一种ɑ-芋螺毒素MI-蛋白偶联抗原及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及ɑ-芋螺毒素MI抗原制备及其免疫血清或抗体的应用。更具体来说涉及ɑ-芋螺毒素MI-牛血清蛋白偶联抗原的制备方法以及该抗原免疫动物后制备的抗血清或抗体对MI的解毒及检测应用。

背景技术

α-芋螺毒素MI来自幻芋螺(Conus magus)，其氨基酸序列为GRCCHPACGKNYSC-NH

目前MI中毒无有效药物治疗，也未见MI的有效抗毒血清报道，仅见结构相似的α-芋螺毒素GI抗血清[Stiles B G et al.Toxicon.1992,30(4):367-377]及单克隆抗体报道。采用戊二醛法偶联GI至蛋白载体(如牛血清蛋白，孔蓝蛋白或卵清蛋白等)制备全抗原，免疫小鼠、山羊或家兔获得抗血清[唐艺菲等.军事医学.2017，41(05)：338-341；Ashcom JD et al.Biocheml J.1997,328(Pt 1):245-250]，或再通过杂交瘤技术制备其单克隆抗体。然而，由于GI含有多个碱性氨基酸，与戊二醛偶联蛋白载体时反应位点多，影响了GI抗原表位，获得的鼠抗、兔抗或羊抗血清的中和活性或解毒活性不高。由于MI与GI结构相似，分子量小且亲水，抗原性弱，采用戊二醛法偶联至载体蛋白，也存在多反应位点影响抗原表位问题。前期发明人合成了MI多分支肽，虽然保持了MI抗原表位的完整性，免疫小鼠后虽有滴度，但抗毒活性不佳[陈荣芳等.生物技术通讯.2019，30(06)：768-774]。另，尝试用半胱氨酸方法偶联MI至蛋白载体，因MI本身含有两对二硫键，活泼的半胱氨酸导致MI不能正确折叠。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的α-芋螺毒素MI抗原，提高MI的免疫原性以获得抗血清、抗体，用于芋螺多肽MI中毒解毒或检测。

本发明提供了一种以α-芋螺毒素MI与牛血清白蛋白(BSA)的偶联蛋白抗原及制备方法。具体策略是先合成MI的含炔基多肽，用叠氮乙酸修饰BSA载体蛋白，利用点击反应制备MI-偶合载体蛋白抗原，然后免疫Balb/c小鼠、马获得抗血清、抗体，最后测定抗血清、抗体的中和活性与解毒活性。采用这种方法制备的MI-BSA偶联抗原能保持MI抗原表位不被修饰，免疫原性高，制备的鼠抗血清及马抗血清、抗体具有很高的中和活性及解毒活性，可应用于MI的中毒解毒及检测。

本发明还提供了制备α-芋螺毒素MI鼠抗血清的制备方法，包括MI-BSA偶联抗原的免疫方法，抗血清制备以及抗血清的中和活性及解毒测定。

本发明还提供了制备α-芋螺毒素MI马抗血清的制备方法，包括MI-BSA偶联抗原的免疫方法，抗血清制备以及抗血清的中和活性及解毒测定。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明所提供的α-芋螺毒素MI与牛血清白蛋白的偶联蛋白抗原(MI-BSA载体蛋白抗原)的制备流程见图1，其是通过炔基化修饰MI多肽与含叠氮乙酸修饰的BSA载体蛋白通过点击反应形成MI-偶合载体蛋白抗原。

具体是按照包括下述步骤的方法制备得到的：

1)利用Fmoc-固相肽合成法合成炔基化的MI线性多肽，然后折叠形成含二硫键的炔基化修饰MI多肽；所述炔基化修饰MI多肽的序列为：GRCCHPACGKNYSCGGK(Butynyl)-NH

2)以二环己基碳二亚胺为缩合剂，使N-羟基琥珀酰亚胺、叠氮乙酸进行反应，得到叠氮乙酸琥珀酰亚胺活性酯，然后用所述活性酯对BSA进行修饰获得含叠氮乙酸修饰的BSA载体；

