一种石房蛤毒素单克隆抗体及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及石房蛤毒素检测技术领域，尤其是涉及一种石房蛤毒素单克隆抗体及其制备方法与应用。

背景技术

石房蛤毒素(Saxitoxins，STX)，是四氢嘌呤的一种衍生物，为已知的毒性最强的海洋生物毒素之一，有很高的致死率，对成年人的致死剂量为540-1000μg，是贝类神经麻痹中毒(Paralytic Shellfish Poisoning，PSP)的主要毒素之一。

石房蛤是一种既可以在淡水中生活又可以在海水中生活的底栖贝类，其肉质鲜美，营养丰富，是一种很受大众欢迎的海鲜食品。但是由于其中可能含有高致死率的STX，对石房蛤毒素含量的检测十分重要。

以前，常用的石房蛤毒素检测方法为生物分析方法和化学分析方法。生物分析方法是基于毒素作用后细胞、组织和器官的反应的检测方法，包括小鼠生物毒性试验和海星胃肠道操作试验等。由于生物分析方法存在操作复杂、耗时长、毒性大、实验动物利用率低等问题，逐渐被化学分析方法代替。化学分析方法主要包括高效液相色谱联用技术(HPLC)、气相色谱质谱联用技术(GC-MS)和液相质谱联用技术(LC-MS)等，这些方法准确度高、重复性好，但存在一次检测的成本高、操作复杂、设备昂贵、响应时间长等缺陷。

近年来，随着分子生物学的发展，应用免疫学方法检测石房蛤毒素的含量逐渐取代了生物分析和化学分析方法，成为常用检测方法。免疫学方法是利用特异性抗体分子间的相互作用实现的，包括ELISA(酶联免疫吸附测定法)和免疫荧光技术、免疫放射技术、免疫酶技术和免疫胶体金技术等。其中，ELISA技术是目前应用最广泛的一种石房蛤毒素检测方法，该方法通过特异性的抗体识别石房蛤毒素，将毒素与抗原结合，利用辅助酶的催化作用转化成光学信号，从而实现对石房蛤毒素的检测，具有操作简单、时间短、灵敏度高、准确性好等优点。

但是，由于石房蛤毒素的分子量很小，只有不到300，制备单克隆抗体难度较大，因此用于石房蛤毒素ELISA检测的抗体几乎全部为多克隆抗体，多克隆抗体存在效价不高，容易发生交叉反应，严重限制了ELISA检测的专一性、特异性和灵敏性。

发明内容

本发明的目的是提供一种石房蛤毒素单克隆抗体及其制备方法与应用，以进一步提高ELISA石房蛤毒素检测试剂盒的专一性、特异性和灵敏性，同时解决基于多克隆抗体的ELISA石房蛤毒素检测试剂盒容易发生交叉反应的问题。

为实现上述目的，本发明提供一种石房蛤毒素单克隆抗体及其制备方法与应用，一种石房蛤毒素半抗原，以VLP作为载体，所述石房蛤毒素半抗原结构式为：

一种如上所述的石房蛤毒素半抗原的制备方法，步骤如下：

(1)将STX溶于HCl溶液中，于低温条件下逐滴滴加亚硝酸钠溶液，并用淀粉碘化钾试纸对反应过程进行监测，待反应完全得到A液；

(2)将VLP载体于低温条件下用1×PBS溶解，记为B液；

(3)于一定条件下逐滴滴加A液至B液中，反应一定时间后加入1×PBS，即得到STX-VLP半抗原原液；

(4)将STX-VLP半抗原原液透析纯化即得到STX-VLP半抗原纯品。

优选的，所述步骤(1)中的用淀粉碘化钾试纸对反应过程进行监测是指当试纸变成蓝灰色时停止滴加亚硝酸钠溶液，当试纸无变化则继续滴加亚硝酸钠溶液。

优选的，所述步骤(1)中的HCl溶液浓度为0.1M，亚硝酸钠溶液浓度为0.01M，反应条件为4℃旋转混合反应，STX与HCl溶液的质量体积比为10μmol:1mL，在滴加反应前，STX溶液和亚硝酸钠溶液均需预冷至4℃。

