一种黑色素瘤转移预测电子设备

技术领域

本发明属于医疗设备技术领域，特别涉及一种黑色素瘤转移预测电子设备。

背景技术

黑色素瘤是最致命的皮肤恶性肿瘤，早期(I期、II期)黑色素瘤经手术治疗后五年生存率最高可达95％。然而，转移是黑色素瘤患者预后的分水岭。虽然当前如达拉非尼、维莫非尼等小分子靶向药物已在黑色素瘤治疗中提供巨大助力，转移性黑色素瘤患者的五年生存率仍然仅有34％。因此，如何去预测早期已切除黑色素瘤的转移潜能，并选择合适的辅助治疗方式以减少转移的概率，是在黑色素瘤诊治中的亟待解决的问题。

发明内容

本申请实施例之一，一种可以预测早期已切除黑色素瘤转移潜能及推荐合适辅助治疗方式的评分系统。

本系统基于原发性与转移性黑色素瘤患者的bulk-seq和scRNA-seq数据，构建了可以预测黑色素转移潜能及预后转移评分(MET score)模型。通过划痕、迁移、侵袭、免疫荧光、免疫组化、流式细胞术、HE染色、皮下成瘤、尾静脉肺转移和荧光素活体成像验证了METscore的有效性及稳定性。

同时，通过该系统的预后转移评分(MET score)模型，发现PD-1单抗可有效减少低MET score组患者的术后肿瘤转移的概率，因此可作为其辅助治疗手段。使得MET score实现了对早期已切除黑色素瘤的转移潜能的判断，并为术后辅助治疗的选择提供了一定的参考。

本申请实施例的有益效果包括，预测早期已切除黑色素瘤的转移潜能及预后，将PD-1单抗作为早期已切除黑色素瘤的术后辅助治疗，完善了黑色素瘤的分子分型。

具体实施方式

免疫治疗，尤其是PD-1单抗等免疫检查点抑制剂的出现，大大改善了转移性黑色素瘤患者的预后。CheckMate 067临床试验表明在转移性黑色素瘤中，Nivolumab和Ipilimumab联用的患者6.5年生存率最高可达到57％。然而，免疫检查点抑制剂，是否可作为早期已切除黑色素瘤的辅助治疗方式，以减少肿瘤转移的概率仍然是未知的。

而高通量测序技术，特别是传统转录组测序(bulk-seq)和单细胞RNA测序(scRNA-seq)的出现，使得肿瘤研究迈入到精准时代。结合bulk-seq和scRNA-seq技术，使得大规模的临床队列信息与高精度的单细胞分子特征实现有机结合，为从多个维度解析肿瘤的转移机制提供强大助力。

研究表明，肿瘤转移并不是一种单分子或单通路驱动的生物学过程，而是肿瘤细胞通过复杂信号与肿瘤微环境中各个细胞的动态交互的结果，因此从多组学、大队列的角度解析黑色素瘤转移具有重要的意义。

根据一个或者多个实施例，基于原发性与转移性黑色素瘤的scRNA-seq(GSE189889)、bulk-seq(GSE46517)数据，通过COX回归、LASSO回归、Bootstrap等多种机器学习算法及多个黑色素瘤临床队列(TCGA-SKCM和GSE65904)的验证，确定了HPS4、GCA、FAS和SGCE等四个在转移性黑色素瘤中上调的基因与黑色素瘤患者预后密切相关，并据此完成了MET score的构建。

根据MET score的中位值，可将黑色素瘤患者分为高MET score组和低MET score组。其中，低MET score组患者转移潜能较低，预后较好，对PD-1单抗的应答率较高；高METscore组患者转移潜能较高，预后较差，对PD-1单抗的应答率较低。

通过对小鼠黑色素瘤细胞系B16F0和B16F10的scRNA-seq(GSE156444)与bulk-seq(自测数据)，进一步证实了MET score可精确表征黑色素瘤转移潜能。进一步通过划痕、迁移、侵袭、免疫荧光、免疫组化、流式细胞术、HE染色、皮下成瘤、尾静脉肺转移和荧光素活体成像等实验，验证MET score的有效性与稳健性。

