一种阿霉素与丹参酮IIA联合抗肿瘤纳米传递系统及其制备方法

技术领域

本发明涉及纳米材料制备及药物控制释放技术领域，尤其涉及一种阿霉素与丹参酮IIA联合抗肿瘤纳米系统的制备方法。

背景技术

恶性肿瘤是一类普遍的公共健康问题，因具有细胞分化、增殖异常及转移性等生物学特征，已成为世界性难题，严重威胁人类健康和生命。化疗仍然是治疗肿瘤的主要手段，不仅能克服手术治疗和放射治疗的局限，对于扩散和转移的肿瘤也具有显著疗效，但化疗同时伴随着疼痛、复发、细胞选择性差、毒副作用大、及破坏免疫力等多重不良反应，难以发挥出最佳疗效，并未能很大程度上改善患者的痛苦。因此，针对肿瘤微环境的特点设计出合适的纳米药物传递响应体系，靶向递送药物已经成为药物治疗肿瘤的重要内容。

缺氧是众多实体肿瘤的一大特性，基于肿瘤微环境缺氧设计给药体系已经成为肿瘤靶向治疗的一种选择。目前，几类生物还原分子如偶氮苯衍生物、硝基、醌基等被广泛应用于缺氧响应体系的设计，这类小分子在缺氧条件或内源性还原酶的刺激下，发生反应，从而能进一步释放负载药物发挥抗肿瘤作用。

阿霉素属于抗生素，其抗肿瘤谱较广，多与其他抗癌药物联合使用。它可以直接嵌入DNA核碱基之间，影响细胞中相应基因的转录，并阻止mRNA的形成，从而抑制DNA和RNA的合成。尽管有这些有益的方面，由于缺乏特异性和化疗期间的肿瘤抗性，阿霉素的使用仍然存在严重的局限性，特别是其造成的心脏毒性。丹参酮IIA是从中药丹参中提取出的一种醌类化合物，临床上主要用于治疗肿瘤和心血管疾病。目前体外研究已证实，丹参酮与阿霉素联合应用能有效增强抗肿瘤作用。由于阿霉素和丹参酮IIA都具有水溶性差、生物利用度低等缺陷，严重影响两药的临床使用，因此急需一种简单高效的解决方法用于药物的传递，使阿霉素与丹参酮IIA能同时发挥出最佳疗效，提高生物利用度的同时，降低药物毒副作用。

发明内容

基于以上现有技术的不足，一种阿霉素与丹参酮IIA联合抗肿瘤纳米传递系统的制备方法。采用生物相容性良好、毒性低的高分子材料羧甲基壳聚糖作为载体，通过偶氮键作为桥梁，接枝阿霉素制备成具有缺氧响应的高分子前药，能将药物靶向递送到肿瘤部位释放，减少对正常组织的毒副作用。进一步将丹参酮IIA与缺氧响应高分子前药自主装形成双药纳米粒，将化疗药与中药活性成分同时递送到肿瘤部位，利用丹参酮IIA与阿霉素协同的优势，增强抗肿瘤疗效，改善药动学性质，最大程度克服耐药性以及能使毒副作用最小化，具有非常高的应用价值。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种阿霉素与丹参酮I IA联合抗肿瘤纳米传递系统的制备方法，包含如下步骤：

(1)取适量偶氮苯-4,4’-二羧酸(AZO)溶解于吡啶，超声溶解，加入与偶氮苯-4,4’-二羧酸等摩尔的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和占偶氮苯-4,4’-二羧酸10％的4-DMAP，催化两小时；取适量CMCS，溶解于去离子水中，调节pH值为7.4，超声5min，得到CMCS溶液；将CMCS溶液逐滴加入催化后的AZO溶液，室温下磁力搅拌过夜，透析，去除吡啶，5000rpm离心，上清液冷冻干燥后得到CMCS-AZO中间体冻干粉末；

(2)将CMCS-AZO冻干粉末溶解于去离子水，调节pH值为6-7，加入与CMCS-AZO等摩尔的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和占CMCS-AZO10％的4-DMAP，催化两小时后调pH值为7.5-8.0；将阿霉素(DOX)溶解于DMSO中，得DOX溶液；将DOX溶液逐滴加入CMCS-AZO溶液中，室温下避光磁力搅拌过夜，分别以DMSO和去离子水的混合液和去离子水进行透析，去除有机溶剂及其他杂质，5000rpm离心，上清液冷冻干燥后得到CMCS-AZO-DOX高分子前药粉末；

