一种利用牛血清生产体外诊断试剂专用酶稀释液的方法

技术领域

本发明属于体外诊断试剂技术领域，涉及一种利用牛血清生产体外诊断试剂专用酶稀释液的方法。

背景技术

体外诊断试剂是可单独使用或与仪器、器具、设备或系统组合使用，对人体样本在体外进行检查，用于对样本中的某种成分进行检测或测量的体外诊断检验程序的化学、生物学或免疫学等物质，质量稳定可靠的体外诊断试剂能够提供准确的临床检验数据，在疾病的预防和控制以及疾病的及时诊治方面发挥了重要作用。

酶是体外诊断工业的重要原料，是临床化学和分子诊断的核心原料，也是免疫诊断中酶-底物信号体系中不可或缺的成分。酶是生物催化剂，是由组织细胞合成的、具有生物催化功能的蛋白质(少数是核酸)，对化学反应有强的催化性，对底物有极高的选择性(包括对底物的种类，底物的区域，位点和立体的选择性)，一种酶只能够催化一种底物的一种反应，反应的转化率和产率很高，几乎没有副反应。酶的特性使得其在临床检验，化学分析和特定产品生产上优势远远超过其他化学方法。一般来说，健康人体内酶活性和酶量相对恒定，当人体某些器官和组织发生病变时，特定的酶被释放入血、尿或体液中，与之相关的酶量或者活性会发生相应的变化。

现有体外诊断试剂专用酶稀释液大多是利用胎牛或3-6个月的小牛取血，提取其血清进行制备而成，稳定性和灵敏度都较高，但是成本都较高，也不利用小牛的生长，因此，如何利用成本较低的成年牛血清生产出稳定性和灵敏度都较高体外诊断试剂专用酶稀释液，成为了现阶段人们亟待解决的问题。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明采用提供一种利用牛血清生产体外诊断试剂专用酶稀释液的方法，具体包括如下步骤：

S1、采血：在成年牛颈部采血600-800ml，采血方式为全封闭无菌袋静脉采血；

S2、温水浴：将装满血液的全封闭无菌血袋转移到37℃温水浴静置40-50分钟，期间上下翻转2-3次；静置会产生悬浮物，翻转是为了防止挂壁物质产生以及均匀受热，温水浴促进部分血小板的析出，将其去除；

S3、冰水浴：将S2处理后的全封闭无菌血袋快速转移到冰水浴中，静置50-70分钟；冰水浴可促进红细胞快速收缩、不易破裂，后将红细胞去除，以免影响后期血清的颜色和引入不必要的杂质；

S4、一次离心：将S3处理后的全封闭无菌血袋置于离心机内进行一次离心处理35-40分种，取一次上清液；

S5、二次离心：将S4处理的一次上清液加入离心机内进行二次离心处理35-40分种，取二次上清液；

S6、冷冻保存：将上清液转移到负压血袋中，-15℃以下冷冻保存；

S7、解冻：将负压血袋中冷冻保存的一次上清液进行解冻，所述解冻方法为分段温控解冻，具体操作方法为：在0℃-4℃放置5-7小时，在4℃-8℃放置5-7小时，在8℃-16℃放置5-7小时；

S8、一次超滤：将解冻后的二次上清液通过1000kDa中空纤维超滤膜进行一次超滤，得到一次透过液和一次浓缩液；

S9、二次超滤：将一次透过液通过100kDa中空纤维超滤膜进行二次超滤，得到二次透过液和二次浓缩液；

S10、三次超滤：将二次透过液通过100kDa中空纤维超滤膜进行三次超滤，得到三次透过液和三次浓缩液；

S11、成品制作：将三次透过液加入磷酸溶液中稀释，除菌后封袋保存。

而且，对成年牛采血的频率为一个月2-3次。

而且，一次离心时离心机的离心力为4800g-5000g。

而且，二次离心时离心机的离心力为11000g-13000g。

而且，一次上清液加入离心机的进液速度为0.5L/min-0.8L/min。

而且，所述除菌方法为：将混合液通过0.22um的PVDF膜。

而且，所述磷酸溶液的浓度为0.05mol/L，PH值为7.5。

本发明的有益效果如下：

1、本发明采用成年牛血清代替胎牛或小牛采血生产体外诊断试剂专用酶稀释液，成年牛血清的成本约为小牛及胎牛的30％，本发明很大程度上节约了体外诊断试剂专用酶稀释液的成本，可以大规模推广，同时也保证了体外诊断试剂专用酶稀释液的稳定性和灵敏度。

