一种超声辅助生物酶法制备破壁蜂花粉的方法

(一)技术领域

本发明涉及一种超声辅助生物酶法制备破壁蜂花粉的方法。

(二)背景技术

蜂花粉是蜜蜂将采集的花粉球与花蜜、自身腺体分泌物和唾液混合形成的不规则扁圆形的球状体颗粒物。蜂花粉因其含有丰富的营养物质，例如蛋白质、脂肪酸、碳水化合物、氨基酸、矿物质、维生素以及多酚类物质等，因而被誉为“唯一完美的食物”。我国是世界最大的蜂产品生产和出口国，蜂花粉产量较大，出口总量呈每年递增状态。此外，我国地域辽阔，自然条件丰富，蜂源植物种类繁多，分布范围广，全年均有花开，加之每个蜂群每年可产3-30公斤花粉，我国约有700万群蜜蜂，每年可产生蜂花粉约21万吨，是一种来源丰富的资源。随着人们生活水平的提高，人们保健意识的加强，对蜂花粉的需求也会日益增加，因此，蜂花粉营养组分及应用的研究，将加速蜂花粉的高效利用和综合开发。

蜂花粉中营养物质含量丰富，但是由于蜂花粉壁的存在，不仅阻碍了人体对蜂花粉活性成分消化吸收，同时也阻止了蜂花粉的高值化利用。蜂花粉破壁是指蜂花粉受到外界损伤，其结构遭到一定程度的破坏，使其含有的营养物质释放出来。蜂花粉破壁通常有三种形式：花粉壁自萌发孔处破裂；花粉壁其他地方破裂；花粉壁完全粉碎。通常认为，蜂花粉的结构被完全粉碎，其营养物质才能被充分释放，从而发挥最大的营养价值。

目前，蜂花粉的破壁方法主要有物理法，化学法，生物法和复合法。目前，现有的单一破壁技术有一定局限性，存在着工艺复杂、生产成本高、破壁效果低，或者严重损害营养成分等缺点。如超声破壁法的超声时间过长，会破坏蜂花粉中养成分水溶性营养成分；生物酶解法技术处理的蜂花粉破壁率较低，且发酵时间较长。因此，本发明将针对当前蜂花粉单一破壁技术破坏过度和破坏不足的问题，拟将生物酶解法辅以超声破壁法，从而克服某种单一工艺的负面影响，达到良好的破壁效果的同时，能有效的保护蜂花粉中的营养成分。

(三)发明内容

基于上述问题，本发明提供了一种超声辅助生物酶法制备破壁蜂花粉的方法，实现了蜂花粉快速高效破壁，且蜂花粉营养成分损失少的蜂花粉的综合破壁处理。

本发明采用的技术方案是：

一种超声辅助生物酶法制备破壁蜂花粉的方法，所述方法包括：

(1)将蜂花粉颗粒进行机械破壁处理，得到蜂花粉粉末；

(2)将步骤(1)得到蜂花粉粉末与蒸馏水按料液质量比1:10～1:30 混合，调节pH值至6.0±0.5，得到悬浮液；采用氢氧化钠或盐酸调节pH值；

(3)将所述步骤(2)所得悬浮液进行于30～50℃下超声处理5～30min，得到超声处理悬浮液；超声功率为600～800W，超声的频率为 50～80kHz；

(4)向所述步骤(3)所得超声悬浮液中分步加入果胶酶、木瓜蛋白酶和纤维素酶，摇匀后于40～70℃、pH 3～8条件下酶解10～20h，得酶解物；各酶添加量为花粉质量的1％～10％；

(5)步骤(5)所得酶解物在-80～-70℃温度下预冻18～20h，再在-60～-40℃、180～220mTorr压力条件下真空冷冻干燥70～75h，得所述破壁蜂花粉。

优选的，步骤(3)超声处理的条件为：超声功率为800W，超声频率为80kHz，超声温度为30℃，超声时间为15min。

优选的，步骤(4)中果胶酶的添加量为5％，木瓜蛋白酶添加量为 10％，纤维素酶添加量为8％。

更为优选的，步骤(4)中先加入果胶酶，酶解温度为45℃，酶解pH 5.0，酶解时间为6h；然后加入木瓜蛋白酶，酶解温度为55℃，酶解pH 5.0，酶解时间为6h；最后加入纤维素酶，酶解温度为50℃，酶解pH 6.0，酶解时间为6h。