3)在铜(I)催化作用下，使MI-GGK(Butynyl)与含叠氮乙酸修饰的BSA载体通过环加成反应(CuAAC)，形成α-芋螺毒素MI-BSA偶联抗原。

上述方法步骤1)中，所述炔基化修饰MI多肽可按照发明人已报道方法进行[陈荣芳等.生物技术通讯.2019，30(06)：768-774]，先合成MI-GGK(Butynyl)线性肽，然后在0.1M乙酸铵缓冲溶液(pH 8.0-8.2)中折叠，折叠产物经C18反相高效液相色谱纯化，纯度95％以上。

上述方法步骤2)中，所述含叠氮乙酸修饰的BSA载体的结构式如下所示：

上式中n为5～10。

上述方法步骤2)中，所述BSA的分子量可为66.4KD；所述BSA与所述活性酯的反应摩尔比为1：10～20。

该修饰载体在2100cm

上述方法步骤3)中，所述反应在氮气保护下进行；

所述炔基化修饰MI多肽与含叠氮乙酸修饰的BSA载体的反应摩尔比为10:1～20:1；

所述反应在磷酸盐缓冲液中进行，所述磷酸盐缓冲液可为pH7.4、10mM的磷酸盐缓冲液。

所述反应的反应条件为：室温反应24小时。

将步骤3)得到的α-芋螺毒素MI-BSA偶联抗原进行蛋白凝胶电泳测定。蛋白凝胶电泳显示在约80kDa处有电泳条带，按炔基化修饰MI多肽的分子量测算，约有8个芋螺多肽MI分子连接到牛血清白蛋白上(图3)。

本发明还提供了以所述α-芋螺毒素MI与牛血清白蛋白的偶联蛋白抗原为免疫原制备的抗体。

所述抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体，优选多克隆抗体。

所述多克隆抗体可通过α-芋螺毒素MI与牛血清白蛋白的偶联蛋白抗原免疫动物，收集抗血清并纯化获得。

所述动物可为哺乳动物，具体如鼠、马。

本发明还提供了由所述多克隆抗体制备得到的抗体片段。

所述抗体片段可为具体可为F(ab′)

本发明还提供了所述α-芋螺毒素MI与牛血清白蛋白的偶联蛋白抗原的应用。

所述应用选自下述至少一方面：

1)在制备抗α-芋螺毒素MI血清中的应用；

2)在制备抗α-芋螺毒素MI抗体或其抗体片段(如F(ab′)

3)在检测α-芋螺毒素MI中的应用。

本发明还提供了一种α-芋螺毒素MI酶联免疫试剂或试剂盒。

该α-芋螺多肽MI酶联免疫试剂或试剂，包括所述的α-芋螺毒素MI与牛血清白蛋白的偶联蛋白抗原和所述的抗体。

本发明还保护一种上述抗体的应用。

所述应用选自下述至少一方面：

1)在制备预防和/或治疗α-芋螺毒素MI或其类似物中毒的药物中的应用；

2)在制备检测α-芋螺毒素MI或其类似物的检测试剂盒或诊断试剂盒中的应用。

3)在检测α-芋螺毒素MI或其类似物(如α-芋螺毒素GI)中的应用。

本发明还保护一种α-芋螺毒素MI或其类似物的解毒剂。

本发明所述α-芋螺多肽MI或其类似物的解毒剂，其活性成分为所述抗体。

本发明中所述α-芋螺毒素MI的类似物具体如α-芋螺毒素GI。

本发明采用间接ELISA法测定了第4次加强免疫后14天采集的鼠抗血清对MI、GI的滴度，结果表明，MI-BSA鼠抗血清对MI有较好的特异性结合，对MI的滴度为1:51200，对GI也有一定的交叉反应，滴度为1:25600(图4)。

本发明采用间接ELISA法测定了第7次加强免疫后7天采集的马抗血清对MI、GI的滴度，结果表明，MI-BSA马抗血清对MI有很好的特异性结合，对MI的滴度大于1:204800，对GI也有一定的交叉反应，滴度大于1:51200(图5)。

