线性定量动态范围延展方法

相关申请

本申请要求于2021年3月30日提交的美国临时专利申请第63/167，916号的权益，其内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本文的教导涉及在液相色谱法-质谱法(LC-MS)或液相色谱法-质谱法/质谱法(LC-MS/MS)中延展关注化合物的可定量线性动态范围。更具体地，本文的教导涉及用于通过使用从定量实验本身获得的两种或更多种定量离子(quantifier ion)的推断量或均衡量的不确定度加权平均值来延展关注化合物的可定量范围的系统和方法。

本文的系统和方法可以结合处理器、控制器或计算机系统(诸如图1的计算机系统)来执行。

背景技术

使用多个定量物(quantifier)延展的线性动态范围

用于定量的线性动态范围(LDR)由样品浓度对质谱法中离子信号响应的线性度来确定。由于“离子效率”的差异，通过从同一样品中选择具有各种各样灵敏度水平的不同目标离子(定量离子)可以改变LDR结果。对于任何质谱仪，离子效率取决于几个因素，包括但不限于电离效率、碎裂效率和检测效率。例如，对于飞行时间(TOF)质谱仪，离子效率还取决于TOF占空比损失。

图2是离子强度对样品浓度的示例性绘图200，其示出了可以如何通过选择不同定量离子来改变LDR结果，在此之上可以实施本发明的实施例。绘图200示出了定量离子210和定量离子220的LDR。定量离子210的LDR的斜率接近1。这意味着定量离子210具有高离子效率。样品浓度的任何变化都会产生离子强度的成比例的变化。因此，定量离子210具有高检测灵敏度。

具有高离子效率的离子(如定量离子210)的另一个优点是它们产生与质谱信号变化成比例的浓度变化(CV)。例如，质谱信号变化230产生定量离子210的成比例的CV 231。

不幸的是，具有高离子效率的离子(如定量离子210)很快达到质谱仪的饱和上限。这意味着它们的LDR比其他离子更短，进而它们的样品浓度范围也更短。在绘图200中，定量离子210的LDR产生样品浓度范围241。

相比之下，定量离子220的LDR的斜率远小于1。这意味着定量离子220具有比定量离子210更低的离子效率。样品浓度的任何变化产生更小的离子强度变化。因此，定量离子220具有比定量离子210更低的检测灵敏度。

具有较低离子效率的离子(如定量离子220)的另一个缺点是，响应于质谱信号变化，它们产生大得多的CV。例如，质谱信号变化230为定量离子220产生比定量离子210的CV231大得多的CV 232。

然而，较低离子效率的一个优点是较大的样品浓度范围。具有较低离子效率的离子(如定量离子220)需要较长时间来达到质谱仪的饱和上限。这意味着它们的LDR更长，进而它们的样品浓度范围也更长。在绘图200中，定量离子220的LDR产生样品浓度范围242，其远大于定量离子210的样品浓度范围241。

传统上，已经使用多于一种定量离子来延展化合物的LDR。然而，在生成校准曲线的测试中，需要仔细选择所使用的指定转变或产物离子。

图3是示例性绘图300，其示出了图2的两种离子的完整强度对样品浓度响应，在此之上可以实施本发明的实施例。通常，所选的具有最高离子效率的产物离子用于延展样品浓度低端处的LDR极限。例如，线310是图2的定量离子210的强度对样品浓度响应，并且可以用于延展样品浓度低端处的LDR极限。然而，线310将仅限于总LDR范围的低浓度端，因为强度在样品浓度的几个数量级内达到检测上限。

线320是图2的定量离子210的强度对样品浓度响应，并且可以用于延展样品浓度较高端处的LDR极限。回想一下，线320代表具有较低“离子效率”的较低强度产物离子的响应。

