芦丁类化合物与靶向NKG2D配体的CAR-T细胞联合制备治疗恶性肿瘤的药物

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及芦丁类化合物与靶向NKG2D配体的CAR-T细胞联合在制备治疗恶性肿瘤的药物中的用途。

背景技术

癌症等恶性疾病严重危害人类健康，嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞技术被认为是目前最有效的恶性肿瘤的治疗方式之一，它是将经过基因工程修饰的T淋巴细胞(可以表达特异性嵌合抗原受体)回输至人体，激活人体自身免疫系统，从而持续地杀伤恶性肿瘤细胞。而NKG2D属于C型凝集素样受体家族，是一种II型跨膜糖蛋白，几乎在人体所有组织来源的肿瘤细胞上有不同程度的表达NKG2D配体，很少会出现在健康细胞的表面，因此靶向NKG2D配体的CAR-T将能够极大提高对肿瘤细胞的识别和杀伤作用。

虽然CAR-T细胞疗法在一些临床试验中取得了较好的效果，但是它在治疗过程中会产生较大的副作用(例如细胞因子释放综合征、神经毒性和脱靶效应等)，且对靶细胞的杀伤效果不足够强。此外，癌症患者的免疫系统往往比较弱，体内免疫细胞的数量较少、杀伤肿瘤细胞的能力并没有预想的强。因此，有必要进一步研究CAR-T细胞疗法以增强其对肿瘤细胞的杀伤效果。

芦丁(Rutin)是一种黄酮醇型黄酮类化合物，又称为芸香甙或维生素P。芦丁被报道有多种药理活性，包括抗氧化、抗炎、抗病毒、抗血栓、保护血管等功效。目前，业界还未见芦丁类化合物与靶向NKG2D配体的CAR-T细胞在治疗肿瘤方面的联用报道。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了芦丁类化合物与靶向NKG2D配体的CAR-T细胞联合在制备治疗恶性肿瘤的药物中的新用途，二者的联用产生显著的协同杀死肿瘤细胞的作用。

第一方面，本发明提供了芦丁类化合物与靶向NKG2D配体的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)联合在制备治疗恶性肿瘤的药物中的用途。

本申请的申请人发现，芦丁类化合物可以上调恶性肿瘤表达NKG2D配体，进而明显增强靶向NKG2D配体的CAR-T细胞对恶性肿瘤细胞的识别、杀死效果，两者的联用表现出协同效应，可达到良好的治疗肿瘤效果，并可使靶向NKG2D配体的CAR-T细胞的用量降低、降低单独的CAR-T细胞治疗导致的副作用。此外，芦丁类化合物为小分子有机化合物，价格便宜，能够降低CAR-T细胞的免疫治疗成本。

本发明中，所述芦丁类化合物可以包括芦丁及其衍生物。其中，芦丁衍生物包括能够通过简单的化学方法(如还原、取代等方法)对骨架上的侧链基团进行修饰和/去除，而仍然保留增强嵌合抗原受体T细胞杀伤功能的各种衍生物，还包括以上各种物质的药学上可接受的盐、异构体、金属络合物等。

可选地，所述芦丁类化合物包括芦丁(CAS号是153-18-4，结构式如下式(Ⅰ)所示)、曲克芦丁(CAS号是7085-55-4，结构式如下式(Ⅱ)所示)、芦丁铬、槲皮素(CAS号是117-39-5，结构式如下式(Ⅱ)所示)等中的一种或多种，但不限于此。

其中，所述恶性肿瘤包括白血病、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤、脑胶质瘤、结肠癌、胃癌、食管癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、宫颈癌和前列腺癌中的一种或多种，但不限于此，只有是可表达NKG2D配体的肿瘤即可。将芦丁类化合物与靶向NKG2D配体的CAR-T细胞联用后，特别是对胃癌、食管癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、宫颈癌和前列腺癌等实体肿瘤的治疗效果更显著。

可选地，所述靶向NKG2D配体的CAR-T细胞的给药方式为注射，例如，具体包括静脉注射、动脉注射、皮下注射、皮内注射、鞘内注射或肌内注射。可以将CAR-T细胞溶解或悬浮在适合于注射给药中可接受载体中的溶液，包括等渗无菌的注射水溶液和非水溶液。而芦丁类化合物的常见给药方式包括口服或注射等。例如，曲克芦丁通常以其注射液的形式给药，芦丁、芦丁铬及槲皮素可以以口服的片剂给药。

当将芦丁类化合物与靶向NKG2D配体的CAR-T细胞联合使用时，二者可以是先后给药或同时给药，二者的给药方式可以相同或不同。例如，先将所述芦丁类化合物口服或注射给药，再将所述靶向NKG2D配体的CAR-T细胞注射给药，这样可以先通过芦丁类化合物激发患恶性肿瘤的患者体内产生较多NKG2D配体，进而增强靶向NKG2D配体的CAR-T细胞对恶性肿瘤细胞的识别、治疗效果；且不会影响靶向NKG2D配体的CAR-T细胞自身的细胞活性。