本发明利用昆明小鼠测定了MI-BSA鼠抗血清在其体内对MI、GI的中和活性及解毒活性。结果表明，12.5μL的鼠抗血清(血清蛋白含量0.65mg)能够完全中和致死剂量的MI毒素(0.4μg，20μg/kg)(图6)；6.25μL的鼠抗血清(血清蛋白量0.32mg)可使预先给予致死剂量MI(0.4μg，20μg/kg)的小鼠全部存活(图7A)，对GI的具有部分解毒活性，100μL的鼠抗血清(血清蛋白量5.19mg)对给予致死剂量GI(0.8μg，40μg/kg)的小鼠的保护率为20％(图7B)。

本发明利用昆明小鼠测定了MI-BSA马抗血清在其体内对MI、GI的中和活性及解毒活性，结果表明，12.5μL(血清蛋白量0.75mg)的马抗血清能够完全中和致死剂量的MI毒素(20μg/kg)(图8A)，而要中和致死剂量的GI(0.8μg，40μg/kg)则需100μL马抗血清(血清蛋白量6.03mg)(图8B)；10.41μL(血清蛋白量0.63mg)的马抗血清可使预先给予致死剂量MI的小鼠全部存活(图9A)，而要使给予致死剂量GI的小鼠全部存活则需200μL马抗血清(血清蛋白量12.05mg)(图9B)。

本发明利用昆明小鼠测定了马F(ab′)

附图说明

图1为MI-BSA偶联抗原的合成路线图

图2为叠氮乙酸修饰的牛血清白蛋白经红外光谱结果。

图3为MI-BSA蛋白凝胶电泳鉴定结果。

图4为鼠抗血清滴度测定结果；A为鼠抗血清对MI的滴度；B为鼠抗血清对GI的滴度。

图5为马抗血清滴度测定结果；A为马抗血清对MI的滴度；B为马抗血清对GI的滴度。

图6为鼠抗血清中和活性测定结果。

图7为鼠抗血清解毒活性测定结果；A为鼠抗血清对MI的解毒活性测定结果(静脉注射)；B为鼠抗血清对MI、GI的解毒活性比较(腹腔注射)。

图8为马抗血清中和活性测定结果；A为马抗血清对MI的中和活性测定结果(腹腔注射)；B为马抗血清对GI的中和活性测定结果(腹腔注射)。

图9为马抗血清解毒活性测定结果；A为马抗血清对MI的解毒活性测定结果(静脉注射)；B为马抗血清对GI的解毒活性测定结果(静脉注射)。

图10为马F(ab′)

图11为马F(ab′)

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。炔基化修饰MI多肽(序列表的序列1，GRCCHPACGKNYSCGGK(Butynyl)-NH

实施例1、α-芋螺毒素MI及GI的合成

参照α-芋螺毒素已报道常规方法进行(Chen J,et al.Marine drugs,2018,16(4).pii:E112)。α-芋螺毒素MI(GRCCHPACGKNYSC-NH

实施例2、牛血清白蛋白(BSA)的叠氮化修饰

本实施例利用碳二亚胺法对牛血清白蛋白进行叠氮化修饰。

N-羟基琥珀酰亚胺(5.21mmol，0.57g)用10mL乙腈溶解，加入叠氮乙酸(5.21mmol，0.37mL)及5mL乙腈溶解的二环己基碳二亚胺(5.82mmol，1.17g)溶液，室温反应过夜。反应完后旋蒸除去乙腈，用异丙醇重结晶获得活性酯，质谱(LCMS-IT-TOF岛津公司)测定分子量为197.96，与理论分子量198.04一致。

牛血清白蛋白(BSA，Fraction V，Fatty acid free，Sigma公司)(0.008mmol，0.53g)溶于10mL的10mM PBS(pH 7.2)，将活性酯(0.08mmol，15.7mg)溶于1mL的二甲基亚砜后加入BSA溶液，4℃反应过夜。在AKTA prime纯化系统(Amersham Biosciences公司)上，采用HiTrap desalt脱盐柱(5mL，GE公司)脱去盐及小分子。流动相为10mM的磷酸盐缓冲液(pH7.4)，流速为5mL/min，上样体积为1mL。采用两根脱盐柱串联。用截留分子量30KDa的超滤管(GE公司)超滤浓缩后测定浓度(BCA法)。叠氮化修饰的BSA经红外光谱(Nicolet is5,Thermofisher scientific公司)鉴定在2100cm