为了生成多个定量离子的良好校准曲线，已做出的努力包括：1)收集信息，诸如定量离子质荷比(m/z)和定量离子强度比；2)仔细选择低端和高端处的定量离子；3)使用强度在系统饱和极限内的定量离子；以及4)基于保留时间(RT)信息手动检查是否在低端选择了正确的定量离子以避免选择任何干扰离子。

在生成校准曲线时优化利用不同定量离子有可能在样品浓度范围的低端和高端二者都延展总LDR范围。然而，要实现这一点，需要在方法优化、数据采集和数据处理方面付出大量额外努力。

因此，需要附加的系统和方法用于通过明智使用正确定量离子来产生优化定量方案从而以良好准确度确信地实现高线性动态范围而无需在方法优化、数据采集和数据处理方面付出大量额外努力。

LC-MS和LC-MS/MS背景

质谱法(MS)是用于基于对由化学化合物形成的离子的质荷比(m/z)的分析来对那些化合物进行检测和定量的分析技术。质谱法(MS)和液相色谱法(LC)的组合是用于识别和定量混合物中的化合物的重要分析工具。通常，在液相色谱法中，所分析的流体样品通过填充有经化学处理的固体吸附材料(通常为小固体颗粒的形式，例如二氧化硅)的柱。由于混合物各成分与固体吸附材料(通常称为固定相)的相互作用略有不同，因此不同成分通过经装填的柱的传输(洗脱)时间会不同，从而导致各种成分的分离。在LC-MS中，可以对离开LC柱的流出物连续进行质谱分析。可以处理来自该分析的数据以生成提取离子色谱图(XIC)，该色谱图可以将检测到的离子强度(一种或多种特定分析物的检测到的离子数量的测量值)描绘为保留时间的函数。

在一些情况下，可以对LC流出物进行串联质谱法(或质谱法/质谱法，MS/MS)以识别对应于XIC中的峰的产物离子。例如，可以基于前体离子的质荷比来选择前体离子以进行质量分析的后续阶段。例如，所选择的前体离子可以被碎裂(例如，经由碰撞诱导解离)，并且碎裂的离子(产物离子)可以经由质谱法的后续阶段进行分析。

串联质谱法或MS/MS背景

串联质谱法或MS/MS涉及对样品中的一种或多种关注化合物的电离、对一种或多种化合物的一种或多种前体离子的选择、将一种或多种前体离子碎裂成产物离子、以及对产物离子的质量分析。

串联质谱法可以提供定性和定量信息二者。产物离子谱可用于识别关注分子。一种或多种产物离子的强度可用于定量样品中存在的化合物的量。

可以使用串联质谱仪来执行大量不同类型的实验方法或工作流程。这些工作流程可以包括但不限于靶向采集、信息依赖采集(IDA)或数据依赖采集(DDA)以及数据非依赖采集(DIA)。

在靶向采集方法中，为关注化合物预定义前体离子到产物离子的一个或多个转变。当样品被引入串联质谱仪时，在多个时间段或循环中的每个时间段或循环期间询问该一个或多个转变。换言之，质谱仪选择并碎裂每个转变的前体离子，并对转变的产物离子执行靶向质量分析。作为结果，为每个转变产生色谱图(强度随保留时间的变化)。靶向采集方法包括但不限于多反应监测(MRM)和选择反应监测(SRM)。

通常使用“低分辨率”仪器来执行MRM实验，这些仪器包括但不限于三重四极(QqQ)或四极线性离子阱(QqLIT)装置。随着“高分辨率”仪器的出现，人们希望使用类似于QqQ/QqLIT系统的工作流程来收集MS和MS/MS。高分辨率仪器包括但不限于四极飞行时间(QqTOF)或轨道阱装置。这些高分辨率仪器还提供新功能。