2、本发明采取37℃温水浴和冰水浴处理。温水浴可以使血小板释放出许多物质，使凝血因子发生变化，冰水浴可以激活凝血反应，血液迅速凝固，形成胶冻，纤维蛋白原转变成纤维蛋白块，有效减少血小板和红细胞的破裂，保证血清颜色清亮不偏红、减少纤维蛋白、增加血清出清量。

附图说明

图1为本发明生产体外诊断试剂专用酶稀释液的流程图。

具体实施方式

实施例1

一种利用牛血清生产体外诊断试剂专用酶稀释液的方法，包括如下步骤：

S1、采血：在成年牛颈部采血600ml，采血方式为全封闭无菌袋静脉采血；

S2、温水浴：将装满血液的全封闭无菌血袋转移到37℃温水浴静置40分钟，期间上下翻转2次；

S3、冰水浴：将S2处理后的全封闭无菌血袋快速转移到冰水浴中，静置50-70分钟；

S4、一次离心：将S3处理后的全封闭无菌血袋置于离心机内进行一次离心处理35分种，取一次上清液；

S5、二次离心：将S4处理的一次上清液加入离心机内进行二次离心处理35分种，取二次上清液；

S6、冷冻保存：将上清液转移到负压血袋中，-15℃以下冷冻保存；

S7、解冻：将负压血袋中冷冻保存的一次上清液进行解冻，所述解冻方法为分段温控解冻，具体操作方法为：在0℃放置5小时，在4℃放置5小时，在8℃放置5小时；

S8、一次超滤：将解冻后的二次上清液通过1000kDa中空纤维超滤膜进行一次超滤，得到一次透过液和一次浓缩液；

S9、二次超滤：将一次透过液通过100kDa中空纤维超滤膜进行二次超滤，得到二次透过液和二次浓缩液；

S10、三次超滤：将二次透过液通过100kDa中空纤维超滤膜进行三次超滤，得到三次透过液和三次浓缩液；

S11、成品制作：将三次透过液加入磷酸溶液中稀释，除菌后封袋保存。

进一步地，对成年牛采血的频率为一个月2次。

进一步地，一次离心时离心机的离心力为4800g。

进一步地，二次离心时离心机的离心力为11000g。

进一步地，一次上清液加入离心机的进液速度为0.5L/min。

进一步地，所述除菌方法为：将混合液通过0.22um的PVDF膜。

进一步地，所述磷酸溶液的浓度为0.05mol/L，PH值为7.5。

实施例2

一种利用牛血清生产体外诊断试剂专用酶稀释液的方法，包括如下步骤：

S1、采血：在成年牛颈部采血800ml，采血方式为全封闭无菌袋静脉采血；

S2、温水浴：将装满血液的全封闭无菌血袋转移到37℃温水浴静置50分钟，期间上下翻转3次；

S3、冰水浴：将S2处理后的全封闭无菌血袋快速转移到冰水浴中，静置50-70分钟；

S4、一次离心：将S3处理后的全封闭无菌血袋置于离心机内进行一次离心处理40分种，取一次上清液；

S5、二次离心：将S4处理的一次上清液加入离心机内进行二次离心处理40分种，取二次上清液；

S6、冷冻保存：将上清液转移到负压血袋中，-15℃以下冷冻保存；

S7、解冻：将负压血袋中冷冻保存的一次上清液进行解冻，所述解冻方法为分段温控解冻，具体操作方法为：在4℃放置7小时，在8℃放置7小时，在16℃放置7小时；

S8、一次超滤：将解冻后的二次上清液通过1000kDa中空纤维超滤膜进行一次超滤，得到一次透过液和一次浓缩液；

S9、二次超滤：将一次透过液通过100kDa中空纤维超滤膜进行二次超滤，得到二次透过液和二次浓缩液；

S10、三次超滤：将二次透过液通过100kDa中空纤维超滤膜进行三次超滤，得到三次透过液和三次浓缩液；

S11、成品制作：将三次透过液加入磷酸溶液中稀释，除菌后封袋保存。

进一步地，对成年牛采血的频率为一个月3次。