实施例3、炔基化修饰MI多肽与叠氮化修饰BSA的偶联反应制备MI-BSA偶联抗原

将炔基化修饰MI多肽(0.027mmol，49.95mg)加入叠氮化修饰的BSA(约1μmol，72mg，22.5mL)溶液中，充氮气保护，再依次加入三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺(TBTA，2.7μmol，1.45mg)DMSO溶液(80μL)、硫酸铜(2.7μmol，0.68mg)水溶液(15.2μL)及抗坏血酸钠水溶液(6.8μM，1.35mg)37.9μL，加入10mM的磷酸盐缓冲液(pH7.4)至50mL。氮气保护下室温反应24小时后，利用AKTA系统，采用实施例1中相同方法洗脱小分子及未结合的炔基化修饰MI多肽，用截留分子量30KDa的超滤管(GE公司)超滤浓缩后测定蛋白浓度，-80℃保存备用。MI-BSA偶联蛋白经蛋白凝胶电泳鉴定，在约80kDa处有电泳条带(图3)，按炔基化修饰MI多肽的分子量测算，有约8个芋螺多肽MI分子连接到BSA上。

实施例4、MI-BSA偶联抗原的免疫

分别选用蒙古马(350公斤，两岁龄)，Balb/c小鼠(SPF级，6周龄，雌性，许可证号为SCXK(京)2019-0010)制备抗芋螺毒素MI血清。将实施例3中获得的MI-BSA偶联抗原用去离子水配制成2.5mg/mL的母液，再用氯化钠注射液(0.9％，石家庄四药有限公司)稀释至合适浓度的工作液。

小鼠的免疫：基础免疫时将抗原工作液与完全弗氏佐剂(Sigma公司产品)等体积混合，加强免疫时抗原蛋白与不完全弗氏佐剂(Sigma公司产品)等体积混合。免疫时均采用腹腔注射合并皮下注射，注射总体积100μL，免疫剂量为20μg/只。每隔14天进行一次加强免疫，第五次免疫后14天小鼠摘眼球取血，血浆37℃孵育30分钟，4℃放置6小时后4℃低温离心分离血，转速12000转/分钟。获得的血清经滴度检测后，分装保存于-80℃冰箱。利用BCA法测定小鼠血清蛋白浓度，鼠抗血清蛋白浓度为51.9mg/mL，未免疫小鼠血清的蛋白浓度为51.1mg/mL。

马的免疫：用羊毛脂和石蜡油作为免疫佐剂，2次基础免疫，免疫间隔时间为2周，免疫剂量为20mg/匹，每次注射体积1-3mL。5次加强免疫，免疫间隔时间为1周，免疫剂量为30mg/匹，每次注射体积2-10mL。第7次免疫后1周利用采浆机采血，将采集的血浆过滤后9000rpm离心10min得到血清。获得的血清经滴度检测后，分装保存于-80℃冰箱。利用BCA法测定马血清蛋白浓度，马抗血清蛋白浓度为60.3mg/mL，为免疫马血清的蛋白浓度为65.9mg/mL。

实施例5、马F(ab′)2的制备

第5次加强免疫后采血，取马血浆过滤后9000rpm离心10min，按血浆量加2倍体积注射用水稀释后，血浆升温至29-31℃，pH调至3.0，按9U/mL血浆加入胃蛋白酶，加入甲苯至终浓度0.2％(v/v)，搅拌保温1h。用15±1％(w/v)硫酸铵，NaOH调pH至4.8-5.6，加温至57-59℃维持30min。然后降温至45℃以下，9000rpm离心10min，弃上清，留沉淀。用NaOH调pH至7.0-7.4，加20±1％(w/v)硫酸铵，搅拌溶解，静置30-60min，9000rpm第二次离心10min，弃上清，留沉淀。加注射用水，搅拌使沉淀溶解，加80mL/kg 10％明矾水溶液，搅拌60min。弃沉淀，留上清。用50KD膜包(颇尔公司)超滤脱盐浓缩，等体积超滤10次。利用DEAE-sepharose-FF柱(GE公司)层析收集流窜液，柱层析之后的样品进行纳米膜过滤。纯化的F(ab′)