QqQ/QqLIT系统上的MRM是所有应用领域中靶向定量所选择的标准质谱技术，因为它能够为复杂混合物中的特定成分的检测提供最高的特异性和灵敏度。然而，当今的精确质量系统的速度和灵敏度已经使得新的定量策略能够具有类似的性能特性。在此策略(称为MRM高分辨率(MRM-HR)或并行反应监测(PRM))中，用短积累时间以高分辨率收集成环MS/MS谱，然后在采集后提取片段离子(产物离子)以生成类似MRM的峰用于进行积分和定量。使用如AB SCIEX

换句话说，在诸如MRM-HR之类的方法中，获得高分辨率的前体离子质谱，选择一种或多种前体离子并将其碎裂，并且针对每种选定的前体离子获得高分辨率的完全的产物离子谱。为每种选定的前体离子收集完全的产物离子谱，但可以指定关注的产物离子质量，并且可以丢弃除关注的产物离子质量的质量窗口之外的所有内容。

在IDA(或DDA)方法中，用户可以在将样品引入串联质谱仪的同时指定用于收集产物离子的质谱的标准。例如，在IDA方法中，执行前体离子或质谱法(MS)调查扫描以生成前体离子峰列表。用户可以选择标准来过滤峰列表以得到峰列表上的前体离子的子集。定期刷新或更新调查扫描和峰列表，然后对前体离子的子集中的每种前体离子执行MS/MS。为每种前体离子产生产物离子谱。当样品被引入串联质谱仪时，对前体离子的子集中的前体离子重复执行MS/MS。

然而，在蛋白质组学和许多其他应用中，化合物的复杂性和动态范围非常大。这对传统的靶向和IDA方法提出了挑战，需要非常高速的MS/MS采集来深入询问样品以便既识别又定量广泛范围的分析物。

因此，开发了作为第三大类串联质谱法的DIA方法。这些DIA方法已用于提高从复杂样品中收集数据的可再现性和全面性。DIA方法也可以称为非特定碎裂方法。在DIA方法中，串联质谱仪的动作在MS/MS扫描之间不会基于先前的前体或调查扫描中采集的数据而变化。相反，选择的是前体离子质量范围。然后在前体离子质量范围内步进前体离子质量选择窗口。前体离子质量选择窗口中的所有前体离子都被碎裂，并且前体离子质量选择窗口中的所有前体离子的所有产物离子都被质量分析。

用于扫描质量范围的前体离子质量选择窗口可以很窄，使得窗口内存在多个前体的可能性小。例如，这种类型的DIA方法称为MS/MS

因此，跨越整个前体质量范围步进较大的前体离子质量选择窗口或具有较大宽度的选择窗口。这种类型的DIA方法称为例如SWATH采集。在SWATH采集中，在每个循环中跨越前体质量范围所步进的前体离子质量选择窗口可具有5-25amu或甚至更大的宽度。与MS/MS

美国专利第8，809，770号描述了可以如何使用SWATH采集来提供关于关注化合物的前体离子的定量和定性信息。特别地，将从前体离子质量选择窗口的碎裂中发现的产物离子与关注化合物的已知产物离子的数据库进行比较。此外，对从前体离子质量选择窗口的碎裂中发现的产物离子的离子迹线或提取离子色谱图(XIC)进行分析，以提供定量和定性信息。

定量动态范围背景

通过质谱法进行的定量通常使用MRM或MRM-HR和LC作为引入系统。在关注化合物预期从LC柱洗脱期间测量响应，例如来自特定MRM转变的响应。生成色谱图，对其进行处理以确定色谱图中存在的任何峰的面积，并根据校准曲线或根据与已知协调标准的比率计算相应的量。众所周知，关注分析物或化合物的测量信号首先会随着浓度而线性增加，但最终会达到限制可测量的最大浓度的停滞。给出线性响应的浓度范围称为线性动态范围。这种信号停滞或翻转通常归因于离子源、检测器或柱中的饱和，使得增加关注化合物的浓度不再导致产生的或检测到的离子数量的增加。