优选的，所述步骤(2)中的低温为4℃，B液的浓度为2mg/mL。

优选的，所述步骤(3)中的一定条件指4℃、持续搅拌、pH为9-10，反应一定时间指反应2-4h，添加的1×PBS的体积与反应液体积比为1:1。

优选的，所述步骤(4)中的透析纯化条件为：透析液为1×PBS缓冲液，于4℃条件下透析1-3d，并每天更换3次缓冲液，每次间隔不少于4h。

一种利用上述半抗原制备石房蛤毒素单克隆抗体的方法，步骤如下：

S1、采用上述方法制备石房蛤毒素半抗原；

S2、将合成的半抗原作为免疫原免疫小鼠；

S3、取所述免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合；

S4、筛选得到反应阳性的杂交瘤细胞；

S5、将阳性杂交瘤细胞接种至小鼠体内，收集并纯化腹水抗体，得到抗石房蛤毒素的单克隆抗体。

一种由上述方法制备的石房蛤毒素单克隆抗体。

一种如上所述的石房蛤毒素单克隆抗体在制备检测STX的ELISA试剂盒中的应用。

因此，本发明提供的一种石房蛤毒素单克隆抗体及其制备方法与应用，具有如下技术效果：

1.本发明通过合成的石房蛤毒素人工半抗原成功制备了石房蛤毒素的单克隆抗体，制备的单克隆抗体具有效价高、特异性强、灵敏度高的优点，能有效避免交叉反应，在石房蛤毒素的检查中具有良好的应用前景；

2.本发明提供的石房蛤毒素半抗原和石房蛤毒素单克隆抗体的制备方法安全有效，无毒无害，无需特殊的仪器设备和苛刻复杂的反应条件。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例的描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明石房蛤毒素偶联半抗原的制备流程示意图；

图2是本发明实施例一制备的STX-VLP半抗原的效果图；

图3是本发明实施例一制备的STX-VLP半抗原的吸收波长检测结果；

图4是本发明实施例五制备的单克隆抗体的SDS-PAGE检测结果；

图5是本发明实施例六中竞争性ELISA检测石房蛤毒素的标准曲线。

具体实施方式

以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

为了使得本申请的目的、技术方案及优点更加明确、透彻和完整，下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。以下详细说明均是实施例的说明，旨在对本发明提供进一步详细说明。除非另有指明，本发明所采用的所有技术术语与本申请所属领域的一般技术人员通常理解的含义相同。

石房蛤毒素STX标准品(色谱纯≥95％)购自北京伊普瑞斯技术开发有限公司；VLP超级抗原蛋白购自恺佧生物科技(上海)有限公司；小鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞购自中国科学院细胞库；雌性BALB/c小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司；配制PBS、CBS的化学试剂均购自Sigma公司；BCA试剂盒购自赛默飞世尔科技公司，酶标二抗购自Abcam公司；UV-2450连续分光光度计为日本岛津公司生产，Thermo Multiskan FC酶标仪为赛默飞世尔科技公司生产；透析袋为购自北京索莱宝科技有限公司的3500D透析袋。

实施例一

制备一种石房蛤毒素(STX)的半抗原(STX-VLP)，方法如下：

(1)按说明将购买的STX用dd水溶解，准确吸取10μmol STX，溶于1mL 0.1M的HCl中，冷却至4℃。然后逐步滴加4℃预冷的0.01M亚硝酸钠溶液(现配现用)，用淀粉碘化钾试纸监测反应，当试纸变成蓝灰色时停止滴加。4℃旋转混合反应30min后，用淀粉碘化钾试纸再次检测，试纸没有变化，再逐滴滴加亚硝酸钠溶液，保持酸性条件，当试纸变成蓝灰色时停止滴加，继续反应1h，得到A液。

(2)准确称取1mg VLP，于4℃条件下加入1mL 1×PBS中，搅拌使其完全溶解，记为B液。

(3)在4℃、持续搅拌的条件下，逐滴滴加A液到B液中，同时用1M的NaOH溶液调节pH，使pH保持在9，4℃搅拌3h，最后将溶液用1×PBS定容到3mL，即得到STX-VLP半抗原原液。