本发明的有益效果主要体现在：本发明采用超声辅助生物酶法对蜂花粉进行破壁处理，一方面通过条件温和的生物酶法改善破壁处理中对蜂花粉的过度破坏，减少蜂花粉中的营养成分流失，提高蜂花粉营养价值和产品品质；另一方面，在保证蜂花粉营养成分的前提下，辅以超声法对蜂花粉进行破壁处理，提高了蜂花粉的破壁效率，有助于营养成分的充分释放；该方法天然、安全、效果好，将进一步促进蜂资源的综合利用。

(四)附图说明

图1为蜂花粉破壁形态电镜图:其中a为破壁前的油菜蜂花粉电镜图， b为破壁后的油菜蜂花粉电镜图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

下面实施例中，蜂花粉的破壁率按镜检法计算，即破壁率％＝破壁花粉数/视野中总花粉数×100％

下面实施例中，所用纤维素酶(活力10000U/g)购于上海麦克林有限公司，木瓜蛋白酶(活力10000U/g)购买于上海揩洋生物技术有限公司，果胶酶(活力10000U/g)购买于国药集团化学试剂有限公司。

实施例1～5：不同超声时间对蜂花粉的破壁效果的影响

取5g机械破壁后的蜂花粉于250mL烧杯中，以料液比1:20添加蒸馏水，混匀后进行超声处理。超声温度40℃，超声功率为800W，超声的频率为80kHz，超声时间分别为5、10、15、20、25min，分别计算蜂花粉破壁率，结果列于表1。

表1：不同超声时间对蜂花粉破壁率的影响

实施例6～8：不同超声温度对蜂花粉的破壁效果的影响

取5g破壁蜂花粉于250mL烧杯中，以料液比1:20添加蒸馏水，混匀后进行超声处理。超声时间15min，超声功率为800W，超声的频率为 80kHz，超声温度为30℃、40℃、50℃，分别计算蜂花粉破壁率，结果列于表2。

表2：不同超声时间对蜂花粉破壁率的影响

实施例9～11：不同料液比对蜂花粉的破壁效果的影响

取5g破壁蜂花粉于250mL烧杯中，料液比分别为1:10、1:15、1:20、1:25、1:30。超声功率为800W，超声的频率为80kHz，超声时间15min，超声温度为30℃。分别比较不同的料液比对蜂花粉破壁效果的影响。三种酶的酶解条件如下：果胶酶的添加量为5％，酶解温度为45℃，酶解 pH 5.0，酶解时间为4h；木瓜蛋白酶添加量为5％，酶解温度为57℃，酶解时间为4h，酶解pH 6.0；纤维素酶添加量为5％，酶解温度为50℃，酶解时间为4h，酶解pH 5.0；分别计算蜂花粉破壁率，结果列于表3。

表3：不同料液比对蜂花粉破壁率的影响

实施例12～14：不同酶酶解pH对蜂花粉的破壁效果的影响

取5g破壁蜂花粉于250mL烧杯中，料液比为1:20，超声功率为 800W，超声的频率为80kHz，超声时间15min，超声温度为30℃。分别比较不同的酶的酶解pH对蜂花粉破壁效果的影响。果胶酶的添加量为 5％，酶解温度为45℃，酶解时间为4h，分别在不同酶解pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0；木瓜蛋白酶添加量为5％，酶解温度为57℃，酶解时间为 4h，分别在不同酶解pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0；纤维素酶添加量为5％，酶解温度为50℃，酶解时间为4h，分别在不同酶解pH 4.0、5.0、6.0、7.0、 8.0；分别计算蜂花粉破壁率，结果列于表4。

