牛肉嫩度预测模型的构建方法与应用

技术领域

本发明涉及肉类品质评价领域，具体地说，涉及牛肉嫩度预测模型的构建方法与应用。

背景技术

随着生活水平的日益改善，肉在人们日常饮食中占有越来越重要的地位。同时，对肉的要求不仅仅满足于量的增加，同时也对质提出了更高的标准。对于肉的评价通常有以下五个指标：嫩度、颜色、风味、多汁性和系水力。其中嫩度是决定肉食用品质的最重要的指标，肉的商用价值在很大程度上取决于嫩度状况。在现今消费观念中，消费者愿意花更多的钱来买高品质的肉

肉从屠宰后到生鲜肉的消费或加工需要一定的时间，而肉在成熟车间进行成熟一般48h左右，然后就要对其进行分级，因此有必要利用出厂前测定的指标来预测产品的最终嫩度，以提高产品分级的准确性和时效性。关于嫩度的预测，国内外学者已做出大量工作，分别研究了肌原纤维小片化指数(MFI)、pH、近红外等与嫩度的关系，并建立了一些预测模型，但都只是研究单一或少数几个指标对嫩度的影响，未能系统地进行研究。

发明内容

本发明的目的是提供牛肉嫩度预测模型的构建方法与应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种牛肉嫩度预测模型的构建方法，牛被屠宰后，取牛背最长肌，样品排酸后，于0-4℃条件下进行成熟，然后分别测定样品成熟53h的剪切力，样品成熟24h的pH值，样品成熟53h的黄度指数，样品成熟53h的Nebulin蛋白的相对含量以及样品成熟168h的Troponin-T蛋白的30kDa特征降解产物的相对含量；以上述指标为自变量，样品成熟14天的剪切力为因变量，分别建立如下I～XII牛肉嫩度预测模型；

I：0.469+0.3674A；

II：-2.665+1.0653B；

III：-3.0371+0.8614C；

IV：-2.3733+9.8805D；

V：5.7842-10.3851E；

VI：-0.3953+0.3297A+0.2031B；

VII：-1.3305+0.2346A+4.8703D；

VIII：3.220+0.2035A-6.3624E；

IX：2.7097+3.9852D-7.1782E；

X：2.8381+0.1204A+1.1404D-5.7453E；

XI：2.7812+0.1953A-0.0826B+1.4332D-5.7584E；

XII：2.6678+0.1109A-0.1176B+0.4895C-2.1447D-8.3766E。

其中，A代表样品成熟53h的剪切力，B代表样品成熟24h的pH值，C代表样品成熟53h的黄度指数，D代表样品成熟53h的Nebulin蛋白的相对含量，E代表样品成熟168h的Troponin-T蛋白的30kDa特征降解产物的相对含量。

进一步地，样品剪切力的测定方法包括：去除牛背最长肌样品表面的结缔组织、脂肪后，切成大小为2.5cm×2.5cm×2.5cm的肉块，用85℃水浴加热至肉块中心温度80℃，保持20min，然后冷却至室温，用取样器(直径1.27cm)沿肌纤维方向在每块肉样上钻取5-8个肉柱，用剪切力仪垂直肌纤维方向测定剪切力，取平均值，即为该样品的剪切力。

样品黄度指数的测定方法包括：用刀切牛背最长肌获得一新鲜切面，然后在自然光下放置15-20min，用色差计进行测定，每个样品测定三次，取其平均值；L值代表亮度指数，a值代表红度指数，b值代表黄度指数。

样品中Nebulin蛋白的相对含量的测定方法包括：

Nebulin大分子蛋白电泳可参考Huff-Lonergan的方法(Huff-Lonergan E,Mitsuhashi T,Parrish F C,Robson R M.Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis and western blotting comparisons of purified myofibrils andwhole muscle preparations for evaluating titin and nebulin in postmortembovine muscle[J].Journal of Animal Science,1996,74(4):779-785.)，采用胶浓度5％的连续变性电泳(丙烯酰胺:甲叉双丙烯酰胺＝100:1[w/w],200mM Tris-HCl pH8.0，0.067％的TEMED[w/v]，0.1％的APS[w/v]，0.1％的SDS[w/v])。Troponin-T蛋白采用12.5％的分离胶(丙烯酰胺:甲叉双丙烯酰胺＝37.5:1[w/w],0.5M Tris-HCl pH8.8，0.05％的TEMED[w/v]，0.05％的APS[w/v]，0.1％的SDS[w/v])，4％的浓缩胶(丙烯酰胺:甲叉双丙烯酰胺＝37.5:1[w/w],125mM Tris-HCl pH6.8，0.05％的TEMED[w/v]，0.05％的APS[w/v]，0.1％的SDS[w/v])。电极缓冲液为25mM Tris，192mM甘氨酸和0.1％的SDS[w/v]。5％的胶上样量80μg，12.5％和10％的胶上样量均为20μg。