本申请一些实施方式中，所述靶向NKG2D配体的嵌合抗原受体T细胞具有靶向NKG2D配体的嵌合抗原受体CAR-NKG2D，其中，所述CAR-NKG2D包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向NKG2D配体的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列；所述靶向NKG2D配体的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

其中，所述靶向NKG2D配体的单链抗体为人源化单链抗体，可以避免引起人机体的免疫反应，具有较高的安全性。可选地，所述靶向NKG2D配体的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。

在本发明一实施方式中，所述胞外铰链区为CD8α铰链区；所述跨膜区为CD8跨膜区；所述胞内信号区包括从氨基端到羧基端顺次连接的4-1BB信号区和CD3ζ信号区。即，所述CAR-NKG2D的氨基酸序列包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向NKG2D配体的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的氨基酸序列。可选地，所述CAR-NKG2D的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。进一步可选地，所述CAR-NKG2D的编码基因包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

进一步地，所述CAR-NKG2D的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向NKG2D配体的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因。此时，所述CAR-NKG2D的编码基因可以包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。与SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列相比，SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列中多了信号肽的编码基因。其中，信号肽的编码基因可较好地指导CAR-NKG2D表达到T细胞表面，但在CAR-NKG2D表达到T细胞表面时，信号肽在蛋白翻译成熟过程中被信号肽酶切割。

可选地，所述靶向NKG2D配体的CAR-T细胞中的T细胞来自自体T细胞、异体T细胞或iPSC诱导的T细胞。优选为来自患恶性肿瘤的患者的自体T细胞，以使将靶向NKG2D配体的CAR-T细胞回输至患者体内时的免疫反应降至最低。

第二方面，本发明还提供了一种治疗恶性肿瘤的药物，所述药物包括芦丁类化合物和靶向NKG2D配体的CAR-T细胞。

可选地，所述靶向NKG2D配体的CAR-T细胞的给药方式为注射；而芦丁类化合物的常见给药方式包括口服或注射等。可选地，所述药物中，靶向NKG2D配体的CAR-T细胞与所述芦丁类化合物可以单独分开存在，也可以混合在一起。其中，当靶向NKG2D配体的CAR-T细胞与芦丁类化合物分开存在时，二者的给药方式可相同或不同，可以同时给药或先后分别给药。例如，当靶向NKG2D配体的CAR-T细胞与芦丁类化合物以混合态存在时，所述药物可以是注射制剂，以注射方式同时给药。此时，该药物中还可以含有药学上可接受的载体，如水、生理盐水、葡萄糖水溶液以及其他非水性溶剂等至少一种稀释剂，以及稳定剂中的至少一种，但不限于此。

进一步地，该药物中还包括其他治疗恶性肿瘤的活性成分。所述其他治疗恶性肿瘤的活性成分包括化疗剂和免疫检查点抑制剂等中的至少一种。其中，对于免疫检查点抑制剂，可以列举抗PD-1抗体、抗PDL1抗体、抗TIM抗体、抗CTLA-4抗体等中的一种或多种。免疫检查点抑制剂可以通过解除免疫抑制来增强其与CAR-T细胞的抗肿瘤效果。化疗剂可以包括烷化剂(如环磷酰胺、莫司丁等)、抗代谢药(如甲氨蝶呤、氟尿嘧啶等)、抗肿瘤抗生素(如阿霉素等)、抗肿瘤动植物成分药(如长春新碱、紫杉醇等)、抗肿瘤激素类(如地塞米松、丙酸睾丸素等)、铂类化疗药物(如顺铂、卡铂等)等中的至少一种。化疗剂可根据具体的恶性肿瘤来选择。

可选地，所述其他治疗恶性肿瘤的活性成分可以单独存在，或者与靶向NKG2D配体的CAR-T细胞和芦丁类化合物中的至少一种混合在一起。所述其他治疗恶性肿瘤的活性成分的给药方式可以是口服或注射(如静脉注射、皮下注射或肌内注射)。可根据具体的其他治疗恶性肿瘤的活性成分及分布状态来选择给药方式、给药顺序等。例如，当其他治疗恶性肿瘤的活性成分单独存在时，其给药方式可以与芦丁类化合物和靶向NKG2D配体的CAR-T细胞的给药方式均不同，或者与这二者中的至少一者相同。

本发明通过将靶向NKG2D配体的CAR-T细胞和与之有协同增效作用的芦丁类化合物联用，能够在保证疗效的前提下，通过降低CAR-T细胞的剂量来减少其导致的副作用，同时能够增强CAR-T细胞疗法的治疗效果。

