一种Fmoc-Pbf-精氨酸有关物质的检测方法

技术领域

本发明涉及多肽领域，具体涉及一种Fmoc-Pbf-精氨酸有关物质的检测方法。

背景技术

芴甲氧羰酰-精氨酸(PBF)，Fmoc-Arg(pbf)-OH，又名Fmoc-Pbf-精氨酸、N-芴甲氧羰酰基-2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰-L-精氨酸、Nα-FMOC-Nω-PBF-L-精氨酸或Fmoc-保护基精氨酸，其结构如下所示：

精氨酸是人体必需的氨基酸之一，是合成多肽的重要原料。由于精氨酸呈碱性及含有多个官能团，使得研究其性质及对多肽合成时不能直接使用，必须对其氨基和侧链胍基进行有效的保护，而pbf对酸最敏感，在TFA/H

公开号为CN109115899A的中国发明专利公开了一种Fmoc氨基酸的分析方法，但其没有提到有关物质，申请人重复了其使用的方法，发现其对主要杂质的分离度也不够理想。

醋酸酸性较三氟乙酸弱，且三氟乙酸一般禁用于质谱分析，因为三氟乙酸根信号很强，会掩盖几乎所有的负离子，甚至污染质量分析器。现有的方法是用三氟乙酸体系测Fmoc-Arg(pbf)-OH有关物质，TFA起到类似离子对的作用，一般浓度在0.05-0.1％，过高的浓度，会使溶液偏酸，长时间使用可能影响色谱柱寿命。本发明用醋酸体系和三氟乙酸体系也做了对比，结论醋酸体系对检测Fmoc-Arg(pbf)-OH有关物质在分离度，以及保护色谱柱方面更有优势。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种操作方便快捷、结果准确的Fmoc-Pbf-精氨酸有关物质检测方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种Fmoc-Pbf-精氨酸有关物质检测方法，参数条件如下：

检测波长为220nm，所用流动相为乙腈和水，加醋酸，梯度变化中乙腈体积含量为50～85～50％，水的体积含量为50～15～50％。

优选的，所述有关物质检测方法中色谱柱可以选自固定相为十八烷基硅烷的色谱柱；具体的，可以选用ZORBAX ODS 4.6mmx250mm 5μKromasil 100A C18 5u 250*4.6mm，SinoChrom ODS-BP 5μ4.6mmx250mm，Symmetry Shield RP18 5um 4.6*250mm,SynergiMAX-RP 4.6mmx250mm 5μ的C

