一种发酵制备柠檬酸的方法

技术领域

本发明涉及柠檬酸制备技术领域，具体涉及一种发酵制备柠檬酸的方法。

背景技术

柠檬酸（C

现有柠檬酸的生产方法有：天然提纯法、化学合成法和生物发酵法。其中，天然提纯法是向富含柠檬酸的水果蔬菜中添加石灰乳形成钙盐，再经硫酸处理，浓缩得柠檬酸，但天然提纯法产出量低，不适合大规模工业生产；采用化学合成法时，常常会伴随有毒物质产生，生产工艺复杂，且需采用比柠檬酸更昂贵的试剂，因此，不适合规模生产；而生物发酵法则是最常用的方法。在生物发酵中，超过80%的柠檬酸产品是黑曲霉菌种在含有葡萄糖或制糖加工副产物以及农产品加工废料中通过深层发酵方式得到的。

柠檬酸发酵制备过程的关键技术有：发酵原料、菌种的选择、发酵过程控制和提纯精制工艺，其中在菌种选择方面，虽然黑曲霉是食品级安全的丝状真菌，具有酶系丰富、副产物少等优势，但为了进一步缩短发酵周期、提高柠檬酸的产量和纯度，往往对黑曲霉进行诱变和转基因处理，但基因工程的使用和研究需要大量的资金和时间支撑，不利于工业大规模普及和应用，同时诱变或转基因处理作为一种新兴的生物技术手段，但其具有不成熟和不确定性，使得转基因食品伴随着生物安全性的问题。

现有技术中，CN1673385A 利用生物技术由薯芋类植物生产柠檬酸和皂素的方法中公开了采用枯草芽孢杆菌、乳酸菌和黑曲霉共同发酵制备柠檬酸，但制得柠檬酸的转化率为35%，提纯收率85%（含结晶水），发酵周期为65-70h，CN105886556B一种混菌发酵农作物秸秆生产柠檬酸的方法公开了利用里氏木霉、黑曲霉和黄孢原毛平革菌混合发酵制备柠檬酸，发酵周期112h，柠檬酸产量108.6g/L，由此可见，现有技术中，虽然有混合菌种组合用于发酵制备柠檬酸，但仍存在着发酵周期过长，产量低和转化率低的问题，而且不同的菌株，其性能截然不同，选择合适的菌株进行组合并用于发酵制备柠檬酸以实现柠檬酸发酵周期短，转化率高和产率高，是利用发酵法制备柠檬酸中亟需解决的关键问题。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种发酵法制备柠檬酸的方法。该方法采用好食脉孢菌、米曲霉和黑曲霉共同发酵制备柠檬酸，使得柠檬酸的发酵周期短，产量、转化率高。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种发酵制备柠檬酸的方法，包括以下步骤：

（1）将好食脉孢菌、米曲霉和黑曲霉接种于柠檬酸发酵培养基中，发酵培养，得柠檬酸发酵液；

（2）将柠檬酸发酵液经提纯，得柠檬酸。

优选的，步骤（1）中，将好食脉孢菌种子液、米曲霉种子液和黑曲霉种子液按体积比1:（3-5）:（4-6）混合后，得混合种子液，将混合种子液接种于柠檬酸发酵培养基中进行发酵培养。

进一步优选的，混合种子液的接种量为柠檬酸发酵培养基体积的15%-20%。

进一步优选的，混合种子液中，好食脉孢菌的活菌数≥1.8×10

进一步优选的，好食脉孢菌的菌株编号为CICC 40204，米曲霉的菌株编号为CICC2397，黑曲霉的菌株编号为CICC 40048。

优选的，发酵条件为：发酵温度为32-40℃，初始通气量为0.1-0.2v/（v·min），初始搅拌转速为180-220 r/min，初始罐压为0.1-0.2MPa，初始溶氧量100％，随着发酵进行，待溶氧量≤15%时，调节通气量和搅拌转速，控制溶氧量为15%-25%，待柠檬酸发酵培养基中还原糖≤4g/L时，停止发酵。

优选的，步骤（1）中，柠檬酸发酵培养基包括以下重量份的原料：100-120份淀粉质糖化液、4.5-5份(NH

进一步优选的，微量元素混合液包括：0.5g/L氨基乙酸、3.0g/L MgSO

进一步优选的，所述淀粉质糖化液的制备方法为：将淀粉质原料粉碎后，调浆，加入淀粉酶于110℃-120℃下进行液化60min，得淀粉质液化液，将淀粉质液化液降温至50-60℃，加入糖化酶，保温糖化30min，得淀粉质糖化液。

