一种靶向线粒体放大氧化应激的新型抗肿瘤纳米药物

技术领域

本发明涉及一种聚合物，尤其涉及一种通过靶向线粒体提高线粒体氧化应激的聚合物载药纳米粒子，本发明还涉及由该聚合物获得的纳米药物及其制备方法。

背景技术

线粒体是细胞的能量工厂，在细胞分化、信号传导、凋亡控制中起着非常重要的作用。线粒体与多种信号通路紧密相关，诱导线粒体功能障碍用于癌症治疗具有高的效率和特异性。由于线粒体在细胞中的重要地位和在介导细胞死亡中的核心作用，线粒体已成为癌症治疗的重要靶点(J.Controlled Release，2015，207，40-58；Nat.Commun，2018，9，4321.)。线粒体是细胞内活性氧(ROS)的主要产生位点，大约90％的ROS在线粒体中产生。ROS是细胞内反应活性的物质，参与很多生物学过程，比如细胞增殖、分化和迁移(Science，2006， 312，1882-1883.)。高浓度的ROS会氧化破坏脂质、蛋白质和DNA的结构。线粒体DNA相比于细胞核DNA缺乏自修复能力，更易被氧化破坏结构。癌细胞的线粒体具有高浓度 ROS和抗氧化物，改变线粒体氧化还原内稳态，增大ROS的浓度可以产生氧化应激，破坏与线粒体功能相关的脂质、蛋白质和DNA，进而引起线粒体功能障碍。由于半衰期(～40 ns)和扩散距离(～20nm)非常短，ROS只能对产生位点附近处的细胞成份造成杀伤(Cell， 2005，120，483-495.)。因此，构建纳米药物靶向线粒体，改变线粒体的氧化还原内稳态，诱导线粒体产生氧化应激是杀死癌细胞和提高抗癌效果的有效途径。

然而线粒体高密度的双模和膜上高的负电位使线粒体的渗透性差，药物分子和大分子难以进入，使很多作用线粒体的药物疗效低下(Acta Biomaterialia，2018，77，268-281.)。在纳米粒子上修饰靶向线粒体的配体是促进药物分子进入线粒体和提高癌症治疗效果的有效方式。三苯基膦盐、吡啶鎓盐、季胺盐、青色素和罗丹明衍生物等亲脂性离域阳离子以及具有特异性氨基酸序列的线粒体靶向肽广泛用于构建靶向线粒体的纳米药物递送系统，这些靶向线粒体的纳米药物递送系统在过去几十年中取得了重要进展，但仍存在一些问题，比如容易团聚、血液循环时间短等(Adv.Healthcare Mater，2021，10，2001240；Chem.Rev，2017，117， 10043.)。因此，迫切需要开发能靶向进入线粒体且具有长血液循环时间的纳米药物递送系统以提高癌症治疗效果。

近来研究表明香豆素-3-甲酰胺修饰的药物分子具有很好的线粒体定位效果，用于构建靶向线粒体的荧光探针(Chem.Eur.J，2015，21，17415-17421；J.Med.Chem，2016，59，5022-5034.)。相比于亲脂性的离域阳离子化合物修饰，中性的香豆素-3-甲酰胺荧光团修饰纳米粒子不仅具有示踪和靶向线粒体的能力，而且不发生团聚、半衰期长(血液循环过程中不会因为静电作用而被吸附清除)。因此，利用香豆素-3-甲酰胺修饰纳米粒子是构建靶向进入线粒体且具有长血液循环时间纳米药物递送系统的有效方法。