表4：不同酶酶解pH对蜂花粉破壁率的影响

实施例15～17：不同酶酶解时间对蜂花粉的破壁效果的影响

取5g破壁蜂花粉于250mL烧杯中，料液比为1:20，超声功率为800 W，超声的频率为80kHz，超声时间15min，超声温度为30℃。分别比较不同的酶的酶解时间对蜂花粉破壁效果的影响。果胶酶的添加量为5％，酶解温度为45℃，酶解pH为5，分别在不同酶解时间2.0h、4.0h、6.0 h、8.0h、10.0h；木瓜蛋白酶添加量为5％，酶解温度为57℃，酶解pH 为6，分别在不同酶解时间2.0h、4.0h、6.0h、8.0h、10.0h；纤维素酶添加量为5％，酶解温度为50℃，酶解pH为5，分别在不同酶解时间2.0 h、4.0h、6.0h、8.0h、10.0h；分别计算蜂花粉破壁率，结果列于表5。

表5：不同酶酶解时间对蜂花粉破壁率的影响

实施例18～20：不同酶酶解温度对蜂花粉的破壁效果的影响

取5g破壁蜂花粉于250mL烧杯中，料液比为1:20，超声功率为800 W，超声的频率为80kHz，超声时间15min，超声温度为30℃。分别比较不同的酶的酶解温度对蜂花粉破壁效果的影响。果胶酶的添加量为5％，酶解时间为6h，酶解pH 5.0，酶解温度为25℃、35℃、45℃、55℃、 65℃；木瓜蛋白酶添加量为5％，酶解时间为6h，酶解pH 6.0，酶解温度为35℃、45℃、55℃、65℃、75℃；纤维素酶添加量为5％，酶解时间为6h，酶解pH 5.0，酶解温度为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃；分别计算蜂花粉破壁率，结果列于表6。

表6：不同酶酶解温度对蜂花粉破壁率的影响

实施例21～23：不同酶的添加量对蜂花粉的破壁效果的影响

取5g破壁蜂花粉于250mL烧杯中，料液比为1:20，超声功率为800W，超声的频率为80kHz，超声时间15min，超声温度为30℃。分别比较不同的酶的添加量对蜂花粉破壁效果的影响。果胶酶的添加量为1％、5％、8％、10％、15％，酶解温度为45℃，酶解时间为6h，酶解pH5.0；木瓜蛋白酶添加量为1％、5％、8％、10％、15％，酶解温度为57℃，酶解时间为6h，酶解pH6.0；纤维素酶添加量为1％、5％、8％、10％、15％，酶解温度为50℃，酶解时间为4h，酶解pH 6.0；分别计算蜂花粉破壁率，结果列于表7。

表7：不同酶的添加量对蜂花粉破壁率的影响

实施例24～25：酶的添加方式对蜂花粉的破壁效果的影响

取5g破壁蜂花粉于250mL烧杯中，料液比为1:20，超声功率为800 W，超声的频率为80kHz，超声时间15min，超声温度为30℃。分别比较不同的酶的添加量对蜂花粉破壁效果的影响。三种酶同步添加的方式如下：果胶酶、木瓜蛋白酶和纤维素酶的添加量分别为5％，酶解温度为45 ℃，酶解时间为6h，酶解pH为5，酶解后计算蜂花粉破壁率；分步添加的方式如下：果胶酶的添加量为5％，酶解温度为45℃，酶解时间为6h，酶解pH 5.0；木瓜蛋白酶添加量为10％，酶解温度为55℃，酶解时间为 6h，分别酶解pH 5.0；纤维素酶添加量为8％，酶解温度为50℃，酶解时间为6h，酶解pH 6.0；分别计算蜂花粉破壁率，结果列于表8。

表8：酶的添加方式对蜂花粉的破壁效果的影响

实施例26：蜂花粉破壁处理前后主要有效成分分析

破壁前后各有效成分分析如表9所示。在破壁前，蜂花粉中的总酚含量为4.41±0.23g/100g，总黄酮含量为28.57±2.33g/100g，粗蛋白含量在 18.5±2.3g/100g，总糖(以还原糖计)含量为6.7±1.2g/100g，游离氨基酸含量为0.735±0.02g/100g，经超声辅助生物酶法破壁后，总酚含量为 7.26±0.33g/100g，总黄酮含量为49.48±4.37g/100g，蛋白含量为26.3±3.1 g/100g，粗脂肪含量为34.8±2.6g/100g，总糖(以还原糖计)为47.8±3.6g/100g，游离氨基酸增加至0.89±0.05g/100g。

表9：破壁前后蜂花粉主要有效成分分析