(4)将步骤(3)制备的STX-VLP半抗原原液装入透析袋，4℃条件下用1×PBS缓冲液透析2d(每天更换3次缓冲液，每次间隔不少于4h)，即得到纯化后的STX-VLP半抗原，制备过程见图1，制备的STX-VLP半抗原的效果图见图2。

(5)用紫外分光光度计检测步骤(4)制备的纯化后的STX-VLP半抗原进行检测，检测之前要确认小分子吸收峰与VLP吸收峰不重叠，测定载体蛋白VLP的特征吸收波长，浓度1.0mg/mL；测定STX的特征吸收波长，浓度0.1mg/mL；测定STX-VLP抗原的特征吸收波长，浓度0.1mg/mL，结果见图3。

实施例二

制备一种STX-VLP半抗原，方法与实施例一完全相同，只是步骤(3)中的pH为10，反应时间为4h，步骤(4)中透析3d。

实施例三

制备一种STX-VLP半抗原，方法与实施例一完全相同，只是步骤(3)中的pH为10，反应时间为2h，步骤(4)中透析1d。

实施例四

小鼠血清效价检测ELISA方法：

(1)包被：稀释液包被STX-VLP抗原(每孔50ng)，100μL/孔，4℃冰箱过夜(约16～18h)；弃去孔内液体，PBST洗涤4次，3min/次，拍干。

(2)封闭：加入5％PBS-BSA封闭液，300μL/孔，37℃孵育2h，弃孔内液体，PBST洗涤4次，3min/次，拍干。

(3)加样：用抗体稀释液倍比稀释血清，100μL/孔，37℃孵育1h，弃孔内液体，PBST洗涤3次，3min/次，拍干。

(4)二抗：根据试剂说明书上写的稀释倍数稀释HRP-羊抗鼠IgG，以100μL/孔加入到各孔中，37℃孵育1h，弃孔内液体，PBST洗涤3次，3min/次，拍干。

(5)显色：每孔加入现配的TMB显色剂100μL，避光孵育30min。

(6)终止：孵育lh，终止反应。

(7)检测：酶标仪450nm波长检测。

实施例五

制备一种抗石房蛤毒素的单克隆抗体，包括以下步骤：

S1、小鼠免疫。取3只8周龄的雌性BALB/c小鼠，用实施例一获得的纯化的免疫抗原对其进行免疫。

免疫抗原与等量的弗氏完全佐剂混合，采用腹腔、皮下联合多点注射方式进行初次免疫，每只小鼠注射50μg免疫抗原。初次免疫2周后，采用免疫抗原与等量的不弗氏完全佐剂混合进行加强免疫，免疫剂量和途径与初次免疫相同。每2周加强免疫1次，共加强免疫3次后，直接腹腔注射50μg抗原，进行加强免疫。每次免疫后第7d采用实施例四所述ELISA检测方法检测小鼠中抗体产生情况。

S2、培养SP2/0骨髓瘤细胞。将冻存在液氮中的SP2/0骨髓瘤细胞取出一支，立即将其转移到37℃恒温水浴锅中，不时轻柔晃动冻存管，当细胞融化至半冰晶状态时取出。在无菌环境内操作，把冻存管中的SP2/0细胞转入50mL无菌离心管中，取预热的1640完全培养基10mL缓慢滴加入离心管中，1000r/min离心5min，弃去上清。将细胞团轻柔打散，取5mL培养基重悬细胞并将其转移至T75细胞培养瓶中。另外补加5mL培养基，“十字”方向晃动细胞瓶，放入5％CO

S3、制备免疫小鼠脾细胞。在腹腔注射50μg抗原进行加强免疫后的第3天，分别取3只免疫小鼠的血清，采用实施例四所述方法进行血清ELISA检测，选取血清ELISA检测效价最高的免疫小鼠，在生物安全柜内使用已灭菌的剪刀和镊子剪开小鼠外皮，更换一套新的已灭菌的剪刀镊子剪开小鼠腹腔，再用一套已灭菌的剪刀和镊子小心取出脾脏，剪掉多余的脂肪。准备一支无菌15mL离心管，加入10mL DMEM培养基，将脾脏放入该离心管中，脾脏润湿后小心弃去多余培养基。再吸取10mL的DMEM培养基置于无菌平皿中，用毛玻璃片研磨脾脏，制成单细胞悬液并通过200目尼龙网过滤到无菌离心管中，在50mL无菌离心管中加入30mL的DMEM，用吸管冲洗尼龙网，将装有脾细胞悬液的离心管离心，1500rpm，5min，弃去上清，用手轻轻打散细胞团，再加入30mL DMEM培养基重悬后再离心一次，然后弃去上清，用手轻轻打散细胞团，再加入10mL DMEM培养基重悬。