进一步地，一次离心时离心机的离心力为5000g。

进一步地，二次离心时离心机的离心力为13000g。

进一步地，一次上清液加入离心机的进液速度为0.8L/min。

进一步地，所述除菌方法为：将混合液通过0.22um的PVDF膜。

进一步地，所述磷酸溶液的浓度为0.05mol/L，PH值为7.5。

实施例3

一种利用牛血清生产体外诊断试剂专用酶稀释液的方法，包括如下步骤：

S1、采血：在成年牛颈部采血700ml，采血方式为全封闭无菌袋静脉采血；

S2、温水浴：将装满血液的全封闭无菌血袋转移到37℃温水浴静置45分钟，期间上下翻转3次；

S3、冰水浴：将S2处理后的全封闭无菌血袋快速转移到冰水浴中，静置50-70分钟；S4、一次离心：将S3处理后的全封闭无菌血袋置于离心机内进行一次离心处理38分种，取一次上清液；

S5、二次离心：将S4处理的一次上清液加入离心机内进行二次离心处理38分种，取二次上清液；

S6、冷冻保存：将上清液转移到负压血袋中，-15℃以下冷冻保存；

S7、解冻：将负压血袋中冷冻保存的一次上清液进行解冻，所述解冻方法为分段温控解冻，具体操作方法为：在2℃放置6小时，在6℃放置6小时，在12℃放置6时；

S8、一次超滤：将解冻后的二次上清液通过1000kDa中空纤维超滤膜进行一次超滤，得到一次透过液和一次浓缩液；

S9、二次超滤：将一次透过液通过100kDa中空纤维超滤膜进行二次超滤，得到二次透过液和二次浓缩液；

S10、三次超滤：将二次透过液通过100kDa中空纤维超滤膜进行三次超滤，得到三次透过液和三次浓缩液；

S11、成品制作：将三次透过液加入磷酸溶液中稀释，除菌后封袋保存。

进一步地，对成年牛采血的频率为一个月2次。

进一步地，一次离心时离心机的离心力为4900g。

进一步地，二次离心时离心机的离心力为12000g。

进一步地，一次上清液加入离心机的进液速度为0.6L/min。

进一步地，所述除菌方法为：将混合液通过0.22um的PVDF膜。

进一步地，所述磷酸溶液的浓度为0.05mol/L，PH值为7.5。

对比例1

本对比例除没有进行三次超滤外，其他均与实施例3相同。

对比例2

本对比例除没有进行温水浴及冰水浴外，其他均与实施例3相同。

对比例3

本对比例除没有分段温控解冻，采用12℃温度下放置10小时解冻外，其他均与实施例3相同。

实验部分

实验1：

用HAV-IgM酶结合物溶液(1:2000)检测血清或血浆标本中的HAV，采用如下步骤：

(1)在已包被HAV-IgM抗原的微孔板中依次加入标本50ul，同时做两孔阴性对照、一孔阳性对照、一孔空白对照，然后每孔(除空白对照孔外)分别加入胎牛、小牛、成牛的抗HAV-IgM酶结合物溶液50ul，置37℃孵育30分钟。

(2)弃去孔内液体，用洗涤液洗板5次。

(3)各孔加底物溶液A 50ul，底物液B 50ul，置37℃孵育15分钟。

(4)各孔加终止液50ul，终止反应。

(5)将反应板置酶标仪比色计450nm波长处用空白孔校零，读取各孔OD值。

(6)计算，CutOff值＝(阴性对照平均OD值+阳性对照平均OD值)X0.5。

(7)结果判断：标本OD值小于CutOff值为阳性，大于或等于CutOff值为阴性。

在已包被HAV-IgM抗原的微孔板中加入经系列稀释的抗体，按照常规反应过程进行试验，分别对比传统甲状腺素酶结合物和本发明酶结合物，加显色剂显色，用2M硫酸溶液终止反应后，在酶标仪上读数，结果如下：