优选的，淀粉质原料为玉米、薯类、小麦和高粱中的一种或多种。

优选的，粉碎后的淀粉质原料的粒径为60-80目。

优选的，淀粉质原料调浆后的浓度为20-30wt%。

优选的，淀粉酶的加入量为淀粉质原料质量的1-3%。

优选的，糖化酶的加入量为淀粉质原料质量的2-4%。

优选的，步骤（2）中，提纯操作为：将柠檬酸发酵液经膜除菌、电渗析、脱色、离子交换和浓缩结晶，得柠檬酸。

本发明的有益效果：

本发明所采用的好食脉孢菌、米曲霉和黑曲霉均采用有氧发酵，且对营养物需求相同，因此，各菌种之间无拮抗作用。另外，本发明将多个发酵菌种复配使用，好食脉孢菌、米曲霉和黑曲霉协同作用，用于柠檬酸的发酵制备，可缩短柠檬酸的发酵周期，提高柠檬酸的产量和转化率。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术所述，现有技术中，多采用黑曲霉作为发酵菌种制备柠檬酸，为提高柠檬酸的产量和转化率，缩短柠檬酸的发酵周期，往往对黑曲霉进行诱变和转基因处理，但基因工程的研究和使用需大量资金和时间支撑，不适合工业发规模普及和应用，且转基因和诱变处理后的基因存在生物安全性问题。同时，现有技术中虽然有不同菌种组合用于发酵制备柠檬酸，但仍存在发酵周期长、柠檬酸转化率低、产量低的问题。

基于此，本发明提供了一种发酵制备柠檬酸的方法，包括以下步骤：

（1）将好食脉孢菌、米曲霉和黑曲霉接种于柠檬酸发酵培养基中，发酵培养，得柠檬酸发酵液；

（2）将柠檬酸发酵液经膜除菌、电渗析、脱色、离子交换和浓缩结晶，得柠檬酸。

步骤（1）中，将好食脉孢菌种子液、米曲霉种子液和黑曲霉种子液按体积比1:（3-5）:（4-6）混合后，得混合种子液，将混合种子液接种于柠檬酸发酵培养基中进行发酵培养。

混合种子液中，好食脉孢菌的活菌数≥1.8×10

本发明中，对于种子培养的具体方式和条件没有特别限制，只要能够获得菌体生产状态良好的种子液即可。

柠檬酸发酵培养基包括以下重量份的组分：100-120份淀粉质糖化液、4.5-5份(NH

其中，微量元素混合液包括：0.5g/L氨基乙酸、3.0g/L MgSO

淀粉质糖化液的制备方法为：将淀粉质原料粉碎至粒径为50-60目，调浆使得调浆后的淀粉质原料浓度为20-30wt%，再加入淀粉酶，于110-120℃下液化60min，得淀粉质液化液，将淀粉质液化液降温至50-60℃，加入糖化酶，保温糖化30min，得淀粉质糖化液。

淀粉质原料为玉米、薯类、小麦和高粱中的一种或多种。

淀粉酶的加入量为淀粉质原料质量的1-3%，糖化酶的加入量为淀粉质原料质量的2-4%。

发酵条件为：发酵温度为32-40℃，初始通气量为0.1-0.2v/（v·min），初始搅拌转速为180-220r/min，初始罐压为0.1-0.2MPa，初始溶氧量为100%，随着发酵进行，待溶氧量≤15%时，调节通气量，控制溶氧量为15%-25%，待柠檬酸发酵培养基中还原糖≤4g/L时，停止发酵。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

本发明以下实施例和对比例所采用的好食脉孢菌（Neurospora sitophila）购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为CICC 40204；米曲霉（Aspergillusoryzae）购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为CICC 2397；黑曲霉（

实施例1：柠檬酸的制备

（1）将玉米粉碎至粒径为70目，加水调浆，使得玉米调浆后的浓度为25wt%，加入淀粉酶，于110℃下液化60min，得到淀粉质液化液，将淀粉质液化液降温至55℃，加入糖化酶，保温糖化30min，得淀粉质糖化液，其中，淀粉酶的加入量为玉米质量的2%，糖化酶的加入量为玉米质量的3%；

将110g淀粉质糖化液、4.8g(NH

将好食脉孢菌种子液、米曲霉种子液和黑曲霉种子液按照体积比1:4:5混合均匀后，得混合种子液，将混合种子液接种于柠檬酸发酵培养基中，混合种子液的接种量为柠檬酸发酵培养基体积的18%，于37℃下进行发酵，发酵初始通气量为0.15 v/（v·min），初始搅拌转速为200 r/min，初始罐压为0.15MPa，初始溶氧量为100%，随着发酵进行，待溶氧量≤15%时，调节通气量和搅拌转速，控制溶氧量为15%-25%，待柠檬酸发酵培养基中还原糖为4g/L时，停止发酵，得柠檬酸发酵液；

