镂空核壳结构纳米磁性微球、其制备方法及应用

技术领域

本公开涉及有机材料和分析技术领域，尤其涉及一种镂空核壳结构纳米磁性微球、其制备方法及应用。

背景技术

纳米磁性材料是近年来发展的一种新材料，被广泛应用于核磁成像、催化、传感及富集材料等领域。

然而在功能化磁性纳米微球的过程中存在三个方面的问题，(1)分散性的损失，即小的纳米粒子易于聚集形成大的粒子以降低表面能量；(2)磁性的丢失，即裸磁性纳米微球，特别是Fe

发明内容

有鉴于此，本公开的目的在于提出一种镂空核壳结构纳米磁性微球、其制备方法及应用。

基于上述目的，本公开实施例提供了一种镂空核壳结构纳米磁性微球的制备方法，包括：

提供Fe

将Fe

将Fe

将Fe

将Fe

将羧酸改性的Fe

在一些实施例中，所述Fe

在一些实施例中，所述反应得到镂空核壳结构的Fe

将Fe

依次加入十六烷基三甲基溴化铵、硅酸四乙酯和氨水，反应2～6小时；依次采用水和乙醇分别清洗反应所得产物2～3次，得到核壳结构的Fe

将Fe

在一些实施例中，所述得到Fe

在一些实施例中，所述得到胺基改性的Fe

在一些实施例中，所述得到羧酸改性的Fe

在一些实施例中，所述得到羧酸改性的Fe

在一些实施例中，所述得到Fe

本公开实施例还提供一种镂空核壳结构纳米磁性微球，所述镂空核壳结构纳米磁性微球通过如前技术方案任意一项所述的制备方法制成。

本公开提供了上述技术方案任意一项所述的镂空核壳结构纳米磁性微球的制备方法或上述技术方案所述的制备方法制备得到的镂空核壳结构纳米磁性微球在痕量磷酸化多肽特异性富集或纯化中的应用。

从上面所述可以看出，本公开提供的镂空核壳结构纳米磁性微球的制备方法，通过提供Fe

附图说明

为了更清楚地说明本公开或相关技术中的技术方案，下面将对实施例或相关技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本公开实施例的镂空核壳结构纳米磁性微球的制备方法的流程示意图；

图2为本公开实施例的镂空核壳结构纳米磁性微球的制备过程中的结构图；

图3是实施例1中镂空-核壳结构纳米磁性微球的制备过程中的电镜图；(a)为Fe

图4是实施例1中镂空-核壳结构纳米磁性微球的制备过程中的近红外表征结果图。

图5是实施例2中LC-MS/MS检测使用Fe

图6a是对比例1中核壳结构纳米磁性微球Fe

图7为图6(a)与图3(b)的对比图。

具体实施方式

为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本公开进一步详细说明。

需要说明的是，除非另外定义，本公开实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本公开实施例中使用的“第一”、“第二”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性，而只是用来区分不同的组成部分。“包括”或者“包含”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。“连接”或者“相连”等类似的词语并非限定于物理的或者机械的连接，而是可以包括电性的连接，不管是直接的还是间接的。

蛋白质磷酸化在细胞生命活动中起到重要的作用，参与基因转录调节，细胞增殖、发育、分化，细胞凋亡，神经信号转导等方面。在细胞内，约有30％的蛋白质在体内可以发生磷酸化修饰，其中丝氨酸磷酸化、苏氨酸磷酸化、络氨酸磷酸化的比例为1800：200：1。研究不同生理条件下和疾病发生过程中蛋白质的磷酸化修饰位点和变化规律，有助于了解蛋白质参与体内调控机制和疾病诊断及治疗。

随着质谱灵敏度和分辨率的不断提高，液质联用技术已在高通量磷酸化蛋白分析中占主导地位。但是在质谱分析前需要对磷酸化蛋白进行富集，提高磷酸化蛋白的相对丰度，减少非磷酸化蛋白的影响。目前，磷酸化蛋白富集存在无法富集未知磷酸化位点多肽和对磷酸化肽段的选择性不够好等问题。