对Nebulin条带利用Quantity One进行分析，测定其斑点密度，以0d样品的斑点密度作为内标，其它同一块板中Nebulin条带所测得的值和内标相比后所得到的数值作为Nebulin蛋白的相对含量。

样品中Troponin-T蛋白的30kDa特征降解产物的相对含量的测定方法包括：30kDa条带的光密度值与免疫印迹检测到所有Troponin-T条带的光密度值的比例。

第二方面，本发明提供按照上述方法构建的牛肉嫩度预测模型在牛肉品质评价或分级中的应用。

本发明通过对多种影响肉嫩度的指标进行测定，包括pH、温度、颜色、剪切力、Nebulin(伴肌动蛋白)、Troponin-T蛋白(肌钙蛋白T)的30kDa特征降解产物的相对含量，通过与嫩度的相关性进行分析，找出决定牛肉嫩度的关键因子，从而建立牛肉嫩度预测模型，为今后牛肉的分级评定提供可靠的理论依据。

通过回归分析，综合多种与牛肉成熟14天剪切力相关性较强的影响因子，建立了预测成熟14天牛肉剪切力的12个回归方程，且决定系数在0.41-0.88之间，大大提高了预测的准确度。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中不同成熟时间对宰后pH值的影响。

图2为本发明较佳实施例中不同成熟时间对剪切力值的影响。

图3为本发明较佳实施例中不同成熟时间对肉色的影响。

图4为本发明较佳实施例中成熟不同时间后，反映和Nebulin蛋白降解的SDS-PAGE(胶浓度5％)图谱。0代表0d样品，1、2、3、4、5、6分别代表成熟7h、12h、24h、53h、168h、336h后的样品。

图5为本发明较佳实施例中不同成熟时间对Nebulin蛋白相对含量的影响。

图6为本发明较佳实施例中成熟不同时间后，反映Troponin-T蛋白降解的WesternBlot(胶浓度12.5％)图谱。0代表0d样品，1、2、3、4、5、6分别代表成熟7h、12h、24h、53h、168h、336h后的样品。

图7为本发明较佳实施例中不同成熟时间对Troponin-T蛋白的30kDa特征降解产物相对生成量的影响。

图8为本发明较佳实施例中不同成熟时间对牛肉微观结构影响的电镜照片。其中，a、b、c、d分别代表成熟0h、53h、168h、336h。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1牛肉嫩度预测模型的构建

1.材料与方法

1.1实验材料与仪器

1.1.1实验材料

试验中所用到的牛肉取自北京御香苑食品公司。单克隆鼠抗兔Troponin-T和DAB显色试剂购自Sigma公司；过氧化物标记的抗鼠免疫球蛋白购自Bio-Rad公司；其它试剂皆为分析纯级。

1.1.2实验仪器

电泳和印迹转运系统(Mini-Protean II system)为Bio-Rad公司生产；高效冷冻离心机为Beckman Coulter公司生产(Avanti J-E)；凝胶成像系统为Bio-Rad公司生产；剪切力仪为Brecknell公司(型号235 6Ⅹ)；便携式色差仪(Minolta CR200，口径Ф＝8mm)日本Konica公司生产；HI9025便携式pH/MV/℃酸度计Portugal公司生产。

1.2实验方法

1.2.1原料样品准备

挑选年龄越1.5岁，体重约400kg，膘情相当的夏洛莱牛10头。在北京御香苑屠宰厂按照标准规程屠宰后，分别对每头牛11-12肋骨处的背最长肌。0d样品在宰后15min内取出，放入液氮中备用。前48h在排酸间进行测定与取样，成熟3d、7d、14d样品在宰后3d胴体分割时取样。所有样品称量后分别真空包装，放入0～4℃冷藏箱至所设定成熟时间后测定。用于检测蛋白质降解情况的样品，用铝箔包裹后放入液氮中统一测定，用于透射电镜的样品浸泡与戊二醛中统一观测。用于其它指标测定的样品当场完成。