该信号停滞也可归因于加合物、二聚体、三聚体、多电荷离子和其他物种的形成。虽然许多化合物通过添加(正模式)或去除(负模式)质子而电离，以得到M+H

发明内容

公开了用于根据定量实验本身计算两种或更多种定量离子的均衡量的不确定度加权平均值的系统、方法和计算机程序产品。该系统包括质谱仪和处理器。

质谱仪随着时间的推移对m个不同实验样品中的每个样品中的关注化合物的n种已知i离子进行质量分析，从而产生XIC峰。XIC峰包括这m个不同样品中的每个样品的n个峰。

处理器选择参考离子j，其为n种i离子中的j离子或为假设离子j。对于这m个样品中的每个样品，处理器计算j离子的峰面积与n种i离子中的每种离子的峰面积的比率r(j，i)，从而为n种i离子中的每种离子产生m个r(j，i)比率。处理器根据n种i离子中的每种离子的m个r(j，i)比率，为n种i离子中的每种离子计算预期比率r

其中w

申请人教导的这些和其他特征在本文中阐述。

附图说明

本领域技术人员将理解，下面描述的附图仅用于说明目的。附图无意以任何方式限制本教导的范围。

图1是图示可以在其上实施本教导的实施例的计算机系统的框图。

图2是离子强度对样品浓度的示例性绘图，其示出了可以如何通过选择不同定量离子来改变线性动态范围(LDR)结果，可以在其上实施本发明的实施例。

图3是示出图2的两种离子的完整强度对样品浓度响应的示例性绘图，可以在其上实施本发明的实施例。

图4是示出根据各种实施例的用于定量阿托伐他汀(Atorvastatin)的22种定量离子的相对峰面积(按对数刻度)的示例性绘图。

图5是示出根据各种实施例的用于定量阿托伐他汀的22种定量离子的浓度变化(CV)如何随浓度(按对数刻度)而变化的示例性热图。

图6是示出根据各种实施例的用于定量阿托伐他汀的22种定量离子的LDR如何随浓度(按对数刻度)而变化的示例性热图。

图7是示出根据各种实施例的用于定量阿托伐他汀的22种定量离子的测量峰面积如何随浓度而变化的示例性热图。

图8是示出根据各种实施例的用于定量阿托伐他汀的22种定量离子的均衡峰面积如何随浓度而变化的示例性热图。

图9是示出根据各种实施例的与共识量相比，用于定量阿托伐他汀的22种单独定量离子的浓度范围或定量极限(LOQ)如何随浓度(按对数刻度)而变化的示例性绘图。

图10是根据各种实施例的针对三种单独定量离子和共识量的百分比CV对浓度的示例性绘图。

图11是根据各种实施例的针对三种单独定量离子和共识量的百分比准确度对浓度的示例性绘图。

图12是示出根据各种实施例的用于根据定量实验本身计算两种或更多种定量离子的均衡量的不确定度加权平均值的系统的示意图。

图13是示出根据各种实施例的用于根据定量实验本身计算两种或更多种定量离子的均衡量的不确定度加权平均值的方法的流程图。

图14是根据各种实施例的包括一个或多个不同软件模块的系统的示意图，该系统执行用于根据定量实验本身计算两种或更多种定量离子的均衡量的不确定度加权平均值的方法。

在详细描述本教导的一个或多个实施例之前，本领域技术人员将理解，本教导的应用不限于在下面的详细描述中阐述或在附图中图示的构造的细节、部件的布置和步骤的布置。此外，要理解，本文使用的措辞和术语是为了描述的目的，并不应被视为限制。

具体实施方式

计算机实施的系统

图1是图示可以在其上实施本教导的实施例的计算机系统100的框图。计算机系统100包括用于传送信息的总线102或其他通信机制，以及与总线102耦合的用于处理信息的处理器104。计算机系统100还包括存储器106，其可以是随机存取存储器(RAM)或其他动态存储装置，并且其耦合到总线102以用于存储要由处理器104执行的指令。存储器106还可以用于存储临时变量或在执行将由处理器104执行的指令期间的其他中间信息。计算机系统100还包括只读存储器(ROM)108或其他静态存储装置，其耦合到总线102以用于存储用于处理器104的静态信息和指令。诸如磁盘或光盘之类的存储装置110被提供并耦合到总线102以用于存储信息和指令。