以上数据表明，成牛血清酶连免疫体外诊断试剂中酶稀释液的稳定性和灵敏度都与胎牛及小牛差异不大。

实验2：

不同年龄段牛血清HAV抗原检测试剂盒(ELSA)酶结合物稀释液稳定性，不同血清酶结合物稀释液编号和内容如下：

①PBST缓冲液+胎牛血清无关蛋白为稳定剂的酶结合物稀释液的试剂盒为第一组合；

②PBST缓冲液+小牛血清无关蛋白为稳定剂的酶结合物稀释液的试剂盒为第二组合；

③PBST缓冲液+成牛血清无关蛋白为稳定剂的酶结合物稀释液的试剂盒为第三组合；

用三种组合的HAV抗体酶联免疫诊断试剂盒分别对质控血清进行检测。按中国生物制品规程要求分别进行对40℃放置试剂盒的检测和37℃放置3d试剂盒的破坏性稳定性检测。

例1：

酶结合物稀释液的组分及浓度为

组分1(PBST缓冲液)

用HCL调节溶液的PH值至7.4，加蒸馏水至1000mL，4℃存放；组分2(稳定剂)

胎牛血清0.1g

加洗涤缓冲液至100mL，4℃存放备用。

例2：

酶结合物稀释液的组分及浓度为

组分1(PBST缓冲液)

用HCL调节溶液的PH值至7.4，加蒸馏水至1000mL，4℃存放；组分2(稳定剂)

小牛血清0.1g

加洗涤缓冲液至100mL，4℃存放备用。

例3

酶结合物稀释液的组分及浓度为

组分1(PBST缓冲液)

用HCL调节溶液的PH值至7.4，加蒸馏水至1000mL，4℃存放；组分2(稳定剂)

成牛血清0.1g

加洗涤缓冲液至100mL，4℃存放备用。

操作时为保证酶结合物稀释液为同一条件下进行对比，用同一批HAV抗原检测试剂(ELISA)。同时配制以上三种不同酶稀液的抗HAV酶结合物，组成三组试剂盒，对这三组试剂盒作平行对比实验。

实验时严格按试剂盒说明书进行操作，每一组合加阴性对照、阳性对照各5孔，加1Ncu/ml，2Ncu/ml HAV血清各10孔，1份阳性质控血清(以P表示)加10孔，30份HAV阴性血清各加1孔，共加样70份。计算出阴性对照、阳性对照、1Ncu/ml，2Ncu/ml、阳性质控血清P的平均S/CO值和30份抗HAV阴性血清的平均S/CO值。

酶标抗体活性验证：

表1四种试剂盒放置4℃检测质控血清的S/CO平均值及实验结果

表1显示四种试剂盒放置4℃对样品检测结果的S/CO值各平均值差异不大，阴、阳性结果分明。

表2 四种试剂盒37℃放置3d检测质控血清的S/CO平均值及实验结果

表2显示四种试剂盒放置37℃3d对样品检测结果的S/CO值平均值差异较明显。

三种试剂盒检测质控血清试验结果分析:从三种酶结合物稀释液编号和内容中可以看出:胎牛血清①酶结合物稀释液用酶量最少，②、③酶结合物稀释液用酶量稍微高一点。从表1看实验结果，可以看出三种不同酶稀液的组合实验结果基本相同，无太大差异。从表2看，①、②、③液试剂盒实验结果稳定性较好，各阴性、阳性的S/CO值和4℃的S/CO值相比变化很小，说明稳定性好，本底好。

从上述实验结果可知，③液试剂有极轻微混浊现象，且我们曾在4℃放置一段时间(lm)后基本无沉淀产生，说明③液稳定，而且，相比①、②液来说成本较低。可以将③液酶稀液用于HAV核心抗原检测试剂盒(ELISA)的大量生产。

本发明提供的成牛血清酶结合物稀释液，不仅可以在2～8℃和37℃环境中稳定长期保存，稳定性良好，可以长久应用，而且也节约了成本，既经济又方便使用。

实验3

将以上实施例与对比例获得的体外诊断试剂专用酶稀释液成品进行血清指标测定，具体实验方法如下表3所示：

表3血清指标的测定方法

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具体测得的实验数据如表4所示：

表4体外诊断试剂专用酶稀释液成品指标

通过表4可以看出，本发明的实施例得到的成品测得的总蛋白、血红蛋白、高密度脂蛋白、总胆红素、总胆固醇、甘油三酯、γ球蛋白的含量均较对比例少，说明本发明采用的技术方案为较佳的技术方案。