(3)将丹参酮IIA(TSIIA)溶解于适量DMSO中，配制成TSIIA溶液，CMCS-AZO-DOX溶于适量去离子水中，配制成前药溶液，在室温磁力搅拌下，将TSIIA溶液逐滴加入前药溶液中，避光，室温下磁力搅拌4-8h，低温超声粉碎，即得包载TSIIA的CMCS-AZO-DOX的纳米粒溶液，去离子水中透析，冷冻干燥，即得纳米粒冻干粉末，即为所述阿霉素与丹参酮IIA联合抗肿瘤纳米传递系统。

作为上述技术方案的优选，本发明提供的阿霉素与丹参酮I IA联合抗肿瘤纳米传递系统的制备方法进一步包括下列技术特征的部分或全部：

作为上述技术方案的改进，所述步骤(1)中AZO与吡啶的比例为3～3.2mg：1.8～2mL；AZO与CMCS摩尔比为1:1，CMCS的摩尔质量为1×104，并且羧甲基取代度为85％；透析将反应液转移到3.5kDa透析袋内进行封装，以去离子水为透析介质，透析36-48h，期间4h换一次介质。

作为上述技术方案的优选，本发明提供的阿霉素与丹参酮I IA联合抗肿瘤纳米传递系统及其制备方法进一步包括下列技术特征的部分或全部：

作为上述技术方案的改进，所述步骤(2)中CMCS-AZO与DOX的质量比为3～4.5mg:1mg；透析是将反应液封装到3.5kDa透析袋内，分别以二甲亚砜和去离子水的混合液3:7作为透析介质透析12h，去离子水透析48h，期间每4-6h换一次透析液。

作为上述技术方案的优选，本发明提供的阿霉素与丹参酮I IA联合抗肿瘤纳米传递系统及其制备方法进一步包括下列技术特征的部分或全部：

作为上述技术方案的改进，所述步骤(2)所得CMCS-AZO-DOX高分子前药载药量为10.10％～14.45％。其中载药量采用紫外分光光度法进行测定。

作为上述技术方案的优选，本发明提供的阿霉素与丹参酮I IA联合抗肿瘤纳米传递系统及其制备方法进一步包括下列技术特征的部分或全部：

作为上述技术方案的改进，所述步骤(3)中CMCS-AZO-DOX高分子前药与中药活性成分TSIIA的质量比为2:1-10:1。

作为上述技术方案的优选，本发明提供的阿霉素与丹参酮I IA联合抗肿瘤纳米传递系统及其制备方法进一步包括下列技术特征的部分或全部：

作为上述技术方案的改进，所述步骤(3)中低温超声粉碎是使用超声波细胞粉碎机，探头冰浴保护，低温下超声3.0s，间歇2.0s，功率为90w的脉冲方式工作10min。

作为上述技术方案的优选，本发明提供的阿霉素与丹参酮I IA联合抗肿瘤纳米传递系统及其制备方法进一步包括下列技术特征的部分或全部：

作为上述技术方案的改进，所述步骤(3)中得到的阿霉素与丹参酮IIA联合抗肿瘤纳米粒粒径范围为180-220nm,丹参酮IIA的载药量为6.21％-17.87％，包封率为51.76％-73.59％。其中，纳米粒粒径采用动态光散射仪(DLS)测得；丹参酮IIA的载药量和包封率均采用高效液相色谱法测定。

一种阿霉素与丹参酮I IA联合抗肿瘤纳米传递系统，所述所述传递系统是羧甲基壳聚糖与阿霉素通过酰胺反应连接，形成了具有缺氧响应性的两亲性高分子前药，继续通过滴加法将丹参酮IIA加入到含CMCS-AZO-DOX高分子前药的水溶液中，搅拌混合均匀后，通过超声破碎和透析自组装获得一种同时负载阿霉素和丹参酮IIA的联合抗肿瘤纳米粒，即所述的纳米传递系统。

作为上述技术方案的优选，本发明提供的阿霉素与丹参酮I IA联合抗肿瘤纳米传递系统进一步包括下列技术特征的部分或全部：

作为上述技术方案的改进，所述传递系统是由如上所述的任一方法制备而成。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下有益效果：

1、本发明创新性的将阿霉素与丹参酮IIA首次共用封装在纳米剂型中，具有粒径小，纳米粒稳定性好，载药量包封率高等优点。

2、本发明所用载体为羧甲基壳聚糖，具有低毒、良好的生物相容性和可降解的优势，经过酰胺化接枝上阿霉素，形成具有缺氧响应性的两亲性高分子前药，能提高体循环稳定性，达到智能控制释放药物的特性。

