可裂解材料前驱体聚合物、可裂解材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物材料领域，尤其是涉及一种可裂解材料前驱体聚合物、可裂解材料及其制备方法。

背景技术

与传统的2D细胞培养相比，在水凝胶、多孔支架、微球等支架材料中进行3D细胞培养能更好地模拟体内环境。其中，水凝胶作为一种高含水材料，由于其与细胞外基质的结构相似性，已被广泛应用于药物载体、细胞培养、组织再生等领域。

理想的3D细胞载体是能够在培养完成后可被迅速瓦解的。然而，由于水凝胶降解的不可控性，在水凝胶中进行细胞3D培养、扩增后，如何快速瓦解凝胶并提取细胞是个亟待解决的难题。

文献：Sun M,Wong JY,Nugraha B,et al.Cleavable cellulosic sponge forfunctional hepatic cell culture and retrieval[J].Biomaterials,2019,201:16–32.介绍了一种基于羟丙基纤维素，先通过双硫键偶联的二羧酸对羟丙基纤维素进行羧基功能化，然后再利用羧基改性双键的材料。凝胶前驱体通过伽马射线辐照交联固化，冻干后形成可裂解的多孔海绵材料。该材料在合成过程中第一步羧基功能化时以羧基与聚合物上羟基进行酯化反应，反应效率较低且需要在有机溶剂中进行。后续材料的固化交联采用伽马射线辐照方式，材料制备方式复杂，无法满足水凝胶快速固化及原位细胞培养的需求。

发明内容

为解决以上现有技术的不足，本发明提出一种能够制备可裂解材料的前驱体聚合物，该前驱体聚合物溶液可通过光辐照进行原位固化，利用可裂解材料中的可裂解化学键，通过加入裂解试剂快速裂解材料，使材料中培养的细胞可轻松回收。

本发明同时提供一种由上述前驱体聚合物得到的可裂解材料。

本发明同时提供了一种上述前驱体聚合物或可裂解材料的制备方法。

为实现上述目的，提供的技术方案如下：

一种可裂解材料前驱体聚合物的制备方法，包括如下步骤：

1-1：对聚合物I进行官能团改性得到带有可裂解键的官能团改性聚合物；

1-2：对步骤1-1所制备的带有可裂解键的官能团改性聚合物进行双键改性得到带有可裂解键的双键改性聚合物。

作为优选，步骤1-1中，所述官能团改性为氨基改性。所述可裂解键为-S-S-。通过步骤1-1，实现对聚合物I进行氨基化改性得到双硫键偶联的氨基改性聚合物Polymer-ss-NH

作为优选，所述聚合物I为羧基官能团的亲水性聚合物；利用羧基官能团更容易实现所述的官能团改性。

作为优选，所述聚合物I可以选择本身带有羧基的聚合物；比如可以选择聚谷氨酸或其衍生物、聚丙烯酸或其衍生物、海藻酸或其衍生物、透明质酸或其衍生物等。所述聚合物I也可为其他聚合物的含羧基衍生物，比如可以选择壳聚糖的含羧基衍生物、明胶的含羧基衍生物、聚赖氨酸的含羧基衍生物、丝素蛋白的含羧基衍生物等中的一种或多种。作为进一步优选，所述聚合物I选自聚谷氨酸、聚丙烯酸、海藻酸、透明质酸及羧甲基壳聚糖等中的一种或多种。本发明对聚合物I的分子量要求不高，可根据实际需要选择合适的聚合物I。

步骤1-1所述对聚合物I的氨基化改性，其通过聚合物上羧基与二胺分子(二胺化合物)的氨基之间在偶联剂作用下发生酰胺化反应完成。作为优选，步骤1-1中，对聚合物I进行官能团改性的方法如下：在偶联剂作用下，所述聚合物I上羧基与带有可裂解键的二胺化合物的一个氨基进行酰胺化反应，得到表面带有氨基的官能团改性聚合物。