申请人提出一种具有高分散性、高比表面的镂空-核壳结构磁性纳米微球，并优化了该纳米微球的制备过程，提高了其在复杂样品中富集磷酸化多肽的效率和特异性，以满足大规模磷酸化多肽的富集方法的需求。

如图1所示，本公开实施例提供一种镂空核壳结构纳米磁性微球的制备方法，包括：

S100，提供Fe

S200，将Fe

S300，将Fe

S400，将Fe

S500，将Fe

S600，将羧酸改性的Fe

在一些实施例中，步骤S100中，所述Fe

其中，提供Fe

S110,将三氯化铁超声分散在柠檬酸钠、无水醋酸钠和乙二醇的混合溶液中，加热溶解三氯化铁；

S120,180-220℃反应8-16小时；

S130,反应所得产物依次用水和乙醇清洗，每次清洗2～3次，得到颗粒均匀的磁性纳米Fe

其中，步骤S110中，三氯化铁的用量为0.2～0.3M。在混合溶液中，柠檬酸钠、无水醋酸钠和乙二醇三种物质的质量比为1：60-100：360-450。将此混合溶液油浴加热溶解三氯化铁。

步骤S120中，可以在高压釜中进行。具体可以通过将步骤S110所得反应溶液转移至高压釜中。

步骤S130中，清洗时，水和乙醇的用量可以均为15-30ml。

在一些实施例中，步骤S200中，反应得到镂空核壳结构的Fe

S210,将Fe

S220,依次加入十六烷基三甲基溴化铵、硅酸四乙酯和氨水，反应2～6小时；

S230,清洗反应所得产物2～3次，得到核壳结构的Fe

S240,将Fe

其中，步骤S210中，乙醇具体为乙醇的水溶液。其中，乙醇的体积分数为50～70％。

步骤S220中，氨水可以提供碱性环境。具体可以在加入硅酸四乙酯之后再加入氨水。十六烷基三甲基溴化铵、硅酸四乙酯和氨水可以在机械搅拌的条件下依次加入。所述十六烷基三甲基溴化铵和硅酸四乙酯的质量比为1：1～1:3。反应条件为常温。

步骤S230中，反应所得产物，可以依次用水和乙醇，分别清洗2～3次，以去除核壳结构的Fe

步骤S240中，乙醇或丙酮的体积可以为50～80ml。回流次数可以为一次或两次，每次回流的时长可以为10小时。

通过在步骤S200中，在Fe

在一些实施例中，步骤S300中，乙醇具体可以为50～80ml的乙醇水溶液。其中，乙醇的体积分数为45～75％。碱性环境，可以由氨水提供。可以通过在分散有Fe

较佳地，反应结束后，依次采用20ml的水和乙醇，清洗一次，得到Fe

在一些实施例中，步骤S400中，所述得到胺基改性的Fe

较佳地，反应结束后，依次采用20ml的水和乙醇，分别清洗两次，得到Fe

在一些实施例中，步骤S500中，2,4-环氧六环或四氢呋喃的浓度为2.5-10mg/ml。N,N-碳酰二咪唑与硅酸四乙酯的摩尔比为1：1至4：1，Fe

所述碱性缓冲溶液的pH为9-11，所述Nα,Nα-二(羧甲基)-L-赖氨酸与所述硅酸四乙酯的摩尔比1.2：1-2：1，所述Fe

在该步骤中，N,N-碳酰二咪唑作为偶联剂，能够将Fe

在一些实施例中，步骤S600中，所述三氯化铁溶液为三氯化铁的乙酸溶液，所述三氯化铁的摩尔量为0.8-1.2M。具体可以将Fe

本公开实施例的镂空核壳结构纳米磁性微球的制备方法，通过制备镂空核壳结构的Fe

以下通过具体实施例，参阅图2，对镂空核壳结构纳米磁性微球的制备进行详细的阐述。

实施例1镂空核壳结构纳米磁性微球的制备

1、将0.2M三氯化铁超声分散在40ml的柠檬酸钠、无水醋酸钠和乙二醇混合溶液中，混合液中三种物质的质量比为1：80：400，将此混合溶液油浴加热溶解后，将反应溶液至高压釜,200℃反应10小时，反应结束后，将产物依次用20ml水和乙醇各清洗3次，获得颗粒均匀的Fe