S4、细胞融合。1000rpm，5min离心收集步骤S2中生长良好的SP2/0细胞于50mL离心管中，轻轻打散SP2/0细胞团，加入30mL DMEM培养基重悬，再离心一次后，加入10mL DMEM培养基重悬，再将脾细胞悬液与SP2/0细胞悬液混合，1000rpm离心5min，弃去上清，轻轻打散细胞团。置于37℃水浴环境中，吸取1mL PEG1500融合剂滴加到离心管中，1min内加完1mL，此时细胞状态为红色均质流沙状，转动管壁感觉像毛玻璃状。

S5、终止融合。吸取9mL DMEM培养基来终止融合，共分为三个阶段。第一阶段为前1min内滴加1mL，第二阶段为1min内滴加1mL，第三阶段为3min内滴加完剩余的7mL培养基。然后在37℃水浴中静置稳定5min后，800rpm离心5min。

S6、融合细胞的选择性培养。将HAT培养液重新悬浮的融合细胞按照100μL/孔，加入到预先制备好的含饲养细胞的96孔培养板中。放入5％CO

S7、有限稀释法克隆杂交瘤细胞。调整杂交瘤细胞密度到3-10个/mL加到含饲养细胞的96孔培养板，每个孔加0.1mL。当孔底细胞集落在1-2mm大小时，吸出杂交瘤细胞生长孔上清液。按抗体筛选方法检测上清液中的抗体。将抗体阳性的孔内细胞移到24孔培养板扩大培养2-4天。重复以上，将扩大培养后的阳性细胞再重复克隆2-3次，直到杂交瘤细胞的阳性孔率达到100％为止，即认为此为单克隆，即建株成功的细胞株。将筛选到的阳性单克隆扩大培养，按10

S8、制备腹水。收集步骤S7获得的阳性杂交瘤细胞接种至雌性BALB/c小鼠腹腔，每只小鼠注射0.5mL，注意观察小鼠生长状态，10d后待小鼠腹部涨大时方可收集腹水，收集小鼠腹水于离心管中，8000r/min离心20min，吸取中间腹水层用实施例四所述ELISA检测方法检测腹水是否制备成功。

S9、纯化制备成功的腹水。采用ProteinG亲和层析法进行纯化，ProteinG亲和层析柱用10mmol/L的PBS平衡柱子后取腹水过柱，然后用10mmol/L的PBS洗柱至其OD值约为0，以0.1mol/L的甘氨酸盐酸溶液洗脱，收集洗脱液，测定各收集管的OD值，采用BCA蛋白定量试剂盒检测抗体浓度。

实施例六

建立STX的竞争性ELISA检测方法

(1)根据实验需要设计好包被板数，并在板条上做上标记

(2)用PBS包被液将石房蛤毒素-VLP偶联物稀释成1μg/mL，混匀后加入板条中，每孔100μL，4℃冰箱过夜。

(3)包被好后，弃去包被液，洗板3次，每孔加入200μL封闭液，37℃恒温箱培养1h。取出酶标板，弃去内液，洗板1次。

(4)将1μg/mL的STX作为起始浓度，用1×PBS不断稀释分别获得50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39ng/mL的溶液100μL/孔，然后各孔加入100μL实施例五制备的STX单克隆抗体，并设置空白对照、阴性对照，然后将酶标板置于37℃恒温箱培养1h。其中，空白对照为200μL PBS，阴性对照为100μLPBS+100μL抗体。

