一种烟草谷胱甘肽转移相关的基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种烟草谷胱甘肽转移酶相关的基因及其应用，属于植物基因工程技术领域。

背景技术

非生物胁迫，如干旱胁迫、盐胁迫、低温胁迫、重金属离子等，能促进植物体内产生大量的氧自由基，引发氧化损伤，严重影响植物的生长发育，造成作物减产。抗氧化系统是植物抵御非生物胁迫的重要机制，由一些能清除活性氧的酶系和抗氧化物质组成，保护细胞免受氧化胁迫的伤害，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)是抗氧化系统的重要组成部分。谷胱甘肽硫转移酶(Glutathione S-transferases, GSTs)是谷胱甘肽代谢途径中的关键酶，广泛存在于植物的细胞质基质、线粒体、微粒体中，多项研究表明，GSTs 在植物抵抗非生物胁迫引起的氧化胁迫的过程中，发挥了重要的作用。GST 不仅被真菌和其他一些病原物诱导表达，植物激素如生长素、水杨酸、乙烯和ABA等也能诱导它的表达。研究表明，GST在植物遭受各种生物和非生物胁迫时，通过解毒和抗氧化作用保护植物细胞免受伤害。利用农杆菌侵染法将盐碱地碱蓬GST 基因转入低温敏感的水稻幼苗品种‘中花11’，转基因植株增强了对低温胁迫的抗性。过表达野生大豆GsGST 基因可以提高烟草的耐盐性。GST 在水稻抗重金属镉胁迫中起到一定作用。盐地碱蓬GST 基因在拟南芥中过量表达后，拟南芥转基因植株的抗旱能力与对照相比有所增强。

烟草作为我国重要的经济作物和模式作物，研究烟草谷胱甘肽转移酶基因响应非生物逆境胁迫的分子机制具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种烟草谷胱甘肽转移酶相关的基因及其应用，为研究烟草抗逆能力与基因功能提供遗传材料和理论依据。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种烟草谷胱甘肽转移酶相关的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，包括675bp个碱基，该基因来源于烟草（Nicotiana tabacum，命名为

SEQ ID NO.1:

ATGGAAGACCAAGTGAAACTGCTAGGAGCTTTTCCAAGTCCCTTTAGTTATAGGGTAATTTGGGCTCTGAAACACAAGGGTATCAACTATGAATACATAGAGGAAGATCTTTCAAATAAGAGCCATGATCTTTTGACATACAACCCTATCTATAAGATGATTCCTGTTCTTGTACATGCTGGAAAACCAATAGCAGAGTCCACAGTCATCCTTGAATACATCGAAGAGACATGGCCTCAGAATCCTTTGCTACCAAAGGATCCTCATGAAAGGGCTCAGGCTAGATTCTGGATCAAGTTCGGAGAAGATAAGAGCCCAGAATTTTTCGCAATATTTCACAAGATAGGGGAAGAGCAAGTCAAGGCAACTGAAAAAGCAAAGGAAGTGTTGAAAATTATAGAAGAGCAAGGTCTTGGAGAGAAGAAGTTTTTTAGCGGGGACACAATTGGATTAAGTGACATAGTCTTTGGATGGATAGCGTTATGGCTGGAAGTCATACAAGAAGCTGCTGAAGTAAAGGTCTTCGACTCAGTTAGTACTTTTCCTCGTTTACATGCTTGGATACATAACTTTAAGCAACTCCCTGTAATCAAACAAAATACCCCACATCGGGATGCAATGCTAGCTTATTTCAAACGTCGTCGAGAAATGGTTGTAGCAGCGGCACAAGGTTGA。

优选的，所述烟草谷胱甘肽转移酶相关的基因的编码蛋白，氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，包括224个氨基酸。

SEQ ID NO.2：

MEDQVKLLGAFPSPFSYRVIWALKHKGINYEYIEEDLSNKSHDLLTYNPIYKMIPVLVHAGKPIAESTVILEYIEETWPQNPLLPKDPHERAQARFWIKFGEDKSPEFFAIFHKIGEEQVKATEKAKEVLKIIEEQGLGEKKFFSGDTIGLSDIVFGWIALWLEVIQEAAEVKVFDSVSTFPRLHAWIHNFKQLPVIKQNTPHRDAMLAYFKRRREMVVAAAQG。

本发明还提供了一种基因编辑植株的制备方法：

通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术，构建了用于敲除NtGST23基因的CRISPR/Cas9编辑载体，经遗传转化后获得了NtGST23基因发生编辑的烟草植株；所述NtGST23基因如权利要求1中SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了烟草谷胱甘肽转移酶相关的基因在烟草抗逆方面的应用。