肉桂醛是肉桂中的主要成分，是FDA批准的食品添加剂，具有抗菌和抗癌活性(Journal of Controlled Release，2018，269，235-244.)。肉桂醛可以刺激线粒体产生ROS，广泛用于放大氧化应激(Nature Nanotechnology，2019，14，379-387；Nano Lett，2020，20， 2514-2521.)。酮/醛缩硫醇是ROS响应的底物，广泛用于构建ROS响应的纳米药物递送系统(Biomacromolecules，2018，19，4658-4667.)。喜树碱是一种广谱临床抗癌药物，不仅可以通过抑制DNA拓扑异构酶I起到抗肿瘤作用，而且可以作为细胞呼吸抑制剂刺激线粒体产生ROS和超极化线粒体起到氧化应激的作用(Cell Death Differ，2004，11，924-936.)。本发明以肉桂醛为底物合成双端氨基化的醛缩硫醇，再用丙烯酰氯修饰合成双端烯基化的醛缩硫醇单体；在硫辛酸上共轭上叔胺化合物，再开环合成双端巯基化的单体；在聚乙二醇的一端共轭香豆素-3-甲酰胺衍生物(7-(N，N’-二乙胺基)香豆素-3-羧酸)，在另一端用丙烯酰氯修饰构建靶向线粒体的封端试剂；将封端试剂和单体通过麦克加成反应构建两亲性的嵌段共聚物。将共聚物与喜树碱自组装形成靶向线粒体放大氧化应激的载药纳米粒子，纳米粒子通过 EPR效应富集到肿瘤组织后，酸性的肿瘤微环境使叔胺质子化促进纳米粒子的入胞和溶酶体逃逸，进而靶向线粒体，在线粒体内ROS响应地释放肉桂醛和喜树碱，通过喜树碱和肉桂醛的刺激线粒体放大氧化应激和喜树碱的化疗作用协同提高抗肿瘤效果。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是针对上述的技术现状而提供一种靶向线粒体放大氧化应激的新型聚合物。

本发明所要解决的第二个技术问题是针对上述的技术现状而提供一种靶向线粒体放大氧化应激的新型聚合物的制备方法。

本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种靶向线粒体放大氧化应激的新型聚合物载药纳米粒子。

本发明所要解决的第四个技术问题是提供一种靶向线粒体放大氧化应激的新型聚合物聚合物载药纳米粒子的制备方法。

本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为：设计一种靶向线粒体放大氧化应激的新型聚合物，其特征在于该聚合物的结构式(G)如下：

结构式(I)中的n为43-2272的整数，m为5-1000的整数。

本发明解决上述第二个技术问题所采用的技术方案为：提供一种靶向线粒体放大氧化应激的新型聚合物的制备方法，其特征在于包括小分子化合物和聚合物的合成步骤：

(1)①往7-(N，N’-二乙胺基)香豆素-3-羧酸的溶液中加入缩合剂活化后，再加入干燥的氨基化的聚乙二醇中反应，将反应液后处理得结构式为(A)的产物；②往干燥的 (A)中加入丙烯酰氯的二氯甲烷溶液，处理反应液得结构式为(B)的产物；所述氨基化聚乙二醇与7-(N，N’-二乙胺基)香豆素-3-羧酸的物质的量之比为1∶1～1.2，所述7- (N，N’-二乙胺基)香豆素-3-羧酸与缩合剂的物质的量之比为1∶1～1.2，(A)与丙烯酰氯的物质的量之比为1∶1～2。

(2)①往硫辛酸中加入缩合剂进行活化，随后加入N，N’-二乙基丙二胺进行反应，处理反应液得结构式为(C)的产物；②往(C)的溶液中加入硼氢化钠反应，处理反应液结构式为(D)的产物；所述硫辛酸与缩合剂的物质的量之比为1∶1～1.2，硫辛酸与N，N’-二乙基丙二胺物质的量为1∶1～1.5，所述(C)与硼氢化钠的物质的量之比为1∶1～2。

(3)①往肉桂醛中加入催化量酸进行活化，随后加入半胱胺盐酸盐进行反应，处理反应液得结构式为(E)的产物；②往(E)中加入碱和丙烯酰氯进行反应，处理反应液得结构式为(F)的产物；所述肉桂醛与半胱胺盐酸盐的物质的量之比为1∶2～2.4，所述(E)与丙烯酰氯的物质的量之比为1∶2～2.4。

(4)往干燥的聚合物(B)中，加入(D)、(F)的溶液和碱进行反应，处理反应液得聚合物(G)；所述聚合物(B)与化合物(D)、(F)的物质的量之比为1∶5～200∶5～200；