作为优选，步骤1-1所述对聚合物的氨基化改性所使用的可裂解键的二胺化合物为含有-S-S-的二胺化合物或者双硫键偶联的二胺化合物。作为进一步优选，所使用的双硫键偶联的二胺分子优选为胱胺或其衍生物。

作为优选，步骤1-1所述对聚合物的氨基化改性，可以在偶联剂作用下进行酰胺化反应，所使用的偶联剂为常见酰胺反应偶联剂，如1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀先亚胺(NHS)组合、NN’-羰基二咪唑(CDI)等，其中优选为EDC+NHS组合。

作为优选，所述酰胺化反应时采用的溶剂为水；当然也可以采用其他可溶解原料的溶剂。

作为优选，所述聚合物I(以羧基摩尔量计算)、偶联剂、二胺化合物的摩尔比为0.5～3:1:0.5～3。作为进一步优选，所述聚合物I(以羧基摩尔量计算)、偶联剂、二胺化合物的摩尔比为0.8～1:1:0.8～1.2。

作为优选，步骤1-1中所述对聚合物的氨基化改性，在水相溶剂中时，溶剂pH为4～6(可以酸碱调节剂调整得到，酸性调节剂一般可以采用稀盐酸、稀硫酸等；碱性调节剂可以采用氢氧化钠，碳酸钠，碳酸氢钠等)。

作为优选，步骤1-1中所述氨基化改性反应于25～50℃条件下反应18～30h；进一步优选为18～24小时。

作为优选，步骤1-1中所述氨基化改性反应结束后将反应液一去离子水透析除杂后冻干。

作为优选，步骤1-2中对所述步骤1-1所制备的Polymer-ss-NH

作为进一步优选，步骤1-2中，进行双键改性可采用下述方法之一：

(A)偶联剂作用下，所述带有可裂解键的官能团改性聚合物与含羧基烯烃化合物进行酰胺化反应，实现所述双键改性；

(B)所述带有可裂解键的官能团改性聚合物与含双键酰化试剂进行酰胺化反应，实现所述双键改性。

作为优选，步骤1-2对所述1-1所制备的Polymer-ss-NH

作为优选，步骤1-2对所述步骤1-1所制备的Polymer-ss-NH

作为优选，步骤1-2中对所述步骤1-1所制备的Polymer-ss-NH

作为优选，步骤1-2中对所述步骤1-1所制备的Polymer-ss-NH

作为优选，步骤1-2中，所述双键改性反应于25～50℃条件下反应1～18h；当使用含羧基烯烃进行双键改性时，进一步优选为4～8小时；当使用含双键酰化试剂进行双键改性时，进一步优选为0.5～2小时。

作为优选，步骤1-2中，所述双键化改性反应结束后将反应液以去离子水透析除杂后冻干，即可得到最终的产物Polymer-ss-ene。

一种可裂解材料前驱体聚合物，由上述任一项技术方案所述的制备方法制备得到。

一种可裂解材料，由上述任一项技术方案制备的可裂解材料前驱体聚合物在固化条件下固化得到；或者将固化后的产物进一步冻干后的得到。

作为优选，所述固化条件采用光固化。实际固化时，需要配合使用对应的光引发剂和光辐射条件。

所述可裂解材料可以为水凝胶材料，其可由可裂解材料前驱体聚合物在溶剂中，光引发剂存在下，光辐射得到；所述可裂解材料也可以是冻干水凝胶支架，可由对应的水凝胶经过冻干工艺得到。

作为优选，一种可裂解材料，包括如下步骤：

2-1：取可裂解材料前驱体聚合物Polymer-ss-ene、光引发剂溶解于去离子水、PBS溶液或细胞培养基溶液中。

2-2：以光源辐照步骤2-1所制备的水凝胶前驱体溶液使其固化成水凝胶。此时可以得到所述水凝胶产品。

2-3：将步骤2-2中制备的水凝胶在0℃以下环境中冷冻。

2-4：将步骤2-3所制备的冷冻水凝胶置于冷冻干燥剂中冻干。

2-5：将步骤2-4所制得的冻干水凝胶切割成片状冻干水凝胶支架。此时可以得到所述冻干水凝胶支架材料。

作为优选，步骤2-1中，所述可裂解材料前驱体聚合物Polymer-ss-ene与溶剂(离子水、PBS溶液或细胞培养基溶液)的质量比为0.5～10:100。

步骤2-1中，作为优选，所述光引发剂为2-羟基-4-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(I2959)、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(LAP)中的一种或多种，优选为LAP。