实施例6、鼠抗血清滴度测定

采用间接ELISA法测定第4次加强免疫后14天采集的鼠抗血清对MI、GI的滴度：将MI(2mg/mL)、GI(3mg/mL)用包被液(0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6)稀释成10ng/μL，每孔100μL(即每孔1μg)，4℃包被过夜。PBST(含0.1％Tween-20的10mM磷酸盐缓冲液)洗涤4次，用5％的脱脂奶粉封闭2h，再用PBST洗涤4次后，加入不同稀释倍数的血清，每个稀释倍数做两个复孔，每孔100μL，37℃孵育1h，阴性对照组加等量的生理盐水组血清。PBST洗涤4次后，加入羊抗鼠IgG(1:20000稀释)，每孔100μL，37℃孵育30min，PBST再洗涤4次，加入显色剂TMB，每孔100μL，37℃孵育15min显色。然后每孔加入0.5M硫酸50μL，终止反应。用酶标仪(Multiskan FC,Thermo Scientific)测定450nM和600nM处的吸光值，以大于未免疫鼠血清组的2.1倍判断为阳性。结果表明(图4)，鼠抗血清对MI的滴度为1:51200；鼠抗血清对GI也有一定的交叉反应，对GI的滴度为1:25600。

实施例7、马抗血清滴度测定

采用间接ELISA法测定第4次加强免疫后14天采集的马抗血清对MI、GI的滴度：将MI(2mg/mL)、GI(3mg/mL)用包被液稀释成10ng/μL，每孔100μL(即每孔1μg)，4℃包被过夜。PBST(同实施例6)洗涤4次，用5％的脱脂奶粉封闭2h，PBST再洗涤4次后，加入不同稀释倍数的血清，每个稀释倍数做两个复孔，每孔100μL，37℃孵育1h，阴性对照组加等量的生理盐水组血清。PBST洗涤4次，加入兔抗马IgG(1:2000稀释)，每孔100μL，37℃孵育30min。PBST再洗涤4次后，加入显色剂TMB，每孔100μL，37℃孵育15min。然后每孔加0.5M硫酸50μL，终止反应。用酶标仪(Multiskan FC,Thermo Scientific)测定450nM和600nM处的吸光值，以大于未免疫马血清组的2.1倍判断为阳性。结果表明(图5)，马抗血清对MI有很好的特异性结合，对MI的滴度大于1:204800；马抗血清对GI也有一定的交叉反应，对GI的滴度大于1:51200。

实施例8、鼠抗血清中和活性测定

MI、GI母液用去离子水配制，浓度分别为2mg/mL及3mg/mL，然后用生理盐水稀释至合适浓度用于实验。昆明小鼠(19.60±0.65g，斯贝福(北京)生物技术有限公司)，许可证号为SCXK(京)2019-0010，质量合格证号为1103242011007791，雌雄各半，每组10只。实验组采用不同剂量鼠抗血清与MI混合，用生理盐水稀释，每100μL含12.5、6.25μL鼠抗血清及0.4μg的MI(小鼠给毒剂量为20μg/kg)，对照组采用未免疫鼠血清及MI混合，每100μL中含血清99.8μL与0.4μg的MI。37℃孵育40分钟后腹腔注射昆明小鼠，注射体积100μL，记录24小时内小鼠死亡时间及死亡率。用GraphPad Prism 8.3.0软件绘制生存曲线，用IBM spssstatistics 22软件采用乘积极限(Kaplan-Meier)法进行生存分析，Log-rank检验实验组与对照组数据差异，P＜0.05表示具有显著性差异。结果表明(图6)，对照组动物全部死亡，12.5μL及6.25μL鼠抗血清与MI混合组的存活率分别为100％及0。实验组与对照组的死亡时间存在显著性差异(P＜0.05)。