所述烟草谷胱甘肽转移酶相关的基因在四叶一心时期在抗干旱胁迫方面的应用。

本发明的有益效果是：

1、本发明通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术，构建了用于敲除

2、综上所述，利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术敲除

附图说明

图1为对照（未转化）植株叶片和基因编辑植株叶片在四叶一心时期，20%浓度PEG-6000模拟干旱处理下的对照图。

具体实施方式

以下通过实施例来详细说明本发明的技术方案，以下的实施例仅是示例性的，仅能用来解释和说明本发明的技术方案，而不能解释为是对本发明技术方案的限制。

在本申请的各实施例中，没有注明具体技术或条件者，按照本领域内现有技术或条件进行，所使用的材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

本发明除非另有说明，否则百分号为体积百分数，比例为体积比。

本申请中所使用的烟草品种为红花大金元，一种商品化烟草品种。

实施例1

本实施例主要就烟草谷胱甘肽转移酶相关的基因

以栽培种烟草红花大金元叶片为样品，利用RNA提取试剂盒提取烟草叶片总RNA，反转录为cDNA备用：

按照植物RNA提取试剂盒说明书提取烟草总RNA。

1μg从叶片中提取总RNA用于反转录，转录体系如下：

Total RNA 1μg

Oligo(dT) (10μM) 1.5μL

ddH

将上述体系混匀后置于PCR中，70℃保温5min，去除后立即置于冰上5min，之后向体系中加入以下试剂：

M-MLV Buffer（5X） 5μL

M-MLV逆转录酶 0.5μL

RNase 抑制剂 0.5μL

dNTP Mixture 4μL

ddH

上述体系放入PCR仪中，42℃ 65min，65℃ 10min，4℃保温，之后置于-20℃冰箱中保存使用。

通过同源比对的方法，参考拟南芥基因的序列及已知烟草部分基因序列，设计扩增引物序列如下：

F：5’- ATGGAAGACCAAGTGAAACT-3’，（SEQ ID No.3）

R：5’- TCAACCTTGTGCCGCTGCTA-3’；（SEQ ID No.4）

以上述所制备cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增：

扩增体系（50μL）：

cDNA 0.5μL

5×Reaction Buffer 10μL

上游引物（10mmol/L） 2.5μL

下游引物（10mmol/L） 2.5μL

dNTP (10 mM) 5μL

Phusion DNA Polymerase 0.5μL

ddH

混匀离心后进行PCR 扩增，PCR反应条件为：95℃ 10sec，52℃ 30sec，72℃2.5min，共30个循环；72℃ 10min；12℃ Hold。

对扩增产物进行提纯后测序，获得烟草谷胱甘肽转移酶相关的基因

实施例2

利用实施例1中所获得烟草谷胱甘肽转移酶相关的基因

选择

利用上一步所构建的CRISPR/Cas9- NtGST23编辑载体质粒，以红花大金元为例，进行遗传转化试验，以敲除植物体内的烟草谷胱甘肽转移酶相关的基因

将烟草种子点种于培养皿中，待长到4片子叶（15-20d），便可将其移入培养瓶中（含80mL MS液体培养基），每瓶2株，于25±1℃、光照强度30-50μmol/(m

取出-80℃保存的LBA4404电转化感受态农杆菌细胞，置于冰上冻融。待感受态刚刚解冻时，加入含有编辑

在超净工作台中制作烟草叶盘成边长为1cm的方形叶盘，用MS液体制备含有CRISPR/Cas9- NtGST23编辑载体的农杆菌菌落成悬浮菌液（OD

实施例3

利用实施例3中同一份

待播种后生长25-30d时，将其移栽至花盆中继续生长，待生长至四叶一心时期，进行20%浓度PEG-6000浇灌处理，每3d浇灌一次，15d后拍照记录植株的萎蔫程度。

结果表明，烟草谷胱甘肽转移酶相关的基因

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 云南中烟工业有限责任公司

<120> 一种烟草谷胱甘肽转移相关的基因及其应用

<141> 2022-04-25

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1755

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atgtcacttc gacccagcag tagaacagag gtgaggaaga aatcttataa aattggggta 60