（2）将步骤（1）制得的柠檬酸发酵液经膜除菌、电渗析、脱色、离子交换和浓缩结晶，得柠檬酸。

实施例2：柠檬酸的制备

（1）将红薯粉碎至粒径为60目，加水调浆，使得红薯调浆后的浓度为20wt%，加入淀粉酶，于100℃下液化60min，得到淀粉质液化液，将淀粉质液化液降温至50℃，加入糖化酶，保温糖化30min，得淀粉质糖化液，其中，淀粉酶的加入量为红薯质量的1%，糖化酶的加入量为红薯质量的3%；

将100g淀粉质糖化液、4.5g(NH

将好食脉孢菌种子液、米曲霉种子液和黑曲霉种子液按照体积比1:3:4混合均匀后，得混合种子液，将混合种子液接种于柠檬酸发酵培养基中，混合种子液的接种量为柠檬酸发酵培养基体积的15%，于32℃下进行发酵培养，发酵初始通气量为0.1v/（v·min），初始搅拌转速为180 r/min，初始罐压为0.1MPa，初始溶氧量为100%，随着发酵进行，待溶氧量≤15%时，调节通气量和搅拌转速，控制溶氧量为15%-25%，待柠檬酸发酵培养基中还原糖为4g/L时，停止发酵，得柠檬酸发酵液；

（2）将步骤（1）制得的柠檬酸发酵液经膜除菌、电渗析、脱色、离子交换和浓缩结晶，得柠檬酸。

实施例3：柠檬酸的制备

（1）将小麦粉碎至粒径为80目，加水调浆，使得小麦调浆后的浓度为30wt%，加入淀粉酶，于120℃下液化60min，得到淀粉质液化液，将淀粉质液化液降温至60℃，加入糖化酶，保温糖化30min，得淀粉质糖化液，其中，淀粉酶的加入量为小麦质量的3%，糖化酶的加入量为小麦质量的4%；

将120g淀粉质糖化液、5g(NH

将好食脉孢菌种子液、米曲霉种子液和黑曲霉种子液按照体积比1:5:6混合均匀后，得混合种子液，将混合种子液接种于柠檬酸发酵培养基中，混合种子液的接种量为柠檬酸发酵培养基体积的20%，于40℃下进行发酵，发酵初始通气量为0.2v/（v·min），初始搅拌转速为220r/min，初始罐压为0.2MPa，初始溶氧量为100%，随着发酵进行，待溶氧量≤15%时，调节通气量和搅拌转速，控制溶氧量为15%-25%，待柠檬酸发酵培养基中还原糖为4g/L时，停止发酵，得柠檬酸发酵液；

（2）将步骤（1）制得的柠檬酸发酵液经膜除菌、电渗析、脱色、离子交换和浓缩结晶，得柠檬酸。

对比例1：利用黑曲霉发酵制备柠檬酸

（1）将黑曲霉种子液接种于柠檬酸发酵培养基中，柠檬酸发酵培养基与实施例1的柠檬酸发酵培养基相同，黑曲霉种子液的接种量为柠檬酸发酵培养基体积的18%，于37℃下进行发酵，发酵初始通气量为0.15v/（v·min），初始搅拌转速为200r/min，初始罐压为0.15MPa，初始溶氧量为100%，随着发酵进行，待溶氧量≤15%时，调节通气量和搅拌转速，控制溶氧量为15%-25%，待柠檬酸发酵培养基中还原糖为4g/L时，停止发酵，得柠檬酸发酵液；

（2）将步骤（1）制得的柠檬酸发酵液经膜除菌、电渗析、脱色、离子交换和浓缩结晶，得柠檬酸。

对比例2：利用米曲霉发酵制备柠檬酸

（1）将米曲霉种子液接种于柠檬酸发酵培养基中，柠檬酸发酵培养基与实施例1的柠檬酸发酵培养基相同，米曲霉种子液的接种量为柠檬酸发酵培养基体积的18%，于37℃下进行发酵，发酵初始通气量为0.15v/（v·min），初始搅拌转速为200r/min，初始罐压为0.15MPa，初始溶氧量为100%，随着发酵进行，待溶氧量≤15%时，调节通气量和搅拌转速，控制溶氧量为15%-25%，待柠檬酸发酵培养基中还原糖为4g/L时，停止发酵，得柠檬酸发酵液；