实施例9、鼠抗血清解毒活性测定

1、鼠抗血清对MI、GI的解毒活性测定

昆明小鼠信息同“鼠抗血清中和活性测定”实验，对照组与实验组每组10只，雌雄各半。

实验过程：先每只小鼠腹腔注射100μL的MI生理溶液(含0.4μg MI，给毒剂量20μg/kg)，8分钟后，分别静脉注射含有6.25、3.125μL鼠抗血清(血清蛋白浓度为51.9mg/mL)的生理盐水溶液100μL，对照组静脉注射未免疫鼠血清100μL。记录24小时内小鼠死亡时间及死亡率，用GraphPad Prism 8.3.0软件绘制生存曲线，用IBM spss statistics 22软件采用乘积极限(Kaplan-Meier)法进行生存分析，Log-rank检验实验组与对照组数据差异，P＜0.05表示具有显著性差异。结果表明(图7A)，对照组动物全部死亡，6.25μL、3.125μL MI鼠抗血清组对MI(0.4μg)的存活率分别为100％及80％。实验组与对照组的死亡时间均存在极显著性差异(P＜0.001)。

2、鼠抗血清对MI、GI的解毒活性比较

昆明小鼠信息同“鼠抗血清中和活性测定”实验，对照组与实验组每组10只，雌雄各半。

实验过程：先每只小鼠腹腔注射100μL的MI生理盐水溶液(含0.4μg MI，给毒剂量20μg/kg)或GI生理盐水溶液(含0.8μg GI，给毒剂量40μg/kg)，8分钟后，腹腔注射100μL鼠抗血清，对照组腹腔注射未免疫鼠血清100μL。记录24小时内小鼠死亡时间及死亡率，用GraphPad Prism 8.3.0软件绘制生存曲线，用IBM spss statistics 22软件采用乘积极限(Kaplan-Meier)法进行生存分析，Log-rank检验实验组与对照组数据差异，P＜0.05表示具有显著性差异并对检验水准进行校准。结果表明(图7B)，对照组动物全部死亡，100μL的鼠抗血清对给予致死剂量MI(0.4μg，20μg/kg)的小鼠的保护率可达100％，对给予致死剂量GI(0.8μg，40μg/kg)的小鼠的保护率为20％。实验组与对照组的死亡时间均存在极显著性差异(P＜0.001)，GI的抗血清组与MI的抗血清组的死亡时间也存在极显著性差异(P＜0.001)。

实施例10、马抗血清中和活性测定

1、马抗血清对MI的中和活性测定(腹腔注射)

昆明小鼠(18.59±0.55g，斯贝福(北京)生物技术有限公司)，许可证号为SCXK(京)2019-0010，质量合格证号为110324210104176883。对照组与实验组每组10只，雌雄各半。

实验过程：实验组采用不同剂量马抗血清与MI混合，用生理盐水稀释，每100μL含12.5、7.81、6.25、4.69、3.125μL马抗血清及0.4μg的MI(小鼠给毒剂量为20μg/kg)，对照组采用未免疫马血清及MI混合，每100μL中含马血清99.8μL与0.4μg的MI。37℃孵育40分钟后腹腔注射昆明小鼠，注射体积100μL，记录24小时内小鼠死亡时间及死亡率。用GraphPadPrism 8.3.0软件绘制生存曲线，用IBM spss statistics 22软件采用乘积极限(Kaplan-Meier)法进行生存分析，Log-rank检验实验组与对照组数据差异，P＜0.05表示具有显著性差异。结果表明(图8A)，对照组动物全部死亡，12.5μL、7.81μL、6.25μL、4.69μL及3.125μL马抗血清组的存活率分别为100％、90％、60％、10％及0。除了3.125μL马抗血清组(中位生存时间：1040s，95％置信区间：821.52-1258.48)与对照组死亡时间(中位生存时间：756.44s，95％置信区间：687.91-824.98)无显著差异(P＝0.876)，其他实验组与对照组的死亡时间均存在显著性差异(P＜0.01)。

2、马抗血清对GI的中和活性测定(腹腔注射)

昆明小鼠(18.79±0.59g，斯贝福(北京)生物技术有限公司)，许可证号为SCXK(京)2019-0010，质量合格证号为110324210104233058。对照组与实验组每组10只，雌雄各半。