1.2.2pH和温度的测定

分别在成熟0h、3h、7h、12h、24h、53h、168h、336h用穿刺酸度计测定pH和温度，每个样品测定三次，取其平均值。L值代表亮度指数，a值代表红度指数，b值代表黄度指数。

1.2.3色差的测定

用刀切一新鲜切面，然后在自然光下放置15-20min，用色差计进行测定，每个样品测定三次，取其平均值。

1.2.4剪切力的测定

将解冻后的肉块去除表面结缔组织、脂肪后，切成厚约2.5cm肉块(即大小为2.5cm×2.5cm×2.5cm的肉块)，用85℃水浴加热至肉块中心温度80℃，保持20min，然后冷却至室温，用直径1.27cm的取样器沿肌纤维方向在每块肉样上钻取5-8个肉柱，用剪切力仪垂直肌纤维方向测定剪切力，取其平均值，即为该肉样的剪切力。

1.2.5全蛋白的提取

取一定量去除结缔组织的肉块，剪碎后，按1:10(g:mL)的料液比加入全蛋白提取液(50mM Tris，10mM EDTA)，4℃1500rpm匀浆20s，10s间隔20s。按1:1(体积比)加入样品变性处理液(0.125M Tris，4％SDS，20％甘油)，50℃水浴20min，常温16000g离心20min。采用BCA方法测定蛋白浓度，然后用样品变性处理液(含10％β-巯基乙醇，0.01％的溴酚蓝)稀释到一定浓度。样品再经50℃水浴锅中加热20min，分装，然后于-80℃超低温冰柜中备用。

1.2.6肌原纤维蛋白的纯化与电泳样品制备

肌原纤维的提取和纯化采用Etlinger的方法(Etlinger J D,Zak R,Fischman DA.Compositional studies of myofibrils from rabbit striated muscle[J].Journalof Cell Biology,1976,68(1):123-141.)，取一定量的肉样，按1:7.5(w/v)的比例加入PRB缓冲液(100mM KCL，2mM MgCL

1.2.7变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

根据蛋白分子量的大小采用不同浓度的凝胶电泳。大分子蛋白伴肌球蛋白和伴肌动蛋白采用5％的连续变性电泳(丙烯酰胺:甲叉双丙烯酰胺＝100:1[w/w],200mM Tris-HCl pH8.0，0.067％的TEMED[w/v]，0.1％的APS[w/v]，0.1％的SDS[w/v])。肌钙蛋白-T和肌间线蛋白采用10％的分离胶(丙烯酰胺:甲叉双丙烯酰胺＝37.5:1[w/w]，0.5MTris-HClpH8.8，0.05％的TEMED[w/v]，0.05％的APS[w/v]，0.1％的SDS[w/v])，4％的浓缩胶(丙烯酰胺:甲叉双丙烯酰胺＝37.5:1[w/w],125mM Tris-HCl pH6.8，0.05％的TEMED[w/v]，0.05％的APS[w/v]，0.1％的SDS[w/v])。电极缓冲液含有25mM Tris，192mM甘氨酸和0.1％的SDS(w/v)。上样量分别为：5％连续胶70μg；肌钙蛋白-T20μg；肌间线蛋白40μg。电泳结束后，5％连续胶使用胶体考染方法(Blue-silver)染色(Candiano G,Bruschi M,Musante L,Santucci L,Ghiggeri G M,Carnemolla B,Orecchia P,Zardi L,Righetti P G.Bluesilver:A very sensitive colloidal Coomassie G-250staining for proteomeanalysis[J].Electrophoresis,2004,25(9):1327-1333.)，然后用去离子水进行脱色；10％的胶用于转印。

1.2.8免疫印迹(Western Blot)