计算机系统100可以经由总线102耦合到显示器112，诸如阴极射线管(CRT)或液晶显示器(LCD)，用于向计算机用户显示信息。包括字母数字键和其他键的输入装置114耦合到总线102，用于将信息和命令选择传送给处理器104。另一种类型的用户输入装置是光标控件116，诸如用于将方向信息和命令选择传送给处理器104和用于控制显示器112上的光标移动的鼠标、轨迹球或光标方向键。

计算机系统100可以执行本教导。与本教导的某些实施方式一致，结果由计算机系统100响应于处理器104执行包含在存储器106中的一个或多个指令的一个或多个序列而提供。这些指令可以从另一计算机可读介质(诸如存储装置110)读入存储器106。包含在存储器106中的指令序列的执行导致处理器104执行本文描述的过程。可替代地，可以使用硬连线电路系统代替软件指令或与软件指令结合来实施本教导。因此，本教导的实现不限于硬件电路系统和软件的任何特定组合。

如本文所使用的术语“计算机可读介质”或“计算机程序产品”是指参与向处理器104提供指令以供执行的任何介质。术语“计算机可读介质”和“计算机程序产品”在所撰写的这篇描述中通篇可互换地使用。这种介质可以采取多种形式，包括但不限于非易失性介质、易失性介质和前体离子质量选择介质。非易失性介质包括例如光盘或磁盘，诸如存储装置110。易失性介质包括动态存储器，诸如存储器106。

计算机可读介质的常见形式包括例如软盘、柔性盘、硬盘、磁带或任何其他磁介质、CD-ROM、数字视频盘(DVD)、蓝光盘、任何其他光学介质、拇指驱动器、存储器卡、RAM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储器芯片或匣，或计算机可以从中读取的任何其他有形介质。

各种形式的计算机可读介质可以涉及将一个或多个指令的一个或多个序列携带到处理器104以供执行。例如，指令最初可能被携带在远程计算机的磁盘上。远程计算机可以将指令加载到其动态存储器中，并使用调制解调器通过电话线发送指令。计算机系统100本地的调制解调器可以在电话线上接收数据并使用红外发射器将数据转换成红外信号。耦合到总线102的红外检测器可以接收红外信号中携带的数据并将数据放置在总线102上。总线102将数据携带到存储器106，处理器104从存储器106检索并执行指令。存储器106接收的指令可以可选地在处理器104执行之前或之后存储在存储装置110上。

根据各种实施例，被配置为由处理器执行以执行方法的指令存储在计算机可读介质上。计算机可读介质可以是存储数字信息的装置。例如，计算机可读介质包括本领域已知的用于存储软件的致密盘只读存储器(CD-ROM)。计算机可读介质由适合于执行被配置为被执行的指令的处理器访问。

为了说明和描述的目的，已经呈现了本教导的各种实施方式的以下描述。其不是穷举的并且不将本教导限制为所公开的精确形式。根据以上教导，修改和变化是可能的，或者可以从本教导的实践中获得。此外，所描述的实施方式包括软件，但是本教导可以被实施为硬件和软件的组合或单独的硬件。本教导可以用面向对象的编程系统和非面向对象的编程系统二者来实现。

使用最可能比率延展动态范围

如上所述，用于定量的线性动态范围(LDR)由样品浓度对质谱法中离子信号响应的线性度来确定。由于“离子效率”的差异，可以通过从同一样品中选择具有各种各样灵敏度水平的不同目标离子(定量离子)来改变LDR结果。

