个克隆，酶切法鉴定阳性克隆，摇菌，测序，测序结果显示其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，翻译的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。将此序列经NCBI网站的BLAST工具分析发现其为PCV3新的基因序列，与已知PCV3毒株基因序列同源性在87.08-87.85％左右，与已知PCV3毒株氨基酸序列的同源性在90.70～93.49％，与其他PCV(PCV2/PCV4)基因组的同源性为43.2％～51.5％。

为了排除此基因是由于扩增过程中产生的误差，进行了多次扩增和测序，证明PCV3 LY株中扩增出的表达PCV3的Cap蛋白基因为新基因，能够表达新型Cap蛋白。

2、制备新型Cap蛋白作为抗原肽

将测序结果正确的单个克隆重组质粒PET-ORF2转化的表达性BL21宿主菌，接种于5mL含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB细菌培养基，37℃振摇培养过夜，次日取出1mL培养物接种于120mL的LB培养基中，37℃振摇培养2.5h后，菌液摇至半透明半浑浊状态，吸光光度法测得OD600＝0.6～0.8(到达对数生长期)，在诱导前先取10mL作为诱导前对照，并将振摇温度变为30℃加IPTG(终浓度为1.0mmol/L)诱导，诱导4h收集10ml菌液，以诱导未转化PET载体的菌液作为空白对照，以诱导转化PET载体的菌液作为空载体对照。

将诱导表达的菌液取出，离心弃上清，再用0.5mL 1×PBS重悬菌体，超声波裂解破碎细菌后，按1:1加2×上样Buffer煮沸10min，离心取上清，上清用12％SDS-PAGE电泳鉴定分析获得约27～28kDa的目的蛋白，详见图2。利用His标签纯化试剂盒按规定操作对目的蛋白进行纯化。纯化后的His-Cap蛋白的纯度为95％以上，蛋白浓度为1.05mg/mL，为带有组氨酸标签的Cap蛋白(SEQ ID NO:1所示蛋白序列带组氨酸标签)。

3、PCV3 Cap蛋白抗原肽包被ELISA板

步骤2获得的His-Cap蛋白即为带组氨酸标签的PCV3 Cap蛋白抗原肽，用pH9.5的0.05mol/L的PBS稀释至12.5μg/mL，加入96孔ELISA包被板中，100μL/孔，置4℃过夜，用PBS洗涤3次后，加入质量浓度1％的牛血清白蛋白封闭液封闭过夜，次日，弃掉封闭液，室温、湿度40％之下，自然干燥48小时，完成包被，最后真空包装。

实施例2ELISA试剂盒制备及使用

1、用于检测PVC3的ELISA试剂盒构建

试剂盒内包括以下表1中所列成分：

表1、猪圆环病毒3免疫组化检测试剂盒

试剂盒置于冰箱4℃保存。

2、试剂盒使用方法

(1)从冰箱中取出试剂盒，恢复至室温(25℃左右)；

(2)用样品稀释液将待检血清做1:150倍稀释(例如：取待检血清1μL+149μL样品稀释液，混匀)；

(3)加100μL不需稀释的阴性对照血清至ELISA板A1和A2孔中；

(4)加100μL不需稀释的阳性对照血清至ELISA板A3和A4孔中；

(5)加100μL样品稀释液至ELISA板A5和A6孔中，作为空白背景对照；

(6)加100μL稀释好的待检血清样品至ELISA板其他空白的孔中；

(7)将加好样品的ELISA板置于室温孵育45分钟或者置于37℃恒温培养箱孵育30分钟；

(8)洗涤：向ELISA板孔中加入PBS，每孔加300μL，反复洗涤3～5次；

(9)向包被板中加入酶标记二抗，每孔100μL，置于室温孵育45分钟或者置于37℃恒温培养箱孵育30分钟；

(10)洗涤：重复步骤8；

(11)显色：加入底物溶液A和底物溶液B各50μL，轻轻摇匀，37℃恒温培养箱孵育10分钟；

(12)终止：每孔加终止液50μL，终止反应；

(13)读数：将ELISA板置于酶标仪上，读取450nm波长下的光吸收值；

计算方法：阴性对照平均值＝(A1孔+A2孔)/2；阳性对照平均值＝(A3孔+A4孔)/2。

待检样品阳性判定标准：当判定标准阳性对照血清OD

计算公式：S/P值＝待检样品OD

实施例3试剂盒敏感性、特异性、重复性验证

(1)特异性实验

随机抽取一批用于检测PVC3的ELISA试剂盒，对实验室保存的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型等阳性血清样品进行检测，结果除PCV3阳性血清样品为阳性外，其他检测结果均为阴性结果，进一步说明本发明检测的猪圆环病毒3型抗体诊断试剂盒不会出现假阴性，具有良好特异性。

(2)ELISA和琼脂扩散试验检测方法(ADT)灵敏性、重复性对比实验

分别应用ELISA(表1成分的试剂盒)和ADT方法和对由河北、辽宁、河南、山东及四川等地猪场送检的187份临床诊断疑似PCV3感染猪的血清样品进行了对比检测。ELISA和ADT检测不同地区来源血清样品结果见下表2。

表2、两种方法对134份样本阳性检出率比较

利用猪圆环病毒3型抗体的ELISA检测试剂盒和ADT方法对187份临床血清样品进行对比检测结果显示，ADT检测阳性的血清与ELISA检测阳性的均一致，但ELISA检测血清阳性数较ADT检测血清阳性数多24个，分别是河北7个、辽宁8个、河南3个、山东4个、四川2个。