采用湿法转印将10％胶上的蛋白转到PVDF膜上，转印液含有20mM Tris，192mM甘氨酸，15％甲醇。转印条件为恒流200mA，时间为90min。转印后的PVDF膜用含5％脱脂奶粉的TBST溶液(500mM NaCl，0.05％ Tween20，30mM Tris-HCl，pH7.5)室温封闭2h。然后用鼠单克隆抗肌钙蛋白-T(Clone JLT-12)在4℃条件下反应过夜。然后在TBST中漂洗4次，每次10min，以去除未结合的一抗。然后分别将膜放在过氧化物标记的抗鼠免疫球蛋白溶液中反应90min。在TBST中漂洗4次，每次10min。然后使用ECL发光试剂盒在暗室中压片、曝光。

1.2.9数据处理

试验数据采用SPSS和Excel软件进行相关分析和线性回归分析。

2.结果与分析

2.1不同成熟时间对pH的影响

牛在被屠宰放血后肌肉内形成无氧环境，肌糖原分解代谢则由原来的有氧分解转为无氧酵解，产生乳酸，同时ATP分解能产生磷酸根离子，这些原因都造成肌肉pH值的下降。但达到极限值后(一般为5.4左右)就不会再下降，因为肌糖原无氧酵解过程中的酶会被肌糖原无氧酵解时产生的酸所抑制而失活，使肌糖原不能再继续分解，乳酸也不能再产生。从图1可以看出，在宰后的24h内pH变化较快，在其它时间内，pH值变化缓慢。刚屠宰后的牛肉pH值为6.6左右，然后随着时间的延长，pH逐渐下降，但到第14d时pH值稍有上升，这是由于在糖原去枝酶的作用下，生成游离的糊精、甘露醇和葡萄糖等带有碱性基团的物质所造成的。通过方差分析得出P<0.05，成熟时间对pH的影响显著。

2.2不同成熟时间对剪切力的影响

剪切力一直被认为是评价肉嫩度的一个最终指标，其它一切指标都要和剪切力相比较，从而决定其是否能作为评价嫩度的指标。目前，还没有一种比剪切力更可靠的评价肉嫩度的方法。从图2可以看出，随着成熟时间的延长，剪切力逐渐变小(P<0.01)，从成熟53h的8.25kg到第336h的3.47kg。

2.3不同成熟时间对色差的影响

肉制品的色泽是第一个进入消费者眼里的感官指标，色泽的好坏直接决定着消费者的购买欲望，良好的色泽可以刺激人们的食欲。从图3可以看出，从宰后成熟的3h到第12h，L、a、b值都逐渐增大，但增加的幅度较小。

2.4不同成熟时间对Nebulin蛋白的影响

成熟到第168h时，从图4中几乎看不到Nebulin蛋白的存在。在成熟的前24h，Nebulin蛋白是逐渐降解，在第24h到第53h，降解速度加快，Nebulin蛋白相对含量从76％降到57％(图5)。

2.5不同成熟时间对Troponin-T蛋白的影响

Troponin-T骨骼肌完整细丝的一部分，在成熟的过程中会发生降解同时产生30kDa的降解片段，此产物是Troponin-T的特征降解产物。大量研究表明，该产物的生成量和肉的嫩度有显著的相关性，因此将其作为肉成熟进程的标志性因子。从图6可以看出，从成熟24h开始出现30kDa的Troponin-T降解产物，往后随着成熟时间的延长，其生成量也逐渐增加，在成熟后的第53h，出现了28kDa的降解产物，其生成量也逐渐增加。如果以每张图谱中第336h的30kDa降解产物生成量为内标(数值定为1)，则第24h、53h、168h的30Kda降解产物相对生成量分别为11％、22％、72％，变化趋势如图7所示。

2.6牛肉成熟过程中一些指标和牛肉嫩度的相关性分析

从表1可以看出，不同成熟时间之间的剪切力之间的相关性都显著，P值小于0.05，其中第53h与第336h之间的剪切力之间的相关性极其显著(P<0.01)，因此可以将第53h和第168h的剪切力值作为预测牛肉嫩度的一个重要因子。

温度与成熟336h的剪切力之间的相关系不强(P<0.05)，第9h和24h的pH值和成熟53h的剪切力相关性显著(P<0.05)，24h的pH值还和成熟336h的剪切力相关(P<0.05)。因此可以将第24h的pH值作为预测336h剪切力的一个重要因子。色差值和剪切力之间的相关性较显著，其中3h、12h、53h时的L、b值都与第336h时的剪切力相关(P<0.05)，第12h和53h的a值与336h时的剪切力相关(P<0.05)第3h的a值与成熟336h的剪切力之间的相关性不显著(P>0.05)。