传统上，已经使用不止一种定量离子来延展化合物的LDR。在生成校准曲线时优化利用不同定量离子有可能在样品浓度范围的低端和高端都延展总LDR范围。然而，要实现这一点，需要在方法优化、数据采集和数据处理方面付出大量额外努力。

因此，需要附加的系统和方法用于通过明智使用正确定量离子来产生优化定量方案从而以良好准确度确信地实现高线性动态范围而无需在方法优化、数据采集和数据处理方面付出大量额外努力。

在各种实施例中，从实验数据发现关注化合物或分析物的两种或更多种定量离子之间的关系或比率。使用这些比率来均衡两种或更多种定量离子的测量量。最后，经均衡的量被组合成共识量。

提取多于一种离子用于定量。化合物定量离子通常包括关注化合物的产物离子。然而，可以使用前体离子的同位素或产物离子和同位素的任意组合。

定量离子通常不具有相同的离子效率(例如，生成片段离子的可能性)或自然丰度(同位素)，从而导致对于给定的前体分子量，在这些离子之间存在观察到的强度的显著差异。换句话说，对于关注化合物的X个分子，质谱仪将电离定量离子(i)的X

两种定量离子i和j之间的关系或比率被表达为r

传统上，已经使用单种定量离子或者使用两种或更多种定量离子之和来进行定量。使用单种定量物时，通常使用具有最大量的动态范围的定量离子(如低效率离子)，或者使用与关注化合物的关注范围具有最佳线性动态范围重叠的定量离子。

使用两种或更多种定量离子之和的动机是通过强度加权量来减少测量变化性。尽管有时会被错误预期为延展LDR，但求和通常不会影响LDR。然而，在r

在各种实施例中，使用两种或更多种定量离子之和可以进行LDR延展。例如，如果所选的定量离子具有显著不同的离子响应，则LDR延展是可能的。这些不同的离子响应可能是由于例如产物离子的不同碎裂效率、质谱化学性质(如同位素比和电荷簇比)以及其他原因(诸如在TOF实验中使用开/关Zeno脉冲)造成的。

如果对于所有定量离子而言r

然而，在各种实施例中，可以根据定量实验本身估计所有定量离子的r

给定FMLR或预期r

其中，当定量离子i测量值具有低不确定度时，不确定度权重w

在各种实施例中，不确定度w

在优选实施例中，当样品数量足够时，不确定度权重w

具体地，通过将为每个样品的n种离子中的每种离子i计算的r(j，i)与预期r

在各种实施例中，通过将推断量X的不确定度加权平均值与参考离子j的标准校准曲线进行比较来找到样品的关注化合物的浓度。

实验结果

分析了阿托伐他汀的TOF-MS/MS数据集。样品组包括20种稀释液，其与内部标准的浓度比率变化～9个数量级。每个浓度有三份副本。

图4是示出根据各种实施例的用于定量阿托伐他汀的22种定量离子的相对峰面积(按对数刻度)的示例性绘图400。绘图400示出在440m/z处的定量离子是最强的离子。

图5是根据各种实施例的示例性热图500，其示出了用于定量阿托伐他汀的22种定量离子的CV如何随浓度(按对数刻度)而变化。较浅的区域对应于良好的CV。例如，热图500示出了在440m/z处的最强定量离子的CV如何良好，直到该离子在最高浓度处饱和。

图6是根据各种实施例的示例性热图600，其示出了用于定量阿托伐他汀的22种定量离子的LDR如何随浓度(按对数刻度)而变化。较浅的区域对应于定量离子在LDR内的浓度。例如，热图600示出了在440m/z处的最强定量离子如何在其于最高浓度处饱和时掉出LDR。

定量离子与线性动态范围的接近程度被称为准确度或百分比准确度。预期的LDR是已知的。从测量的LDR中减去预期的LDR以获得误差。例如，热图600的最浅区域表示LDR误差在零的20％以内。