（2）将步骤（1）制得的柠檬酸发酵液经膜除菌、电渗析、脱色、离子交换和浓缩结晶，得柠檬酸。

对比例3：利用好食脉孢菌发酵制备柠檬酸

（1）将好食脉孢菌种子液接种于柠檬酸发酵培养基中，柠檬酸发酵培养基与实施例1的柠檬酸发酵培养基相同，好食脉孢菌种子液的接种量为柠檬酸发酵培养基体积的18%，于37℃下进行发酵，发酵初始通气量为0.15 v/（v·min），初始搅拌转速为200 r/min，初始罐压为0.15MPa，初始溶氧量为100%，随着发酵进行，待溶氧量≤15%时，调节通气量和搅拌转速，控制溶氧量为15%-25%，待柠檬酸发酵培养基中还原糖为4g/L时，停止发酵，得柠檬酸发酵液；

（2）将步骤（1）制得的柠檬酸发酵液经膜除菌、电渗析、脱色、离子交换和浓缩结晶，得柠檬酸。

对比例4：利用黑曲霉和好食脉孢菌发酵制备柠檬酸

（1）将好食脉孢菌种子液和黑曲霉种子液按照体积比1:5混合均匀后，得混合种子液，将混合种子液接种于柠檬酸发酵培养基中，柠檬酸发酵培养基与实施例1中柠檬酸发酵培养基相同，混合种子液的接种量为柠檬酸发酵培养基体积的18%，于37℃下进行发酵，发酵初始通气量为0.15v/（v·min），初始搅拌转速为200r/min，初始罐压为0.15MPa，初始溶氧量为100%，随着发酵进行，待溶氧量≤15%时，调节通气量和搅拌转速，控制溶氧量为15%-25%，待柠檬酸发酵培养基中还原糖为4g/L时，停止发酵，得柠檬酸发酵液；

（2）将步骤（1）制得的柠檬酸发酵液经膜除菌、电渗析、脱色、离子交换和浓缩结晶，得柠檬酸。

对比例5：利用黑曲霉和米曲霉发酵制备柠檬酸

（1）将米曲霉种子液、黑曲霉种子液按照体积比4:5混合均匀后，得混合种子液，将混合种子液接种于柠檬酸发酵培养基中，柠檬酸发酵培养基与实施例1中柠檬酸发酵培养基相同，混合种子液的接种量为柠檬酸发酵培养基体积的18%，于37℃下进行发酵，发酵初始通气量为0.15v/（v·min），初始搅拌转速为200r/min，初始罐压为0.15MPa，初始溶氧量为100%，随着发酵进行，待溶氧量≤15%时，调节通气量和搅拌转速，控制溶氧量为15%-25%，待柠檬酸发酵培养基中还原糖为4g/L时，停止发酵，得柠檬酸发酵液；

（2）将步骤（1）制得的柠檬酸发酵液经膜除菌、电渗析、脱色、离子交换和浓缩结晶，得柠檬酸。

试验例1

根据GB/T1987-2007标准检验实施例1-3和对比例1-5中的柠檬酸发酵液的浓度（即酸度），并计算柠檬酸的转化率，统计实施例1-3和对比例1-5中柠檬酸的发酵周期和产量，结果如表1所示。

其中，转化率（%）=[（柠檬酸发酵液的浓度×发酵液体积）/柠檬酸发酵液中总糖的重量]×100%；

柠檬酸的发酵周期为开始发酵到停止发酵的时间；

柠檬酸的产量为浓缩结晶后柠檬酸的质量与柠檬酸发酵液体积的比值。

实施例1-3与对比例1-5中采用的柠檬酸提纯条件完全一致。

表1 柠檬酸的酸度、转化率、发酵周期、产量值

由表1可以看出，对比例1-3分别为采用单一黑曲霉、米曲霉和好食脉孢菌进行发酵制备柠檬酸，柠檬酸的转化率为15.8-95.2%，发酵周期为61-142h，产量为12-168g/L，由此可见，采用单一菌种进行发酵时，柠檬酸的产量、转化率和发酵周期菌不理想。

现有多采用黑曲霉作为发酵菌种制备柠檬酸，对比例4-5均为采用双菌种进行发酵，其中一种为黑曲霉，由对比例4-5可以看出，在黑曲霉的基础上，分别加入米曲霉或好食脉孢菌，相较于单一菌种发酵，虽然可以缩短发酵周期，提高柠檬酸的转化率、产量和酸度，但其效果相较于本发明采用黑曲霉、米曲霉和好食脉孢菌三个菌种复配进行混合发酵还有一定差距。由此可见，本发明采用黑曲霉、米曲霉和好食脉孢菌协同发酵，能有效提高柠檬酸的产量、转化率，缩短发酵周期。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。