作为优选，步骤2-1中，所述光引发剂与溶剂质量比为0.1～1:100，进一步优选为0.2～0.5:100；更进一步优选为0.25:100。

作为优选，步骤2-2中，所述辐照光源其波长为365～450nm，进一步优选400～420nm；更进一步优选为405nm。

作为优选，步骤2-3中，所述冷冻温度为-5～-200℃，进一步优选为-10～-50℃；更进一步优选为-20℃。

使用水凝胶作为生物应用载体时，可在步骤2-2之前对水凝胶前驱体溶液以过滤等方式进行除菌处理。

使用水凝胶冻干支架作为生物应用载体时，可在步骤2-5之后对制备的片状冻干水凝胶支架进行例如紫外辐照或伽马射线辐照等方式进行除菌处理。

使用本发明得到的可裂解材料可以在对应的裂解条件下实现快速裂解，以水凝胶或者冻干水凝胶支架为例，水凝胶及冻干多孔支架的裂解过程如下：

3-1再完成生物应用以后，将水凝胶或其冻干支架载体浸泡于含有裂解试剂的PBS缓冲液中，静置或于摇床上放置一段时间即可实现水凝胶或其支架的完全瓦解。

作为优选，步骤3-1中，所述裂解试剂，其可为谷胱甘肽(GSH)、二硫苏糖醇(DTT)、β-硫基乙醇(β-ME)、三羟甲基氨基甲烷磷化氢(TCEP)中的一种或多种。

作为优选，步骤3-1中，所述裂解试剂，其在PBS缓冲液中的摩尔浓度为5～50mM。

本发明所制备的可裂解材料前驱体聚合物是通过在前驱体高分子上引入可裂解化学键偶联的烯烃官能团，赋予前驱体材料光固化性能和可控裂解性能。本发明所制备可裂解材料包括水凝胶及其冻干多孔支架，该可裂解材料在裂解试剂作用下快速裂解为溶液。本发明所制备可裂解材料在细胞培养及组织工程领域有广阔应用前景。

附图说明

图1为可裂解材料前驱体聚合物合成过程示意图；

图2为可裂解材料固化、裂解过程示意图；

图3为实施例1所制备水凝胶及其冻干支架裂解过程数码照片；

图4为冻干支架SEM图片。

具体实施方式

为了使得本发明更容易理解，本发明结合下面附图和实施例对本发明做进一步说明：

实施例1：参见图1和图2

1.可裂解前驱体聚合物制备：

1)取初始聚合物聚丙烯酸0.5g(6.579mmol以-COOH计)(聚丙烯酸平均分子量Mw～4,000,000)，溶解于100mL去离子水中，制备0.5％(w/v)水溶液；

2)加入胱胺二盐酸盐1.482g(6.579mmol)溶解充分，随后以0.1M氢氧化钠调节pH为4～6；

3)依次加入NHS 0.757g(6.579mmol)和EDC.HCl 1.261g(6.579mmol)充分溶解；

4)室温搅拌反应24h；

5)以去离子水透析反应液2天；

6)冻干得Polymer-ss-NH

7)取上述冻干产物Polymer-ss-NH

8)加入甲基丙烯酸0.05g(0.58mmol)充分溶解

9)依次加入与甲基丙烯酸等摩尔的NHS 0.067g(0.58mmol)和EDC.HCl 0.111g(0.58mmol)充分溶解；

10)室温搅拌反应5h。

11)以去离子水透析反应液2天；

12)冻干得Polymer-ss-ene。

2.可裂解水凝胶及其冻干支架制备

1)取上述制备的前驱体聚合物Polymer-ss-ene 0.1g以及LAP 0.025g加入到10mLPBS缓冲液中，避光溶解，制备水凝胶前驱体溶液(Polymer-ss-ene浓度为1％w/w)。