gatgcggatg aggctcgtcg taggagggaa gacaatttgg tggagatcag gaagaacaag 120

cgagaagaca atctccttaa gaaacgccgt gaaggccttc ttcactccca acagcttcct 180

gatgcttctc aatcccctgc tcttctcgag aaaagattgg aaagtattcc tgctatggtc 240

caaggagtgt gttcggaaga tcctgctaca caaatcgaag caactacgca ttttaggaag 300

ctcttatcaa ttgagcgcag ccctccaatt gatgaggtga ttaatgctgg agttgttcct 360

cgatttgtgg aattcctcgg gaggcatgac ctacctcaac tgcaattcga agctgcatgg 420

gctttgacca atgttgcatc tgggtcttca gaacatactc gagctgtgat cgaacatgga 480

gctgtcccta agtttattca acttctaagt tcagccagtg atgatgtgcg tgagcaggca 540

gtctgggctt tgggcaacgt tgctggtgat tcccctagtt gtagggatct tgtgcttggt 600

caaggcgcac tcatgccatt gctagctcag ttgaatgaac actcaaagct ttcaatgttg 660

agaaatgcta catggacact ctccaacttc tgtcgaggca aaccaccaac accatttgag 720

gcggtcaaac ctgcattgcc aattcttcaa cagcttatcc acatgaatga tgaagaggtt 780

ttgacagatg cttgttgggc cctttcttat ctatctgatg gcccaaatga taagattcaa 840

gctgtaatcg aggcgggtgt ctgtccccga cttgtggagc ttcttcttca tccatcacct 900

acagttctta tacctgctct tcggactgcg gggaatatag tcacgggtga tgatgctcaa 960

acacagtaca tgattgacaa ccaagtcttg ccatgtctct atcaattgct atctgaaaat 1020

cataagaaaa gcatcaagaa ggaggcttgt tggacaatat ctaatatcac cgctggaaat 1080

atggaagacc aagtgaaact gctaggagct tttccaagtc cctttagtta tagggtaatt 1140

tgggctctga aacacaaggg tatcaactat gaatacatag aggaagatct ttcaaataag 1200

agccatgatc ttttgacata caaccctatc tataagatga ttcctgttct tgtacatgct 1260

ggaaaaccaa tagcagagtc cacagtcatc cttgaataca tcgaagagac atggcctcag 1320

aatcctttgc taccaaagga tcctcatgaa agggctcagg ctagattctg gatcaagttc 1380

ggagaagata agagcccaga atttttcgca atatttcaca agatagggga agagcaagtc 1440

aaggcaactg aaaaagcaaa ggaagtgttg aaaattatag aagagcaagg tcttggagag 1500

aagaagtttt ttagcgggga cacaattgga ttaagtgaca tagtctttgg atggatagcg 1560

ttatggctgg aagtcataca agaagctgct gaagtaaagg tcttcgactc agttagtact 1620

tttcctcgtt tacatgcttg gatacataac tttaagcaac tccctgtaat caaacaaaat 1680

accccacatc gggatgcaat gctagcttat ttcaaacgtc gtcgagaaat ggttgtagca 1740

gcggcacaag gttga 1755

<210> 2

<211> 224

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Met Glu Asp Gln Val Lys Leu Leu Gly Ala Phe Pro Ser Pro Phe Ser

1 5 10 15

Tyr Arg Val Ile Trp Ala Leu Lys His Lys Gly Ile Asn Tyr Glu Tyr

20 25 30

Ile Glu Glu Asp Leu Ser Asn Lys Ser His Asp Leu Leu Thr Tyr Asn

35 40 45

Pro Ile Tyr Lys Met Ile Pro Val Leu Val His Ala Gly Lys Pro Ile

50 55 60

Ala Glu Ser Thr Val Ile Leu Glu Tyr Ile Glu Glu Thr Trp Pro Gln

65 70 75 80

Asn Pro Leu Leu Pro Lys Asp Pro His Glu Arg Ala Gln Ala Arg Phe

85 90 95

Trp Ile Lys Phe Gly Glu Asp Lys Ser Pro Glu Phe Phe Ala Ile Phe

100 105 110

His Lys Ile Gly Glu Glu Gln Val Lys Ala Thr Glu Lys Ala Lys Glu

115 120 125

Val Leu Lys Ile Ile Glu Glu Gln Gly Leu Gly Glu Lys Lys Phe Phe

130 135 140

Ser Gly Asp Thr Ile Gly Leu Ser Asp Ile Val Phe Gly Trp Ile Ala

145 150 155 160

Leu Trp Leu Glu Val Ile Gln Glu Ala Ala Glu Val Lys Val Phe Asp

165 170 175

Ser Val Ser Thr Phe Pro Arg Leu His Ala Trp Ile His Asn Phe Lys

180 185 190

Gln Leu Pro Val Ile Lys Gln Asn Thr Pro His Arg Asp Ala Met Leu

195 200 205

Ala Tyr Phe Lys Arg Arg Arg Glu Met Val Val Ala Ala Ala Gln Gly

210 215 220

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

atggaagacc aagtgaaact 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

tcaaccttgt gccgctgcta 20

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

aagctcctag cagtttcact tgg 23