上述步骤涉及的各结构式如下：

上述步骤涉及的反应式如下：

作为优选，步骤(1)中第一步反应所述的溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜的一种，最优选二甲亚砜；第二步反应的溶剂最优选为二氯甲烷或三氯甲烷的一种。

作为优选，步骤(1)中第一步反应缩合剂为羰基二咪唑和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N，N-二环己基碳二亚胺的一种，最优选的为羰基二咪唑。

作为优选，步骤(1)中各步反应所述溶剂的体积用量以反应物的物质的量计算为1～5 mL/mmol。

作为优选，步骤(1)中第一步和第二步反应所述反应液处理方式如下：浓缩反应后，冰乙醚沉淀得结构式为(A)和(B)产物。

作为优选，步骤(2)中第一步反应溶剂为四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺和二甲亚砜的一种；第二步反应溶剂为无水N，N-二甲基甲酰胺或甲醇的一种。

作为优选，步骤(2)中第一步反应的缩合剂优选为羰基二咪唑和1-(3-二甲氨基丙基)- 3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N，N-二环己基碳二亚胺的一种，最优选的为羰基二咪唑。

作为优选，步骤(2)中各步反应所述溶剂的体积用量以反应物的物质的量计算为1～5 mL/mmol。

作为优选，步骤(2)中第一和第二步所述反应液处理方式如下：柱层析得结构式为(C)和(D)的产物。

作为优选，步骤(3)中第一步反应溶剂为二氯甲烷和三氯甲烷的一种；第二步反应溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈和四氢呋喃的一种。

作为优选，步骤(3)中第一步反应的酸为三氟乙酸、浓盐酸、浓硫酸的一种，最优选为三氟乙酸。

作为优选，步骤(3)中第二步反应的碱为三乙氨、吡啶、N，N-二异丙基乙氨的一种，最优选为三乙胺。

作为优选，步骤(3)中各步反应所述溶剂的体积用量以反应物的物质的量计算为1～5 mL/mmol。

作为优选，步骤(3)中第一步反应液的处理方式如下：过滤收集固体，用二氯甲烷洗涤固体得结构式为(E)的产物；第二步反应液的处理方式如下：柱层析得结构式为(F) 的产物。

作为优选，步骤(4)中碱为三乙氨、吡啶、N，N-二异丙基乙氨和1，8-二偶氮杂双螺环 [5.4.0]十一-7-烯的一种，最优选的为1，8-二偶氮杂双螺环[5.4.0]十一-7-烯。

作为优选，步骤(4)中所述溶剂为无水N，N-二甲基甲酰胺或无水二甲基亚砜的一种。

作为优选，步骤(4)中所述溶剂的体积用量以反应物的物质的量计算为1～5 mL/mmol。

作为优选，步骤(4)中所述反应液处理方式如下：旋干溶剂后，加入少量二氯甲烷溶解，乙醚沉淀数次，收集固体，将固体溶于二甲亚砜后，滴加到水中自组装12h，随后透析72h，每6h换一次水，透析完后，离心，滤液冻干得结构式为(G)的产物。

本发明解决上述第三个技术问题所采用的技术方案为：一种靶向线粒体放大氧化应激的新型聚合物载药纳米粒子，其特征在于在聚合物的端基上键合靶向线粒体的配体7-(N，N’- 二乙胺基)香豆素-3-羧酸、主链上含有多个ROS敏感的醛缩硫醇结构，负载放大氧化应激的化疗试剂制备载药纳米粒子，在线粒体内通过ROS响应地释放化疗试剂和肉桂醛，通过氧化应激和化疗起到协同抗肿瘤效果。

本发明解决上述第四个技术问题所采用的技术方案为：一种靶向线粒体放大氧化应激的新型聚合物载药纳米粒子的制备方法，其特征在于包括如下步骤：往聚合物(G)和化疗试剂中加入二甲基亚砜，超声溶解，缓慢滴加到去离子水或磷酸缓冲盐溶液溶液中，搅拌后转移至透析袋中透析，待透析干净后，离心收集上层清液，将上层清液冻干得靶向线粒体放大氧化应激的新型聚合物载药纳米粒子。