3、本发明所述方法将接枝了阿霉素的高分子前药自主装包载丹参酮IIA的联合给药纳米粒，纳米粒外观呈类球形,均一性良好，粒径适中，可在EPR效应介导下直接靶向进入肿瘤组织内部，避免在正常部位泄露产生毒副作用。

4、本发明所述的阿霉素与丹参酮IIA联合给药纳米系统具有良好的协同抗肿瘤优势，不仅能调节异常细胞的多个信号通路显著增强这些疗法的抗肿瘤效果，达到在肿瘤的不同时期和阶段杀伤肿瘤细胞的目的；达到最优治疗效果的同时，最大化的降低了单药的使用剂量，能有效克服机体的多药耐药性的缺陷，同时也能抑制它们所产生的毒副作用和并发症。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下结合优选实施例，详细说明如下。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例1制备的阿霉素与丹参酮IIA联合给药纳米传递系统的粒径分布图；

图2(A)和图2(B)分别为本发明实施例1中制备的阿霉素与丹参酮IIA联合给药纳米传递系统在常氧和缺氧条件下释药曲线图；

图3(A)和图3(B)为本发明实施例1中制备的阿霉素与丹参酮IIA联合给药纳米传递系统稳定性图；

图4为本发明实施例1中制备的阿霉素与丹参酮IIA联合给药纳米传递系统常氧和低氧条件下作用于4T1乳腺癌细胞24h后的细胞毒性结果图(mean±SD，n＝6)(*p<0.05vs；**p<0.01vs；***p<0.01)。

具体实施方式

下面详细说明本发明的具体实施方式，其作为本说明书的一部分，通过实施例来说明本发明的原理，本发明的其他方面、特征及其优点通过该详细说明将会变得一目了然。

实施例1

(1)称取30mg偶氮苯-4,4’-二羧酸(AZO)溶解于18mL吡啶，超声溶解，加入26mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、14mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和10％4-DMAP，催化两小时；取40mg CMCS，溶解于20mL去离子水中，调节pH值为7.4，超声5min，得到CMCS溶液；将CMCS溶液逐滴加入催化后的AZO溶液，室温下磁力搅拌24h，透析，去除吡啶，5000rpm离心，上清液冷冻干燥后得到CMCS-AZO中间体冻干粉末。

(2)称取50mg CMCS-AZO冻干粉末溶解于30mL去离子水，调节pH值为6-7，加入26mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、14mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和10％4-DMAP，催化两小时后调pH值为7.5-8.0；称取30mg阿霉素(DOX)溶解于10mL DMSO中，得DOX溶液；将DOX溶液逐滴加入CMCS-AZO溶液中，室温下避光磁力搅拌24h，分别以DMSO和去离子水的混合液3:7透析24h,再以去离子水进行透析48h，去除有机溶剂及其他杂质，5000rpm离心，上清液冷冻干燥后得到CMCS-AZO-DOX高分子前药粉末。

(3)称取5mg丹参酮IIA(TSIIA)溶解于5mLDMSO中，配制TSIIA溶液，称取30mgCMCS-AZO-DOX高分子前药溶于30mL去离子水中，配制成前药溶液，在室温磁力搅拌下，将TSIIA溶液逐滴加入前药溶液中，避光，室温下磁力搅拌4h，将其转移到超声波细胞粉碎机，探头在低温下超声3.0s，间歇2.0s，功率为90w的脉冲方式低温超声粉碎10min，超声5min,即得包载TSIIA的CMCS-AZO-DOX的纳米粒溶液，将纳米粒溶液分装在分子量为3500Da的透析袋中，以去离子水为透析介质，透析24h后冷冻干燥，即得纳米粒冻干粉末。

本实例中制得的双药纳米粒采用高效液相色谱法测得载药量为9.08％，包封率为73.59％。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于：本实施例在(3)中称取5mg丹参酮IIA(TSIIA)溶解于5mLDMSO中，配制TSIIA溶液；称取10mgCMCS-AZO-DOX高分子前药溶于10mL去离子水中,其他制备原料组成以及一种阿霉素与丹参酮IIA联合抗肿瘤纳米传递系统的制备过程同实施例1。

