二苯基庚烷化合物在制备治疗慢阻肺和/或炎症免疫疾病药物中的应用

技术领域

本发明属于药物开发领域，具体涉及到一种二苯基庚烷成分在制备治疗慢阻肺药物或炎症免疫疾病药物中的应用。

背景技术

慢阻肺即慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)，是一种以不完全气流受限呈进行性发展为特征的慢性呼吸系统疾病，可导致患者呼吸功能逐渐下降[D.S.Postma,K.F.Rabe,N.Engl.J.Med.373(2015):1241-1249]。据世界卫生组织(WHO)数据显示，全球目前有6亿人患有慢阻肺，而我国慢阻肺死亡率居各国之首，与高血压、糖尿病、癌症病种组合成了最主要的慢性病[W.J.Guan,P.X.Ran,N.S.Zhong,LancetResp.Med.4(2016)428-430；G.P.Hu,N.Zhong,P.Ran,J.Thorac.Dis.7(2015)59-66]，但慢阻肺治疗药物的研发严重落后于癌症、高血压和糖尿病，已成为人类健康的“沉默杀手”。因此，开展抗慢阻肺的药物研究是人类健康的迫切需求，具有重要的意义和价值。

中药在治疗复杂慢性疾病方面具有确切的临床疗效和较小的毒副作用，慢阻肺属于中医学“喘症”、“肺胀”、“痰饮”等范畴，以咳嗽、咯痰、呼吸气短、喘息为本病的主要证候，中医十分强调在治疗上以益气补肾、清热活血为法[周胜利,中医药临床杂志,28(2016):895-897]。传统中药莪术具有行气破血、活血化瘀之功效[王德立,安徽农业科学,42(2014):3240-3242]，是中医治疗慢阻肺的常用中药，临床研究结果表明配有莪术的补肺益肾冲剂的中医证候总体疗效为93.8％，在改善咳嗽、咯痰、喘息等症状以及肺功能方面明显优于对照组且未发现不良反应[王坤根,中国中西医结合杂志,24(2004):555-556]；单味药莪术在小儿急性呼吸道感染、慢性支气管炎等疾病的治疗上也获得良好疗效[徐明,薛业群,葛必胜.湖北中医杂志,26(2004):19-19]；因此从莪术中发现抗COPD活性分子是一种有效途径。

通过对莪术中化合物的筛选，我们发现了一种二苯基庚烷化合物——1-(4-羟基-5-甲氧基苯基)-7-(4,5-二羟基苯基)-3,5-二羟基庚烷，它具有激动肾上腺素能beta2受体和抑制核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)的双靶点活性，在小鼠巨噬细胞炎症模型上能较好抑制NO的产生，在脂多糖联合烟雾提取物诱导的A549肺部细胞慢阻肺体外模型上能抑制ERK的磷酸化及NLRP3炎症小体的表达，显示出了良好的抗慢阻肺活性，而目前尚未发现有关此化合物在制备治疗COPD药物中应用的报道。

发明内容

本发明提供了莪术中的一种二苯基庚烷化合物——1-(4-羟基-5-甲氧基苯基)-7-(4,5-二羟基苯基)-3,5-二羟基庚烷在制备治疗慢阻肺药物或炎症免疫疾病药物中的应用，所述二苯基庚烷化合物具有如下结构：

本发明所述的应用，所述抗慢阻肺药物为由1-(4-羟基-5-甲氧基苯基)-7-(4,5-二羟基苯基)-3,5-二羟基庚烷化合物作为活性成分与药用载体制成的药物组合物。

本发明所述的应用，所述1-(4-羟基-5-甲氧基苯基)-7-(4,5-二羟基苯基)-3,5-二羟基庚烷化合物在制备核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白(NLRP3)抑制剂的应用。

本发明所述的应用，所述1-(4-羟基-5-甲氧基苯基)-7-(4,5-二羟基苯基)-3,5-二羟基庚烷化合物在制备治疗或改善NLRP3炎症小体相关的炎症免疫性疾病的药物中的应用。