本实施例的研究过程包括：

(1)利用早期黑色素瘤患者手术切除的肿瘤组织，进行bulk-seq，获取该患者的全转录组表达矩阵。

(2)提取该患者的HPS4、GCA、FAS、SGCE4个基因的表达矩阵，按TCGA-SKCM(训练集)所得的Bootstrap系数，计算患者的MET score。

(3)按照TCGA-SKCM(训练集)所得的MET score的cut-off值，将该患者分入高/低MET score组。

(4)若患者为高MET score组，则认为其肿瘤转移潜能较高，预后较差，不推荐使用PD-1单抗作为其术后辅助治疗手段；若患者为低MET score组，则认为其肿瘤转移潜能较低，预后较好，推荐使用PD-1单抗作为其术后辅助治疗手段。

本申请实施例，实现了对早期已切除黑色素瘤进行分子分型，并预测其转移潜能及推荐合适的辅助治疗方式。

根据一个或者多个实施例，

(1)从GSE46517和GSE189889分别下载原发性和转移性黑色素瘤的bulk-seq与scRNA-seq数据，经过数据预处理和细胞注释后进行差异分析，分别得到bulk-seq层面和scRNA-seq层面的，在转移性黑色素瘤中上调的基因，并取交集。

(2)从TCGA-SKCM(训练集)和GSE65904(验证集)队列下载黑色素瘤患者的基因表达数据及临床数据。随后提取所有交集基因的表达矩阵。

(3)采用COX回归分析联合Bootstrap算法和LASSO回归分析筛选与黑色素瘤患者预后密切相关的交集基因，并获得其相应的Bootstrap系数。

(4)计算每一位患者的MET score，MET score为HPS4、GCA、FAS、SGCE的表达水平与其Bootstrap系数的乘积的和。依据MET score的中位值，可将患者分入高/低MET score组。如果用计算公式表达，则有：

MET score＝

HPS4*1.426359413+GCA*(--2.785770782)+FAS*(-1.839130783)+SGCE*(-1.408391491)。

(5)高MET score组代表高转移潜能组，低MET score组代表低转移潜能；高METscore组代表不良预后，而低MET score组预后较好；高MET score组对PD-1单抗应答率较低，而低MET score组对PD-1单抗应答率较高。

根据一个或者多个实施例，通过公共数据库中的原发性和转移性黑色素瘤的bulk-seq与scRNA-seq的数据，结合LASSO回归、COX回归以及Bootstrap等多种机器学习算法，确定HPS4、GCA、FAS和SGCE等四个在转移性黑色素瘤中上调的且与黑色素瘤患者预后密切相关的基因。并通过每个患者中这四个基因的表达水平及其对应的Bootstrap系数，计算得到其相应的MET score。根据MET score的中位值，可将黑色素瘤患者分为高MET score组和低MET score组。

B16F0和B16F10是两种小鼠黑色素瘤细胞系，其中，B16F10被认为是B16F0细胞株的高转移潜能亚克隆。通过划痕、迁移、侵袭、尾静脉肺转移和荧光素活体成像等实验，验证了B16F10较B16F0细胞系具有更高的转移能力。最后通过对B16F0和B16F10的scRNA-seq与bulk-seq数据，发现B16F10较B16F0而言有着更高的MET score，因此，可以使用B16F0和B16F10细胞系分别表征低和高MET score组。

由于免疫微环境在肿瘤转移演进过程中起着至关重要的作用，因此推测高低METscore组具有截然不同的免疫微环境。通过CIBERSORT与TIP算法揭示了高MET score组的患者呈现免疫抑制微环境状态，具体表现为更少的CD8+T细胞的浸润和更多的Treg细胞的浸润。通过免疫荧光和流式细胞术证实了在注射B16F10细胞形成的皮下瘤中，具有更少的CD8+T细胞浸润和更多的Treg细胞的浸润。

由于PD-1单抗是转移性黑色素瘤治疗中极为关键的一环，因此进一步通过免疫组化验证注射B16F0和B16F10细胞形成的皮下瘤中PD-1表达水平，发现PD-1在注射B16F0细胞形成的皮下瘤中表达明显较高。因此，获知低MET score组可能具有更高PD-1单抗应答率。由此，本申请实施例在四个黑色素瘤免疫治疗队列(GSE35640,GSE78220,GSE91061,GSE115821)中构建了MET score，证实了低MET score组的免疫治疗应答率较高。