图7是根据各种实施例的示例性热图700，其示出了用于定量阿托伐他汀的22种定量离子的测量峰面积如何随浓度而变化。较浅的区域对应于较大的峰面积。例如，热图700示出了峰面积随浓度增加的速率，并且最大峰面积在22种定量离子之间不同。在440m/z处的最强定量离子既具有最高的峰面积随浓度增加的速率，又具有最大的最大峰面积。

图8是根据各种实施例的示例性热图800，其示出了用于定量阿托伐他汀的22种定量离子的均衡峰面积如何随浓度而变化。较浅的区域对应于较大的峰面积。如上所述，通过将测量面积乘以参考离子j的分子数或面积与定量离子i的分子数或面积的预期比率r

在这种情况下，参考离子j是在559m/z处的定量离子。使用MLR找到在559m/z处的定量离子的面积与22种定量离子中的每种离子的面积的比率。

如上所述，参考离子优选地被选择为产生最小的与任何其他离子的最大峰面积差。描述这一点的另一种方式是，参考离子优选地被选择为具有最接近最高峰面积与最低峰面积的平均值的峰面积的定量离子。

使用图8的均衡峰面积，为每个浓度计算22种定量离子的均衡峰面积的共识量或不确定度加权平均值。如上所述，该共识响应是使用下式计算的：

其中，w

图9是根据各种实施例的示例性绘图900，其示出了与共识量相比，用于定量阿托伐他汀的22种单独定量离子的浓度范围或定量极限(LOQ)如何随浓度(按对数刻度)而变化。绘图900示出了共识量910具有比22种单独定量离子中的任何一种更大的浓度范围。换句话说，22种定量离子的均衡峰面积的不确定度加权平均值具有比任何单独离子更大的浓度范围。

共识量910达到了只有在440m/z处的最强定量离子达到的最低浓度水平。然而，共识量910也延展到了大多数其他定量离子达到的最高浓度水平。因此，绘图900示出，共识量910相对于任何单独的定量离子产生了LOQ的改进。

图10是根据各种实施例的针对三种单独定量离子和共识量的百分比CV对浓度的示例性绘图1000。绘图1000包括在466m/z处的单独定量离子1020、在448m/z处的单独定量离子1030、在440m/z处的单独定量离子1040以及共识量1010的百分比CV值。绘图1000示出，共识量1010在高浓度和低浓度都有较低的百分比CV。这些单独定量离子中没有一个在高浓度和低浓度都产生了如此低的百分比CV。

图11是根据各种实施例的针对三种单独定量离子和共识量的百分比准确度对浓度的示例性绘图1100。绘图1100包括在466m/z处的单独定量离子1020、在448m/z处的单独定量离子1030、在440m/z处的单独定量离子1040以及共识量1010的百分比准确度值。如上所述，将定量离子与线性动态范围的接近程度称为准确度或百分比准确度。在绘图1100中，较高的百分比准确度意味着离子或共识更接近预期的线性动态范围。绘图1100示出，共识量1010对于更大的浓度范围具有比任何单独定量离子更高的百分比准确度。

图9-图11的绘图示出，阿托伐他汀实验的共识量比任何单独定量离子提供了更长的LOQ、在高浓度和低浓度都更低的百分比CV、以及对于更大浓度范围的更高百分比准确度。换句话说，图9-图11示出了共识量1010提供了延展的且更准确的动态范围，并且提供了比任何单独离子更小的浓度变化。

用于延展动态范围的系统

图12是示出根据各种实施例的用于根据定量实验本身计算两种或更多种定量离子的均衡量的不确定度加权平均值的系统的示意图1200。图12的系统包括质谱仪1230和处理器1240。

质谱仪1230随时间的推移对m个不同实验样品1201中的每个样品中的关注化合物的n种已知i离子进行质量分析，从而产生峰1235。峰1235包括m个不同样品1201中的每个样品的n个提取离子色谱图(XIC)峰。