(5)取出酶标板，弃去内液，洗板3次，向每孔中加入100μL稀释好的山羊抗鼠酶标二抗，按照说明书比例稀释1:10000，置于37℃恒温箱培养1h。

(6)取出酶标板，弃去内液，洗板4次，每孔先加入100μL TMB显色液，37℃，孵育30min。

(7)读色完成后，每孔加入100μL 1M HCl溶液，终止反应。即刻在酶标仪450nm波长下读数。各孔的检测结果见表1，制备的标准曲线见图5。

表1竞争性ELISA结果

结果分析

一、对制备的半抗原进行分析

由于偶联物中既含有STX的吸光基团，又含有载体蛋白的吸光基团，使得STX-VLP最大吸收波长在STX与VLP的最大吸收波长之间。由图3可以看出，STX标准品(0.1mg/mL)在234nm和265nm出现峰值，其吸光值分别为1.17和0.68；VLP(1mg/mL)在278nm和在346nm出现峰值，其吸光值分别为0.91和0.11；STX-VLP在266nm出现峰值，吸光值为0.15，浓度为68.4μg/mL。实施例一制备的半抗原的最大吸收波长在STX与VLP之间，符合预期，抗原制备成功，可用于后续免疫反应。

二、抗STX的单克隆抗体的鉴定

(1)效价鉴定

将实施例一制备的STX-VLP偶联物作为包被抗原，用CBS缓冲液稀释到1μg/mL添加到96孔酶标板，每孔100μL，4℃过夜。弃去残液，洗涤三次、拍干，96孔酶标板每孔加入300μL封闭液，37℃孵育3h，封闭好的96孔酶标板可保存在4℃数周待用。测定时，弃去封闭液，洗板三次，拍干，加入1:4K，1:8K，1:16K，1:32K，1:64K，1:128K，1:256K进行稀释的抗体，每孔100μL，37℃孵育1h；从温箱中取出酶标板，洗板、拍干，加入适当稀释的酶标羊抗鼠第二抗体，每孔100μL，37℃孵育45min；洗板、拍干，每孔加TMB底物溶液100μL，37℃孵育15min，每孔加50μL终止液中止反应，于450nm波长下测定每孔的OD值，并确定制备的单克隆抗体的效价，抗体效价定义为样品检测孔的OD450与阴性对照孔的OD450值之比(P/N)≥2.1，结果见表2。

表2单克隆抗体效价鉴定结果

由表2可以看出，制备的抗石房蛤毒素的单克隆抗体和石房蛤毒素半抗原都是成功的，抗体效价为256K。

(2)SDS-PAGE电泳鉴定

ProteinAFF亲和层析柱纯化小鼠腹水中的IgG抗体，在pH4.2下可以洗出一个蛋白峰，即为抗体蛋白。经SDS-PAGE鉴定得到两条蛋白带，一条颜色较深，另一条较浅，大小分别在50kD和25kD处，与IgG重链、轻链的实际大小相符，结果见图4。

三、对实施例六建立的STX竞争性ELISA检测方法进行评价

由表1和图5可以看出，竞争性ELISA检测法在1.5ng/mL至25ng/mL范围呈现较好的线性拟合，经计算，确定拟合曲线为y＝-0.252ln(x)+1.0096，表明该单克隆抗体能较为特异地识别石房蛤毒素。

四、对实施例六建立的STX竞争性ELISA检测方法进行准确性评估

将STX标准品用1×PBS稀释成浓度为50ng/mL的溶液，记为加标样品；阴性样本为1×PBS。在酶标仪上于450nm波长下分别检测50ng/mL阴性样本，50ng/mL标准品以及加标样品的OD值，并按公式：P＝加标试样测定值/加标量×100％，计算回收率，结果见表3。

表3回收率检测

由表3可以看出，回收率在85-115％之间，符合中国药典规定要求。

因此，本发明通过合成的石房蛤毒素人工半抗原成功制备了石房蛤毒素的单克隆抗体，制备的石房蛤毒素单克隆抗体具有纯度高、专一性强、效价高的优点，可以避免不同细胞及微生物种或株间血清学上的交叉反应，从而大大提高石房蛤毒素的检测特异性和灵敏性，具有良好的应用前景；石房蛤毒素半抗原和单克隆抗体的制备方法，安全有效，无毒无害，无需特殊的仪器设备和苛刻复杂的反应条件。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。