Nebulin蛋白在第53h和336h时的相对含量与336h的剪切力之间具有显著相关系(P<0.05)。但不同成熟时间的Nebulin蛋白相对含量与336h的剪切力之间即有正相关也有负相关。Troponin-T蛋白的特征降解产物，30kDa的特征降解片段的相对生成量与336h的剪切力之间相关性较显著(P<0.05)。

表1成熟期间不同指标与剪切力(WBS)之间的相关性分析表

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注：N代表Nebulin在成熟过程中的相对含量，T代表温度，30KDa代表Ttroponin-T的30KDa特征降解产物的相对含量。上标中*表示显著相关(P＜0.05)，**表示极显著相关(P＜0.01)。WBS表示剪切力的大小，反应嫩度的指标，该值越小，嫩度越好。

2.7牛肉嫩度的预测模型

将与牛肉成熟14d的剪切力显著相关的一些因子为自变量(WBS53h、pH24h、b53h、N53h、30KDa53h)，以成熟14天的剪切力为因变量建立一些牛肉嫩度的预测模型，回归模型的决定系数分布在0.41-0.88之间(表2)。从决定系数(R

表2成熟14天牛背最长肌嫩度的预测模型

注：A代表成熟53h的剪切力，B代表成熟24h的pH值，C代表成熟53h时的b值，D代表成熟53h的Nebulin蛋白的相对含量，E代表成熟168h时的Troponin-T蛋白30KDa特征降解产物的相对含量。

2.8不同成熟时间对牛肉超微结构的影响

根据每头牛剪切力值的大小，选取具有代表性(剪切力值和平均值接近)的进行电镜观察。透射电镜结果表明(图8，a～d)：0d样品具有完整的肌原纤维框架结构，可以清楚的看到线粒体，Z线和M线保持完整，肌原纤维间连接比较紧密。成熟53h后，肌原纤维框架结构已被破坏，I带发生疏松，Z线两侧间隙加大，但仍与Z线相连，且Z线本身基本未发生裂解，M线仍保持相对完好。成熟168h后，Z线两侧的间隙进一步加大，部分肌原纤维在Z线处发生断裂，但M线仍保持相对完好。成熟336h后，肌原纤维大面积的在Z线处发生断裂，生成不同的片段，但肌原纤维发生断裂的位置不是在Z线中间而是发生在Z线附近；另外，M线也开始变得模糊。

牛肉嫩度是决定肉最终食用品质的一个最重要的指标，但由于其在屠宰到消费者消费的过程中发生剧烈的改变，一直是牛肉分级工作中的一个重点研究对象。而对牛肉的嫩度做到准确预测可以有效解决这一问题，因此对于牛肉分级工作的准确性和时效性具有重要意义。目前，剪切力值被认为是评价嫩度的一个最可靠的指标，因此对牛肉嫩度的预测就是用成熟早期的一些指标来表示成熟后期的剪切力值。

由于影响牛肉嫩度的因素有很多，本发明只选择了易测或已有报道和嫩度相关系较显著的早期成熟指标来预测成熟后期的嫩度。从试验结果来看，温度和剪切力之间没有显著相关性，早期的pH值和成熟14d的剪切力之间相关性不强，但24h的pH和色差中L、a、b值只有Nebulin和Troponin-T的降解和嫩度具有显著相关性，因为成熟期间嫩度的改善就是这些蛋白降解所产生的后果。通过回归分析，综合多种与成熟14d剪切力相关性较强的影响因子，建立了预测成熟14d牛肉剪切力的12个回归方程，且决定系数在0.41-0.88之间，大大提高了预测的准确度。

除了动物品种对最终肉的嫩度产生影响外，即使同一胴体的不同部位也会具有不同的剪切力，可见嫩度的预测工作是一项极其复杂的工作。目前分级员评级还是主要的牛肉分级方式，这样的方式带有很大的主观性，不同的分级员可能给出不同的级别评定。从嫩度预测的准确性和方便性考虑，开发智能化评级系统对于牛肉的分级工作具有重要意义。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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