实验过程：实验组采用不同剂量马抗血清与GI混合，用生理盐水稀释，每300μL含100、50、25μL马抗血清及0.8μg的GI(小鼠给毒剂量为40μg/kg)，对照组采用未免疫马血清及GI混合，每300μL中含马血清99.8μL与0.8μg的GI。37℃孵育40分钟后腹腔注射昆明小鼠，注射体积300μL，记录24小时内小鼠死亡时间及死亡率。用GraphPad Prism 8.3.0软件绘制生存曲线，用IBM spss statistics 22软件采用乘积极限(Kaplan-Meier)法进行生存分析，Log-rank检验实验组与对照组数据差异，以P＜0.05表示具有显著性差异并对检验水准进行校准。结果表明(图8B)，对照组动物全部死亡，100μL、50μL及25μL马抗血清组的存活率分别为100％、70％及30％。实验组与对照组的死亡时间均存在显著性差异(P＜0.05)。

实施例11、马抗血清解毒活性测定

1、马抗血清对MI的解毒活性测定(静脉注射)

昆明小鼠信息同实施例10的实验2“马抗血清对GI的中和活性测定(腹腔注射)”实验。对照组与实验组每组10只，雌雄各半。

实验过程：先每只小鼠腹腔注射100μL的MI生理盐水溶液(含0.4μg MI，给毒剂量20μg/kg)，每只注射时间间隔120s，8分钟后，静脉注射含10.41、8.33、6.25、3.125μL马抗血清的生理盐水溶液100μL，对照组静脉注射未免疫马血清100μL。记录24小时内小鼠死亡时间及死亡率，用GraphPad Prism 8.3.0软件绘制生存曲线，用IBM spss statistics 22软件采用乘积极限(Kaplan-Meier)法进行生存分析，Log-rank检验实验组与对照组数据差异，P＜0.05表示具有显著性差异。结果表明(图9A)，对照组动物全部死亡，10.41μL、8.33μL、6.25μL及3.125μL马抗血清组的存活率分别为100％、80％、20％及0。实验组与对照组的死亡时间均存在极显著性差异(P＜0.0001)。

2、马抗血清对GI的解毒活性测定(静脉注射)

昆明小鼠信息同实施例10的实验2“马抗血清对GI的中和活性测定(腹腔注射)”实验。对照组与实验组每组10只，雌雄各半。

实验过程：先每只小鼠腹腔注射100μL的GI生理盐水溶液(含0.8μg GI，给毒剂量40μg/kg)，每只注射时间间隔120s，8分钟后，静脉注射含200、100、50μL马抗血清(血清蛋白浓度为60.3mg/mL)的生理盐水溶液300μL，对照组静脉注射未免疫马血清300μL。记录24小时内小鼠死亡时间及死亡率，用GraphPad Prism 8.3.0软件绘制生存曲线，用IBM spssstatistics 22软件采用乘积极限(Kaplan-Meier)法进行生存分析，Log-rank检验实验组与对照组数据差异，P＜0.05表示具有显著性差异。结果表明(图9B)，对照组动物全部死亡，200μL、100μL及50μL马抗血清组的存活率分别为100％、10％及0。除50μL马抗血清组(中位生存时间：987s，95％置信区间：550.04-1423.96)与对照组死亡时间(中位生存时间：837.67s，95％置信区间：810.87-864.37)无显著差异外(P＝0.154)，其他实验组与对照组的死亡时间均存在极显著性差异(P＜0.0001)。

实施例12、马F(ab′)

昆明小鼠信息同实施例10的实验2“马抗血清对GI的中和活性测定(腹腔注射)”实验。对照组与实验组每组10只，雌雄各半。

实验过程：实验组中，F(ab′)

实施例13、马F(ab′)2解毒活性测定

昆明小鼠信息同实施例10的实验2“马抗血清对GI的中和活性测定(腹腔注射)”实验。对照组与实验组每组10只，雌雄各半。实验过程：每只小鼠腹腔注射100μL的MI生理盐水溶液(含0.4μg MI，给毒剂量20μg/kg)，每只注射时间间隔120s，8分钟后，再分别用与MI摩尔比为3:1、4:1、5:1和6:1的F(ab′)

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种ɑ-芋螺毒素MI-蛋白偶联抗原及其应用

<130> 1

<160> GNCZJ222667

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Gly Arg Cys Cys His Pro Ala Cys Gly Lys Asn Tyr Ser Cys Gly Gly

1 5 10 15

Lys