2)取适当上述前驱体溶液，加入直径为8mm，高度为4mm的圆柱型模具中，使用405nm蓝光辐照30s使固化为水凝胶。

3)将上述水凝胶于-20℃中冷冻3h，随后将冷冻样品移入冻干机冻干。

4)切去冻干水凝胶上下表面，得到高度约2mm的圆柱状多孔冻干凝胶支架片，图4为冻干支架SEM照片。

3.水凝胶及其冻干支架的裂解

取按照上述制备方法分别制备的水凝胶及冻干支架片置于24孔板中，加入1mL裂解试剂的PBS溶液。裂解试剂为DTT，浓度为25mM。室温条件下观察水凝胶及其支架裂解情况，不含试剂的PBS溶液作为对照组。结果见图3和表2。

实施例2～9主要步骤与实施例1相同，只是一些实验参数有所改变，具体实验参数见表1

表1.实施例2～9参数列表

表2.实施例1～9所制备水凝胶及其冻干支架完全裂解所需时间

按照表1参数以及实施例1中提供的方法实现对实施例2～10中可裂解前驱体聚合物的制备、可裂解水凝胶及其冻干支架制备，同时按照实施例1中提供的步骤，进行水凝胶及其冻干支架完全裂解时间检测。结果见表2，由表2可知，采用本发明方法制备得到的可裂解材料均能够实现快速的裂解，特别是得到的冻干凝胶支架裂解时间均在半小时以内。

实施例10

1.可裂解前驱体聚合物制备：

1)取初始聚合物透明质酸0.5g(2.381mmol以-COOH计)，溶解于100mL去离子水中，制备0.5％(w/w)水溶液；

2)加入胱胺二盐酸盐0.536g(2.381mmol)溶解充分，随后以0.1M氢氧化钠调节pH为4～6；

3)依次加入NHS 0.548g(4.762mmol)和EDC.HCl 0.912g(4.762mmol)充分溶解；

4)室温搅拌反应18h；

5)以去离子水透析反应液2天；

6)冻干得Polymer-ss-NH

7)取上述冻干产物Polymer-ss-NH

8)加入甲基丙烯酸酐0.05g(0.58mmol)充分溶解

9)室温搅拌反应1h。

10)以去离子水透析反应液2天；

11)冻干得Polymer-ss-ene。

2.可裂解水凝胶及其冻干支架制备

1)取上述制备的前驱体聚合物Polymer-ss-ene 0.1g以及LAP 0.025g加入到10mLPBS缓冲液中，避光溶解，制备水凝胶前驱体溶液。

2)取适当上述前驱体溶液，加入直径为8mm，高度为4mm的圆柱形模具中，使用405nm蓝光辐照30s使固化为水凝胶。

3)将上述水凝胶于-20℃中冷冻3h，随后将冷冻样品移入冻干机冻干。

4)用切去冻干水凝胶上下表面，得到高度约2mm的圆柱状多孔冻干凝胶支架片。

3.水凝胶及其冻干支架的裂解

取按照上述方法制备的水凝胶及冻干支架片置于24孔板中，加入1mL裂解试剂的PBS溶液。裂解试剂为DTT，浓度为25mM。室温静置，观察水凝胶及其支架裂解情况。

表3.实施例2～9参数列表

表4.实施例10～16所制备水凝胶及其冻干多孔支架完全裂解所需时间

按照表3参数以及实施例10中提供的方法实现对实施例11～16中可裂解前驱体聚合物的制备、可裂解水凝胶及其冻干支架制备，同时按照实施例10中提供的步骤，进行水凝胶及其冻干支架完全裂解时间检测。结果见表4，由表4可知，采用本发明方法制备得到的可裂解材料均能够实现快速的裂解，特别是得到的冻干凝胶支架裂解时间均在半小时以内。同时，可以看出采用酰基化试剂进行双键改性，反应时间快，且水凝胶或冻干支架的裂解速度也较快。