优选的，所述有关物质检测方法中柱温为20～30℃，流动相流速为0.8～1.2ml/min。

进一步的，所述有关物质检测方法中柱温为25℃，流动相流速为1ml/min。

优选的，所述有关物质检测方法中直接采用流动相溶解样品，进样浓度为0.25～0.75mg/ml。

优选的，所述有关物质检测方法中不使用对照品溶液，而直接采用面积归一化法计算Fmoc-Pbf-精氨酸的纯度。

优选的，所述有关物质检测方法中流动相中醋酸的添加量为0.1％(体积比)。

优选的，有关物质检测方法中洗脱梯度变化为：

表1

本发明中化合物的中文命名与结构式有冲突的，以结构式为准；结构式有明显错误的除外。

本发明提供的Fmoc-Pbf-精氨酸有关物质检测方法，检测速度较快，结果准确，杂质分离度好，方法步骤简单，便于操作，具有广阔的应用前景。

说明书附图

图1是本发明具体实施方式提供的Fmoc-Pbf-精氨酸的高效液相色谱图；

图2是本发明具体实施方式提供的空白溶液的高效液相色谱图；

图3是本发明具体实施方式提供的杂质Fmoc-Arg-OH的的高效液相色谱图；

图4是本发明具体实施方式提供的杂质Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH的高效液相色谱图；

图5是本发明具体实施方式提供的杂质Fmoc-β-Ala-Arg(pbf)-OH的高效液相色谱图；

图6是本发明具体实施方式提供的杂质Fmoc-β-Ala-OH的高效液相色谱图；

图7是本发明具体实施方式提供的所有混合物的混合溶液的高效液相色谱图(三氟乙酸体系)；

图8是本发明具体实施方式提供的所有混合物的混合溶液的高效液相色谱图(醋酸体系)。

具体实施方式

以下结合实例说明本发明，但不限制本发明。在本领域内，技术人员对本发明所做的简单替换或改进均属于本发明所保护的技术方案内。

实施例1

色谱条件采用：

检测波长：220nm，柱温：25℃，进样量：10μl

流动相：A:100％H2O加0.1％TFA B:100％ACN加0.1％TFA

梯度B相变化0min 50％～20min 100％～25min 100％～26min 50％～32min50％～32min Stop

步骤一：将Fmoc-Arg(pbf)-OH和各杂质对照品Fmoc-Arg-OH，Fmoc-β-Ala-OH，Fmoc-β-Ala-Arg(pbf)-OH分，Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH别溶于乙腈中，得到浓度分别为0.5mg/ml的样品溶液和杂质对照品溶液，以乙腈为空白溶液。

步骤二：吸取Fmoc-Arg(pbf)-OH溶液1ml，各杂质对照品溶液各1ml，形成混合溶液。

步骤三：采用ZORBAX ODS 4.6mmx250mm 5μ，设柱温35℃，波长220nm，梯度洗脱过程如表2所示：

表2

步骤四：进样顺序及进样量，先进步骤二的混合溶液10ul，然后再分别进每种单个杂质对照品溶液10ul，以便确定混合溶液出峰中对应的杂质出峰时间；

步骤五：进以乙腈为空白溶液1针，然后进Fmoc-Arg(pbf)-OH,通过面积归一法积分，得到纯度。

分别注入芴甲氧羰酰-精氨酸(PBF)即Fmoc-Arg(pbf)-OH溶液、空白溶液(流动相)，杂质Fmoc-Arg-OH溶液，杂质Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH溶液，杂质Fmoc-β-Ala-Arg(pbf)-OH溶液，杂质Fmoc-β-Ala-OH溶液，以及所有混合物的混合溶液，Fmoc-Arg(pbf)-OH的保留时间约为10.5min左右(如图1)，空白溶液(如图2)，杂质Fmoc-Arg-OH的保留时间约为5.7min左右(如图3)，杂质Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH的保留时间约为13.3min左右(如图4)，杂质Fmoc-β-Ala-Arg(pbf)-OH的保留时间约为9.7min左右(如图5)，杂质Fmoc-β-Ala-OH的保留时间约为6.7min左右(如图6)。所有混合物的混合溶液出峰情况(如图7)，本方法能够很好的分离芴甲氧羰酰-精氨酸(PBF)即Fmoc-Arg(pbf)-OH及其有关物质，从而有效的控制Fmoc-Arg(pbf)-OH的质量。

表3分离度

表4相对保留时间

实施例2

色谱条件采用：

检测波长：220nm，柱温：35℃，进样量：10μl

流动相：A:100％H

梯度B相变化0min 50％～20min 85％～22min 85％～24min 50％～26min 50％Stop

步骤一：将Fmoc-Arg(pbf)-OH和各杂质对照品Fmoc-Arg-OH，Fmoc-β-Ala-OH，Fmoc-β-Ala-Arg(pbf)-OH分，Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH别溶于乙腈中，得到浓度分别为0.5mg/ml的样品溶液和杂质对照品溶液，以乙腈为空白溶液。

步骤二：吸取Fmoc-Arg(pbf)-OH溶液1ml，各杂质对照品溶液各1ml，形成混合溶液。

步骤三：采用Synergi MAX-RP 4.6mmx250mm 5μ的C

表5

步骤四：进样顺序及进样量，先进步骤二的混合溶液10ul，然后再分别进每种单个杂质对照品溶液10ul，以便确定混合溶液出峰中对应的杂质出峰时间。

步骤五：进以乙腈为空白溶液1针，然后进Fmoc-Arg(pbf)-OH,通过面积归一法积分，得到纯度。

进混合溶液(如图8)，醋酸体系较三氟乙酸体系分离度更高，峰型也不受影响。Fmoc-Arg-OH(2.0min左右)，Fmoc-β-Ala-OH(6.8min左右)，Fmoc-β-Ala--Arg(pbf)-OH(12.1min左右)，Fmoc-Arg(pbf)-OH(13.5min左右)，Fmoc-Arg(pbf)-arg(pbf)-OH(18.9min左右)

表6分离度

表7相对保留时间

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。