本发明的优点在于与靶向线粒体的光动力治疗系统相比，有效解决了光渗透深度的问题；与亲脂性离域阳离子修饰的靶向线粒体的纳米粒子相比，本发明的优点在于具有长的血液循环时间和高的线粒体靶向定位能力。这种聚合物载药纳米药物具有体内传输稳定、靶向进入线粒体、以ROS响应的方式降解释放肉桂醛和化疗试剂，起到化疗和氧化应激的协同治疗等优点。经实验证明共聚物前药(G)具有靶向定位线粒体的能力、ROS响应释放性能、低的临界胶束浓度、高的载药性能，在水中自组装可形成稳定的载药纳米粒子。

附图说明

图1为化合物(E)的核磁共振氢谱图。

图2为实施例3中纳米粒子的扫描电子显微镜照片。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1(聚合物(G))

(1)①往30mL 7-(N，N’-二乙胺基)香豆素-3-羧酸(0.52g，2mmol)的氯仿溶液加入0.32g(2mmol)羰基二咪唑进行活化，将活化的溶液加入到含4g(2mmol)氨基化的聚乙二醇的支口瓶中，氮气保护下反应24h。浓缩反应液后，乙醚沉淀3次，收集固体，干燥得产物(A)，产率87.3％。②往50mL支口瓶中加入2g(A)，105℃真空除水3h，恢复室温后加入0.22g(2.4mmol)丙烯酰氯和30mL二氯甲烷反应48h，浓缩反应液后，乙醚沉淀3次，收集固体干燥得产物(B)，产率90.1％。

(2)①取2.06g(10mmol)硫辛酸、1.78g(11mmol)羰基二咪唑和30mL四氢呋喃加入到50mL支口瓶，活化半小时后加入1.30g(10mmol)N，N-二乙基丙二胺，氮气保护下室温反应24h。浓缩反应液，用石油醚和乙酸乙酯柱层析得产物(C)，产率89.4％。②往3.19g(10mmol)化合物(C)中加入30mL甲醇和0.06g(15mmol)硼氢化钠，室温反应24h。反应结束后，浓缩反应液，柱层析得产物(D)，产率96.3％。

(3)①往100mL圆底烧瓶中加入2.64g(20mmol)肉桂醛和催化量的三氟乙酸，室温活化半小时后加入5.45g(48mmol)半胱胺盐酸盐，室温搅拌48h，过滤收集固体，用二氯甲烷洗涤数次，干燥得结构式为(E)的产物，产率74.7％。化合物(E)的核磁共振氢谱如图1所示。②往3.23g(10mmol)化合物(E)中加入5.94mL(44mmol)三乙胺搅拌反应4h，随后加入1.99g(22mmol)丙烯酰氯，室温反应24h。饱和食盐水洗涤数次后，干燥有机相，浓缩后用石油醚和乙酸乙酯(4∶1)柱层析得产物(F)，产率91.4％。

(4)①往100mL带支口的圆底烧瓶中加入2g(1mmol)聚合物B，于105℃真空除水3h，恢复至室温后依次加入化合物D(6.41g，20mmol)、化合物F(7.53g，20mmol)和 1，8-二偶氮杂双螺环[5.4.0]十一-7-烯(9.13g，60mmol)的二甲亚砜溶液，于45℃氮气保护下反应72h。反应结束后，浓缩反应液，冰乙醚沉淀3次，收集固体，用少量DMSO溶解后，搅拌下滴加到去离子水中自组装，再转移至透析袋中透析，透析结束后，将透析液冻干得聚合物(G)，产率66.1％。

实施例2

将10mg聚合物(G)和2.5mg喜树碱超声溶于1mL DMSO，搅拌下逐滴地滴加到7 mL去离子水中，室温搅拌12h后转移至透析袋透析，待DMSO透析干净后，离心，过滤收集上层清液。定容至10mL后，涡旋混匀，即制备1mg/mL的载药纳米粒子溶液。

实施例3

取1滴制备的载药纳米粒子溶液(1mg/mL)置于硅片上，室温静置挥干后，用扫描电子显微镜观察纳米粒子的微观形貌，结果如附图2所示，说明我们制备得到粒径比较均一的椭球形纳米粒子，粒径在180nm左右。