2、将步骤1获得的Fe

3、将步骤2获得的Fe

4、将步骤3获得的Fe

5、将步骤4获得的Fe

6、将步骤5获得的Fe

对比例1

与实施例1的区别，在于，将步骤2中Fe

分别对实施例1，对比例1中步骤2制备所得产物进行电镜扫描。其中，实施例1所得结果如图3b所示，对比例1所得结果如图6中a所示。采用乙醚为Fe

需要说明的是，上述对本公开的一些实施例进行了描述。其它实施例在所附权利要求书的范围内。在一些情况下，在权利要求书中记载的动作或步骤可以按照不同于上述实施例中的顺序来执行并且仍然可以实现期望的结果。另外，在附图中描绘的过程不一定要求示出的特定顺序或者连续顺序才能实现期望的结果。在某些实施方式中，多任务处理和并行处理也是可以的或者可能是有利的。

基于同一发明构思，与上述任意实施例方法相对应的，本公开实施例还提供一种镂空核壳结构纳米磁性微球。所述镂空核壳结构纳米磁性微球通过如前技术方案所述的制备方法制成。其电镜图如图3d所示。其近红外表征结果图如图4所示。

本公开提供了上述技术方案任意一项所述的镂空核壳结构纳米磁性微球的制备方法或上述技术方案所述的制备方法制备得到的镂空核壳结构纳米磁性微球在痕量磷酸化多肽特异性富集或纯化中的应用。

通过具体实施例，对本公开提供的一种镂空-核壳结构纳米磁性微球的制备和磷酸化多肽的富集过程进行详细的阐述。

实施例2使用镂空-核壳结构纳米磁性微球纯化β-casein中的磷酸化多肽

1、将1mgβ-casein溶解在1ml 50mM的碳酸氢铵缓冲液中，获得浓度为1mg/mlβ-casein溶液；

2、取10ugβ-casein,按照1:50的比例加入胰蛋白，在37℃水浴条件下进行12小时酶切，酶切结束后加入终浓度为1％的三氟乙酸终止酶切反应，真空干燥后获得β-casein酶切肽段；

3、使用100ul结合缓冲液(1％三氟乙酸，80％乙腈)将实施例1制备的Fe

4、将步骤2获得多肽溶解在100ul结合缓冲液中，并转移至装有平衡好的Fe

5、结合结束后，使用100ul结合缓冲液清洗磁性微球三次，用100ul去离子水清洗二次；

6、分别使用100ul的1％和2.5％的氨水洗脱结合在磁性微球上的磷酸化肽，合并两次洗脱液，快速真空旋干后，使用0.1％甲酸水重溶后，使用LC-MS/MS对纯化前和纯化后的多肽分别进行检测，对纯化效果进行评估，结果见图5。

由图5可以看出，使用实施例1制备所得镂空核壳结构纳米磁性微球对β-casein蛋白进行磷酸化多肽富集后，通过LC-MS/MS能够检测到更多丰度区间的磷酸化蛋白。可见，实施例1制备的镂空核壳结构纳米磁性微球，能够作为亲和试剂对复杂生物样品中的痕量磷酸化多肽进行特异性富集和纯化，且具有优良的特异性富集和纯化效果。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本公开的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本公开实施例的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。

另外，为简化说明和讨论，并且为了不会使本公开实施例难以理解，在阐述了具体细节以描述本公开的示例性实施例的情况下，对本领域技术人员来说显而易见的是，可以在没有这些具体细节的情况下或者这些具体细节有变化的情况下实施本公开实施例。因此，这些描述应被认为是说明性的而不是限制性的。

尽管已经结合了本公开的具体实施例对本公开进行了描述，但是根据前面的描述，这些实施例的很多替换、修改和变型对本领域普通技术人员来说将是显而易见的。

本公开实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本公开实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。