本发明所述的应用，其所述药物组合物为片剂、粉末、胶囊剂、滴丸、颗粒剂、气雾剂、乳液剂或注射剂。

本发明的二苯基庚烷化合物具有激动肾上腺素能beta2受体和抑制核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)的双靶点活性，在脂多糖诱导的RAW 264.7小鼠巨噬细胞炎症模型上能较好抑制NO的产生，其IC

附图说明

图1：1-(4-羟基-5-甲氧基苯基)-7-(4,5-二羟基苯基)-3,5-二羟基庚烷化合物在肾上腺素受体Beta2靶点上的活性。

图2：1-(4-羟基-5-甲氧基苯基)-7-(4,5-二羟基苯基)-3,5-二羟基庚烷化合物在RAW 264.7小鼠巨噬细胞炎症模型上的抗炎活性评价。

图3：1-(4-羟基-5-甲氧基苯基)-7-(4,5-二羟基苯基)-3,5-二羟基庚烷化合物在脂多糖联合烟雾提取物诱导的A549肺部细胞慢阻肺体外模型上的活性评价。

具体实施方式

现结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

莪术中的二苯基庚烷化合物——1-(4-羟基-5-甲氧基苯基)-7-(4,5-二羟基苯基)-3,5-二羟基庚烷化合物(莪术化合物)来自课题组的制备。制备过程如下：将莪术根茎5kg切片，以莪术根茎10倍重量的体积浓度70％乙醇回流提取，固液分离，固体重复回流提取和固液分离过程2次，共提取3次，每次2小时，合并提取液，60℃真空旋转蒸发浓缩至5.7L体积。先后分别其用3倍量(V/V)正庚烷和3倍量(V/V)乙酸乙酯各萃取4次，获得乙酸乙酯层，60℃真空旋转蒸发浓缩至干；使用体积浓度50％甲醇/水溶解上述样品，然后溶液用Sigma 3K15高速离心机(10,000r/min,5min)离心，取上清液过0.45μm有机滤膜，浓度为58.4mg/mL；将上述样品在C18ME上进行第一维制备，流动相为：A-MeOH(甲醇)，B-0.1％FA/H

Beta2受体激动剂沙丁胺醇(品牌：Sigma)购自美国Merck公司。Beta2受体拮抗剂普萘洛尔(品牌：Tocris)购自上海优宁维生物科技股份有限公司。LPS：E.Coli 055：B5(Sigma，产品编号：L6529)购自美国Merck公司。小白菊内酯(品牌：Aladdin)购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。Griess试剂盒购买于(品牌：Beyotime)上海碧云天生物技术有限公司。CCK8试剂盒(品牌：Beyotime)、PMSF(品牌：Beyotime)、RIPA裂解液(品牌：Beyotime)、BCA试剂盒(品牌：Beyotime)、SDS-PAGE凝胶试剂盒(品牌：Beyotime)、电泳液(品牌：Beyotime)、转膜液(品牌：Beyotime)和TBST(品牌：Beyotime)购自上海碧云天生物科技有限公司。NLRP3抗体(品牌：AdipoGen)、p-ERK抗体(品牌：cell signalingtechnology)购自优宁维公司、GAPDH抗体(品牌：cell signaling technology)、抗兔二抗(品牌：cell signaling technology)、抗小鼠二抗(品牌：cell signaling technology)购自上海优宁维生物科技股份有限公司。ECL化学发光液(品牌：Solarbio)购自北京索莱宝公司。人皮肤鳞癌细胞(A431，内源高表达Beta2受体)、小鼠巨噬细胞(RAW264.7)和人非小细胞肺癌细胞(A549)购于中国科学院上海细胞库。McCoy’s 5A粉末培养基购于Sigma。DMEM培养液、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)、Hank's平衡盐溶液和4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液购于Gibco公司。氨苄青霉素、硫酸链霉素、磷酸缓冲液(PBS)和二甲基亚砜(DMSO)购于BIOBASIC INC(BBI)。CO2恒温培养箱和超净台购于Thermo，低速离心机购于Sigma，显微镜购于OLYMPUS，恒温水浴锅购于Julabo，Epic检测平台及