附图说明

图1为本发明实施例提供的带CAR-NKG2D编码基因的重组慢病毒感染T细胞后表达嵌合抗原受体CAR-NKG2D的流式检测结果图；

图2为各实验组对Huh7细胞的体外杀伤曲线图；

图3为各实验组对Huh7细胞的体外杀伤率统计图；

其中，Rutin代表芦丁，NKG2D CAR-T代表靶向NKG2D配体的CAR-T细胞。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

本发明提供了芦丁类化合物与靶向NKG2D配体的CAR-T细胞联合在制备治疗恶性肿瘤药物中的用途。

本申请的申请人发现，芦丁类化合物可以上调恶性肿瘤表达NKG2D配体，进而明显增强靶向NKG2D配体的CAR-T细胞对恶性肿瘤细胞的识别、杀死效果，两者的联用表现出协同效应，可达到良好的治疗肿瘤效果，并可使靶向NKG2D配体的CAR-T细胞的用量降低、降低单独的CAR-T细胞治疗导致的副作用。此外，芦丁类化合物为小分子有机化合物，价格便宜，能够降低CAR-T细胞的免疫治疗成本。

下面通过具体的实施例来验证靶向NKG2D配体的CAR-T细胞和芦丁类化合物之间的协同增效作用。

首先，制备靶向NKG2D配体的CAR-T细胞，包括以下步骤：

(1)构建pWPXLd-CAR-NKG2D重组质粒

将序列如SEQ ID NO：4所示的CAR-NKG2D的编码基因插入到pWPXLD载体的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，且位于pWPXLD载体的延伸因子1α(EF1α)之后，以EF1α为启动子。其中在将CAR-NKG2D的编码基因插入到pWPXLD载体时，在CAR-NKG2D的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamHⅠ酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pWPXLD载体中EcoRⅠ酶切位点相连。然后转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。经过PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合目的片段大小和序列，成功构建pWPXLd-CAR-NKG2D重组质粒。

(2)重组慢病毒构建

将上述获得的pWPXLd-CAR-NKG2D重组质粒与包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2G三者通过脂质体转染试剂Lipofectamine3000共转染培养好的HEK293T细胞，48小时后离心获得带CAR-NKG2D编码基因的重组慢病毒。

(3)靶向NKG2D配体的嵌合抗原受体T细胞的制备

采集并分离得到健康人的外周血单个核细胞(PBMC)，加入CD3/CD28免疫磁珠进行孵育，筛选得到CD3阳性T淋巴细胞；向其中加入上述重组慢病毒进行培养，获得靶向NKG2D配体的CAR-T细胞，保存在回输专用的细胞冻存液中，以待后续使用。

同时采用流式细胞仪检测靶向NKG2D配体的嵌合抗原受体CAR-NKG2D的表达，结果如图1所示。经检测，经上述重组慢病毒感染的T细胞中，CAR-NKG2D的阳性率约为39％。这表明成功制得得到靶向NKG2D配体的CAR-T细胞，并保存在回输专用的细胞冻存液中，以供患者回输用。

肿瘤细胞的体外杀死实验

1、复苏液氮中冻存的Huh7细胞(人肝癌细胞)，以其作为靶细胞，将其在含血清的DMEM完全培养基中传代培养。复苏冻存的靶向NKG2D配体的CAR-T细胞，CAR-NKG2D的阳性率约为39％(参见图1，UTD代表未经处理的PBMC细胞)，将其在含IL-2(50IU/mL)的581培养基中传代培养。

2、采用实时细胞功能分析仪(xCElligence RTCASP)进行肿瘤细胞的杀伤实验：首先在该仪器配套的E-Plate板中加入50μL的DMEM完全培养基，置于仪器中进行Blank扫描，然后加入50μL含有5000个Huh7细胞的DMEM完全培养基至E-Plate的各孔中。

3、实验共分为4组：对照组、NKG2D CAR-T细胞组、芦丁组(Rutin)、NKG2D CAR-T细胞和芦丁的联合给药组。待Huh7细胞接种24h后，根据分组情况分别加入相应的药物进行处理，其中，对照组和NKG2D CAR-T细胞组加入的均是DMSO(二甲基亚砜)，Rutin组和联合给药组加入的均是芦丁的DMSO溶液，芦丁在对应孔中的终浓度为0.2mM。

4、加药处理约24h后，根据分组情况分别加入空白培养基或靶向NKG2D配体的CAR-T细胞。其中，对照组和Rutin组加入的均是DMEM完全培养基，NKG2D CAR-T细胞组和联合给药组加入的均是含5000个靶向NKG2D配体的CAR-T细胞的DMEM完全培养基。