本实例中制得的双药纳米粒采用高效液相色谱法测得载药量为17.87％，包封率为51.76％。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于：本实施例在(3)中称取5mg丹参酮IIA(TSIIA)溶解于5mLDMSO中，配制TSIIA溶液；称取20mgCMCS-AZO-DOX高分子前药溶于20mL去离子水中,其他制备原料组成以及一种阿霉素与丹参酮IIA联合抗肿瘤纳米传递系统的制备过程同实施例1。

本实例中制得的双药纳米粒采用高效液相色谱法测得载药量为9.33％，包封率为53.19％。

实施例4

本实施例与实施例1的区别在于：本实施例在(3)中称取5mg丹参酮IIA(TSIIA)溶解于5mLDMSO中，配制TSIIA溶液；称取40mgCMCS-AZO-DOX高分子前药溶于40mL去离子水中,其他制备原料组成以及一种阿霉素与丹参酮IIA联合抗肿瘤纳米传递系统的制备过程同实施例1。

本实例中制得的双药纳米粒采用高效液相色谱法测得载药量为6.37％，包封率为63.07％。

实施例5

本实施例与实施例1的区别在于：本实施例在(3)中称取5mg丹参酮IIA(TSIIA)溶解于5mLDMSO中，配制TSIIA溶液；称取50mgCMCS-AZO-DOX高分子前药溶于50mL去离子水中,其他制备原料组成以及一种阿霉素与丹参酮IIA联合抗肿瘤纳米传递系统的制备过程同实施例1。

本实例中制得的双药纳米粒采用高效液相色谱法测得载药量为6.21％，包封率为60.16％。

实施例6

阿霉素与丹参酮IIA联合给药纳米粒的粒径分布实验：

将实施例1中制备的阿霉素与丹参酮IIA双药纳米粒用去离子水超声溶解，制备成1mg/mL的溶液，通过马尔文粒度仪进行测量，获得的粒径分布情况如图1所示，由图1可知，双药纳米粒的平均粒径为216.7nm，主要分布在180-230nm之间，分散均匀，呈正态分布，表明该纳米粒在EPR效应的介导更易于在肿瘤部位聚集。

实施例7

阿霉素与丹参酮IIA联合给药纳米粒的体外释放实验

将实施例1制备的纳米粒进行体外释放研究，获得的体外释放曲线如图2所示，阿霉素与丹参酮IIA都具有良好的缓释特点，且具备缺氧敏感性，两种药物在pH 5.0、缺氧的条件下释放较快，在pH 7.4、常氧的条件下释放较慢，此数据表明所制备的双药纳米粒具有良好的缺氧响应性，针对肿瘤微环境进行给药具有较好的应用前景。

实施例8

阿霉素与丹参酮IIA联合给药纳米粒的稳定性研究

将实例1中制备的双药纳米粒在4℃低温放置一周，一周内每天进行取样，分别对其粒径和PDI值进行测定，结果如图3(A)所示，双药纳米粒的粒径和PDI值变化不明显，说明双药纳米粒具有良好的稳定性和分散性；将实例1中制备的双药纳米粒分别用去离子水、PBS、生理盐水、DMEM培养基溶解，对其粒径和PDI值进行测定，结果如图3(B)所示，双药纳米粒在不同溶剂中粒径较稳定，无明显区别，分散性能也较好。

实施例9

阿霉素与丹参酮IIA联合给药纳米粒在常氧和低氧条件下作用于4T1乳腺癌细胞24h后的细胞毒性研究

将作为对照的游离阿霉素原料药、游离丹参酮IIA原料药、阿霉素单药纳米粒及实施例1中制备的双药纳米粒分别用于4T1细胞毒性实验研究，具体步骤如下：取对数生长期的4T1细胞用胰蛋白酶消化后，用培养基稀释，以5000个/孔加入96孔板中，孵育24h,再分别用游离阿霉素原料药、游离丹参酮IIA原料药、阿霉素单药纳米粒和实施例1中制备的双药纳米粒替换原培养液，所有溶液浓度以阿霉素浓度为准折算成0.25-2.0umol/L，每个浓度设置6个复孔，孵育24h后，每孔用100uL含10％的CCK-8的培养液进行替换，继续孵育2h。测得细胞毒性结果如下图4(A)和图4(B)所示。由图4可知，所制备的纳米粒对于4T1细胞抑制作用最强，与两种游离原料药比较具有显著差异，在乳腺癌的临床治疗上具有良好的应用前景。

本发明所列举的各原料，以及本发明各原料的上下限、区间取值，以及工艺参数(如温度、时间等)的上下限、区间取值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。

以上所述是本发明的优选实施方式而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和变动，这些改进和变动也视为本发明的保护范围。