同时，对上述ELISA检测结果阳性多出来的24个血清样品进行两次重复检测，ELISA检测结果与第一次结果相同，第二、三次ADT检测结果与第一次检测结果也一致，说明ELISA检测结果和ADT检测结果可重复性均良好，但ELISA检测结果更灵敏，重复性检测结果见下表3。

表3、ELISA和ADT方法对24份样本重复性检测结果比较

综上，对本发明试剂盒具有如下优势：

A检测结果准确性高，不会产生假阳性和假阴性结果。

B敏感性和特异性较高：ELISA试剂盒检测结果较ADT检测结果更灵敏，均不与其它猪病原阳性血清反应，特异性较好。

C临床应用效果较好：利用此试剂盒对临床187份疑似PCV3引发的猪血清样品进行检测，同时用ADT方法进行验证，结果检测出97份血清PCV3抗体阳性，此试剂盒检测结果与第二、三次PCR方法检测结果一致，证明了此试剂盒检测结果的灵敏性、特异性及可重复性较高，临床应用效果较好。

实施例4用于检测PVC3的ELISA试剂盒对PCV3 LY株灭活疫苗免疫效力应用评价试验

1、PCV3 LY株灭活疫苗免疫前ELISA抗体水平检测

随机选取10头4-6周龄SPF猪(猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒抗原、抗体检测均为阴性)，其中猪圆环病毒3型抗体采用本发明试剂盒进行检测，检测结果均为阴性，详见下表4。

2、PCV3 LY株灭活疫苗免疫后ELISA抗体水平检测

将10头SPF猪随机分成2组，每组5头。采用PCV3疫苗免疫其中1组，剩余1组不免疫作为空白对照。于免疫后28天对所有试验猪采血，分离血清检测抗体水平，结果显示，疫苗免疫后抗体水平均升高，未免疫对照组抗体仍为阴性，表明该PCV3 ELISA抗体检测试剂盒可以作为PCV3疫苗免疫效力评价应用，详见表4。

表4、PCV3抗体ELISA检测试剂盒对PCV3 LY株疫苗免疫效力应用评价试验结果

注：S/P≥0.3为阳性；S/P＜0.3为阴性。

本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 山东信得科技股份有限公司

<120> 一种用于检测PCV3的ELISA试剂盒

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 214

<212> PRT

<213> 猪圆环病毒(Porcine circovirus)

<400> 1

Met Arg His Arg Leu Val Thr Asn Pro Asn Phe Phe Gly Ala Val Glu

1 5 10 15

Val Ala Met Ser Asp Ile His Val Asp Thr Tyr Tyr Thr Lys Gln Cys

20 25 30

Ser Pro Leu Asn Gly Gly Val Ile Cys Val Gln Pro Trp Gly Gly Ser

35 40 45

Gly Glu Val Glu Glu Ala Leu Ser Trp Val Ser Ala Gly Ser Ser Arg

50 55 60

Gln Asn Trp Phe Gly Gly Glu Val Thr Ala Val Ile Ser Phe Glu Tyr

65 70 75 80

Tyr Lys Ile Lys Asp Glu Ser Tyr Gln Thr Lys Thr Met Phe Gly Pro

85 90 95

Arg Ala Ile Asp Leu Asp Gly Ala Trp Thr Thr Asn Thr Trp Pro Glu

100 105 110

His Ser Phe Cys Leu Leu Ser Arg Arg Asn Tyr Arg Ala Glu Cys Asn

115 120 125

Phe His Leu Arg Tyr Leu Ile Ile Phe Lys Ala Asn Gly Ser Phe Pro

130 135 140

Phe Val Pro Ala Gly Asn Glu Val Val Gly Val Pro Gly Leu Val Ile

145 150 155 160

Leu Arg Gly Ser Asn Gly Asn Asp Val His Gly Gly Val Phe Leu Cys

165 170 175

Val Val Cys Ala Ser Cys Gly Pro Pro Asn Glu Ser Phe Ser Ser Asp

180 185 190

Ile Ala Pro Ser Val Ala Ser Ser Ser Pro Trp Ala Gly Ser Ser Ser

195 200 205

Glu Tyr Ser Ser Val Ser

210

<210> 2

<211> 645

<212> DNA

<213> 猪圆环病毒(Porcine circovirus)

<400> 2

atgagacaca gacttgtaac gaatccaaac ttctttggtg ccgtagaagt cgctatgtca 60

gatattcatg tcgacacata ctacacaaag cagtgctccc cattgaacgg tggggtcata 120

tgtgttcagc catggggtgg gtctggagaa gttgaagagg ctttgtcctg ggtgagcgct 180

ggtagttccc gccagaattg gtttgggggt gaagtaacgg ctgtgattag ctttgaatat 240

tataagatta aagatgaaag ttaccaaaca aaaactatgt tcgggccaag agccatagat 300

ctagacggcg cctggaccac aaacacttgg cccgaacata gtttttgttt gctgagccgg 360

agaaattaca gggctgagtg taactttcat cttcgttatc ttataatatt caaagctaat 420

ggcagtttcc cattcgttcc ggcgggtaat gaagtggttg gcgtgccagg gcttgttatt 480

ctgaggggtt ccaacggaaa tgacgttcat ggtggagtat ttctttgtgt agtatgtgcc 540

agctgtgggc ctcctaatga aagcttttct tctgacatag cgccttctgt ggcgtcgtcg 600

tctccttggg cggggtcttc ttctgaatat agctctgtgt cttaa 645