将24只C57小鼠分成B16F0+PBS、B16F10+PBS、B16F0+PD1、B16F0+PD1四组，通过尾静脉注射相应的肿瘤细胞构建黑色素瘤肺转移模型。在注射后第7天通过荧光素活体成像实验验证四组小鼠均未发生肺转移，即基线数据一致。在注射后第14天再次进行荧光素活体成像实验和肺转移灶HE染色实验，通过比较肺转移灶荧光强度和HE染色下肺转移灶数量，发现较B16F0+PBS组小鼠而言，B16F0+PD1组小鼠的肺转移灶荧光强度和HE染色下肺转移灶数量明显下降，而在两组B16F10组小鼠间并未观察到这种变化。

最后，通过免疫荧光实验发现PD-1单抗显著提高了B16F0肺转移模型小鼠的CD8+T细胞的浸润。

以上的结果证实了MET score可以作为预测早期已切除黑色素瘤的转移潜能的有效且稳健的工具，并且为特定的具有低MET score的黑色素瘤患者使用PD-1单抗作为术后辅助治疗的方式提供了依据。

本申请的有益效果在于，

本申请技术方案，操作简单且成本较低，仅需要对患者肿瘤组织进行bulk-seq即可得到该患者的MET score；

本申请技术方案稳定可靠，经过超过1100例病人的黑色素瘤队列、小鼠黑色素瘤细胞系的bulk-seq和scRNA-seq的检验，并通过划痕、迁移、侵袭、免疫荧光、免疫组化、流式细胞术、HE染色、皮下成瘤、尾静脉肺转移和荧光素活体成像等体内外实验的验证；

本申请预测效能良好，高低MET score组的预后、转移潜能以及对PD-1单抗的应答率具有显著差异。

本申请涉及的术语包括：

CheckMate 067:一项关于纳武利尤单抗联合伊匹木单抗用于晚期黑色素瘤的临床研究

Nivolumab：纳武利尤单抗，PD-1单抗的一种，用于晚期黑色素瘤的免疫治疗。Ipilimumab：伊匹木单抗，CTLA-4单抗的一种，用于晚期黑色素瘤的免疫治疗。转录组测序(bulk-seq):转录组测序是通过高通量测序技术，研究组织中全部细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，主要包括mRNA和非编码RNA。

单细胞测序(scRNA-seq)：单细胞测序是通过高通量测序技术，在单个细胞水平上，研究其在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，主要包括mRNA。

转移评分(MET score)：指我们开发的一种可以预测早期已切除黑色素瘤患者转移潜能的评分系统。

PD-1单抗：是指靶向效应T细胞表面PD-1分子的抗体，有助于解除免疫刹车，激活抗肿瘤免疫应答。

GSE46517：一个包含转移性黑色素瘤与原发性黑色素瘤bulk-seq数据的队列。GSE189889：一个包含转移性黑色素瘤与原发性黑色素瘤scRNA-seq数据的队列。

黑色素瘤临床队列(TCGA-SKCM和GSE65904):两个包含黑色素瘤患者bulk-seq数据与预后数据的队列。

scRNA-seq(GSE156444):小鼠黑色素瘤细胞系B16F0与B16F10的scRNA-seq数据。

四个黑色素瘤免疫治疗队列(GSE35640,GSE78220,GSE91061,GSE115821)：四个包含黑色素瘤患者bulk-seq数据与免疫治疗应答率的队列。

本申请集成单元如果以软件功能单元的形式实现并作为独立的产品销售或使用时，可以存储在一个计算机可读取存储介质中。基于这样的理解，本发明的技术方案本质上或者说对现有技术做出贡献的部分，或者该技术方案的全部或部分可以以软件产品的形式体现出来，该计算机软件产品存储在一个存储介质中，包括若干指令用以使得一台计算机设备(可以是个人计算机，服务器，或者网络设备等)执行本发明各个实施例所述方法的全部或部分步骤。而前述的存储介质包括：U盘、移动硬盘、只读存储器(ROM，Read-OnlyMemory)、随机存取存储器(RAM，Random Access Memory)、磁碟或者光盘等各种可以存储程序代码的介质。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。