实施例1：化合物对肾上腺素受体Beta2靶点的活性

将处于对数生长期的A431细胞，接种于细胞兼容的EPIC384微孔板中，所用培养基为DMEM培养液(含体积浓度10％FBS)，每孔的接种体积为40μL，接种密度为2.0×10

首先是激动分析，将10μL不同终浓度(138μM,69μM,34.5μM,17.25μM,8.63μM,4.31μM,2.16μM,1.08μM,0.54μM,0.27μM)的莪术化合物(1-(4-羟基-5-甲氧基苯基)-7-(4,5-二羟基苯基)-3,5-二羟基庚烷)加入到培养好的A431细胞微孔板中，然后在

然后使用脱敏分析的方法验证化合物作用于β

最后使用拮抗分析方法验证化合物作用于β

实施例2：化合物的细胞抗炎活性评价

将莪术化合物1-(4-羟基-5-甲氧基苯基)-7-(4,5-二羟基苯基)-3,5-二羟基庚烷作用于脂多糖(LPS)诱导的RAW 264.7小鼠巨噬细胞，用Griess试剂显色法检测细胞培养上清液中NO水平，以受试药物抑制NO释放的能力作为筛选指标，评价化合物的抗炎活性。取对数生长期的RAW 264.7细胞，接种到96孔板中(2×104cell/well，100μL)，培养24h。弃去培养基，加入90μL已经配制好的小白菊内酯(5μM)和莪术化合物(终浓度分别：100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、3.13μM和1.56μM)，培养箱中孵育1h，然后加入10μL的1μg/mL的LPS共孵育24h，使培养液中LPS的终浓度为100ng/mL。培养24h之后，按照一氧化氮检测试剂盒说明书进行NO检测，首先将试剂盒中的Griess ReagentⅠ和Ⅱ试剂按照所需的量取出，恢复室温。然后用DMEM培养基稀释标准品，使标准品的浓度为0μM、1μM、2μM、5μM、10μM、20μM、40μM、60μM、100μM。然后在96孔板中分别加入50μL的标准品和待测细胞上清，随后依次加入恢复室温的Griess ReagentⅠ和Ⅱ试剂。加完所有试剂之后，用EnSight酶标仪在540nm处测定每孔的吸光度。最后，根据标准品的浓度和吸光度制作标准曲线，然后根据标准曲线计算出待测细胞上清中的NO浓度。莪术化合物对RAW 264.7细胞的NO抑制作用(IC

使用CCK8试剂盒检测莪术化合物的细胞毒性，以细胞存活率作为评价指标。取对数生长期的RAW 264.7细胞，接种到96孔板中(2×10

实施例3：化合物的抗慢阻肺体外活性评价

将处于对数生长期的A549细胞接种于6孔板中，所用培养基为DMEM+10％FBS(体积浓度)，每孔接种细胞数目5×10

随即进行SDS-PAGE凝胶电泳。上层浓缩胶中的SDS-PAGE浓度为5％(V/V)，下层分离胶中的SDS-PAGE浓度为8％(V/V)。电泳条件80V，30min→110V，50min。随后转膜，将蛋白转移至固相支持物PVDF膜上条件为恒流200mA，90min。再经5％脱脂牛奶室温封闭2h。一抗4℃过夜孵育(NLRP3(1:250，V/V)，p-ERK(1:1000，V/V)，GAPDH(1:2000，V/V)。1×TBST室温洗膜30min，每10min更换一次TBST。二抗室温孵育2h。再经1×TBST室温洗膜45min，每15min更换一次TBST。ECL化学发光液浸润PVDF后在扫膜仪下曝光显影，并对条带进行统计学分析。

如图3所示，脂多糖联合烟雾提取物(LPS+CSE)刺激后，各处理组内参蛋白GAPDH表达基本保持一致，ERK表达基本一致，p-ERK和NLRP3显著升高表达，阳性药物罗氟司特(10μM)处理降低了p-ERK和NLRP3的表达，莪术化合物(25μM)处理后也能使p-ERK和NLRP3的表达较造模组降低。由此可见，莪术化合物在脂多糖联合烟雾提取物诱导的A549肺部细胞慢阻肺体外模型上具有较好活性。