5、加入靶向NKG2D配体的CAR-T细胞杀伤30h后，停止实验，根据实时细胞功能分析仪的细胞指数CI值对杀伤效果进行分析。其中，CI值越大，代表活的Huh7细胞的数目越多，杀伤效果越差。

图2、图3汇总了对Huh7细胞的杀伤结果。从图2-图3可以获知，单独使用芦丁或单独使用靶向NKG2D配体的CAR-T细胞，对Huh7肿瘤细胞的杀伤作用均较弱，但当二者联用后，对肿瘤细胞的杀伤作用显著增强。这表明，靶向NKG2D配体的CAR-T细胞和芦丁类化合物联用，可以实现协同杀死肿瘤细胞的作用。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 深圳宾德生物技术有限公司

<120> 芦丁类化合物与靶向NKG2D配体的CAR-T细胞联合制备治疗恶性肿瘤的药物

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 144

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln

1 5 10 15

Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile

20 25 30

Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp

35 40 45

Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys

50 55 60

Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr

65 70 75 80

His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp

85 90 95

Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met

100 105 110

Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile

115 120 125

Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val

130 135 140

<210> 2

<211> 367

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ile Trp Ser Ala Val Phe Leu Asn Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln

1 5 10 15

Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile

20 25 30

Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp

35 40 45

Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys

50 55 60

Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr

65 70 75 80

His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp

85 90 95

Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met

100 105 110

Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile

115 120 125

Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val

130 135 140

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

145 150 155 160

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

165 170 175

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile

180 185 190

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195 200 205

Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

210 215 220

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

225 230 235 240

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg

245 250 255

Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln

260 265 270

Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

275 280 285

Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro

290 295 300

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

305 310 315 320

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

325 330 335

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

340 345 350

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

355 360 365

<210> 3

<211> 1101

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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gaaagttact gtggcccatg tcctaaaaac tggatatgtt acaaaaataa ctgctaccaa 120

ttttttgatg agagtaaaaa ctggtatgag agccaggctt cttgtatgtc tcaaaatgcc 180

agccttctga aagtatacag caaagaggac caggatttac ttaaactggt gaagtcatat 240

cattggatgg gactagtaca cattccaaca aatggatctt ggcagtggga agatggctcc 300

attctctcac ccaacctact aacaataatt gaaatgcaga agggagactg tgcactctat 360

gcctcgagct ttaaaggcta tatagaaaac tgttcaactc caaatacgta catctgcatg 420

caaaggactg tgaccactac cccagcaccg aggccaccca ccccggctcc taccatcgcc 480

tcccagcctc tgtccctgcg tccggaggca tgtagacccg cagctggtgg ggccgtgcat 540

acccggggtc ttgacttcgc ctgcgatatc tacatttggg cccctctggc tggtacttgc 600

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tgttcatgcc ggttcccaga ggaggaggaa ggcggctgcg aactgcgcgt gaaattcagc 780

cgcagcgcag atgctccagc ctacaagcag gggcagaacc agctctacaa cgaactcaat 840

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<210> 4

<211> 1161

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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gcctcgagct ttaaaggcta tatagaaaac tgttcaactc caaatacgta catctgcatg 480

caaaggactg tgaccactac cccagcaccg aggccaccca ccccggctcc taccatcgcc 540

tcccagcctc tgtccctgcg tccggaggca tgtagacccg cagctggtgg ggccgtgcat 600

acccggggtc ttgacttcgc ctgcgatatc tacatttggg cccctctggc tggtacttgc 660

ggggtcctgc tgctttcact cgtgatcact ctttactgta agcgcggtcg gaagaagctg 720

ctgtacatct ttaagcaacc cttcatgagg cctgtgcaga ctactcaaga ggaggacggc 780

tgttcatgcc ggttcccaga ggaggaggaa ggcggctgcg aactgcgcgt gaaattcagc 840

cgcagcgcag atgctccagc ctacaagcag gggcagaacc agctctacaa cgaactcaat 900

cttggtcgga gagaggagta cgacgtgctg gacaagcgga gaggacggga cccagaaatg 960

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atgcaggccc tgccgcctcg g 1161

<210> 5

<211> 432

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atatggagtg ctgtattcct aaactcatta ttcaaccaag aagttcaaat tcccttgacc 60

gaaagttact gtggcccatg tcctaaaaac tggatatgtt acaaaaataa ctgctaccaa 120

ttttttgatg agagtaaaaa ctggtatgag agccaggctt cttgtatgtc tcaaaatgcc 180

agccttctga aagtatacag caaagaggac caggatttac ttaaactggt gaagtcatat 240

cattggatgg gactagtaca cattccaaca aatggatctt ggcagtggga agatggctcc 300

attctctcac ccaacctact aacaataatt gaaatgcaga agggagactg tgcactctat 360

gcctcgagct ttaaaggcta tatagaaaac tgttcaactc caaatacgta catctgcatg 420

caaaggactg tg 432