质谱仪1230被示为QqTOF装置。本领域普通技术人员可以理解，质谱仪1230可以包括其他类型的质谱装置，包括但不限于离子阱、轨道阱、QqQ装置、QqLIT装置或傅里叶变换离子回旋共振(FT-ICR)装置。

在各种实施例中，图12的系统还包括样品引入装置1210和离子源装置1220。样品引入装置1210随着时间的推移将包括关注化合物的每个样品引入系统。例如，从样品板获得样品。样品引入装置1210可以执行包括但不限于以下的技术：离子迁移率、气相色谱法(GC)、液相色谱法(LC)、毛细管电泳(CE)、声学喷射质谱法(AEMS)或流动注射分析(FIA)。

离子源装置1220使样品的化合物电离以将化合物变换成离子束。离子源装置1220可执行电离技术，包括但不限于基质辅助激光解吸/电离(MALDI)或电喷雾电离(ESI)。

处理器1240可以是但不限于计算机、微处理器、图1的计算机系统或能够从质谱仪1230发送和接收控制信号和数据并处理数据的任何装置。处理器1240与质谱仪1230通信。

在步骤1241中，处理器1240选择参考离子j。在优选实施例中，处理器1240选择n种i离子中的j离子作为参考离子。可以选择n种i离子中的任何离子作为参考离子。在各种实施例中，处理器1240通过计算m个样品中的一个或多个样品中的n种i离子中的每种离子的峰面积与n种i离子中的每种其他离子的峰面积的最大差来选择j离子。处理器1240然后选择n种i离子中的在m个样品中的所述一个或多个样品中产生最小的最大峰差的离子。

在另一个实施例中，参考离子j可以是假设离子。例如，j离子可以是具有100％离子效率的假设离子。因此，所有n种离子都可以均衡于它们中的一种离子或某个假设的代表(如45度电离效率线)。

在步骤1242中，处理器1240对于m个样品1201中的每个样品，计算j离子的峰面积与n种i离子中的每种离子的峰面积的比率r(j，i)。在步骤1242中，为n种i离子中的每种离子产生m个r(j，i)比率。

在步骤1243中，处理器1240根据n种i离子中的每一种的m个r(j，i)比率，为n种i离子中的每种离子计算预期比率r

在步骤1244中，对于m个样品中的每个样品，处理器1240根据下式计算均衡于j离子的不确定度加权平均值量X：

其中w

在各种实施例中，处理器1240通过计算每种离子的m个r(j，i)比率r(j，i)的直方图来将为每个样品的n种i离子中的每种离子计算的r(j，i)与预期r

在各种实施例中，如上所述，n种i离子可包括化合物的产物离子或化合物的前体离子的同位素或化合物的产物离子的同位素。如果实验是DDA(IDA)，则通常仅使用质谱法(MS)进行定量，因此要分析前体离子及其同位素。此外，还可以分析与化合物的量相关的加合物/损失及其同位素。

如果实验是DIA、MRM或MRM-HR(预定式或非预定式)，则产生并分析片段或产物离子。如果实验是DIA或MRM-HR，则产物离子及其同位素可用于定量。

用于延展动态范围的方法

图13是示出根据各种实施例的用于根据定量实验本身计算两种或更多种定量离子的均衡量的不确定度加权平均值的方法1300的流程图。

在方法1300的步骤1310中，随着时间的推移对m个不同实验样品中的每个样品中的关注化合物的n种已知i离子进行质量分析，从而为m个不同样品中的每个样品产生n个XIC峰。

在步骤1320中，选择参考离子j，该参考离子j为n种i离子中的j离子或为假设离子j。

在步骤1330中，对于m个样品中的每个样品，计算j离子的峰面积与n种i离子中的每种离子的峰面积的比率r(j，i)，从而为n种i离子中的每种离子产生m个r(j，i)比率。

在步骤1340中，根据n种i离子中的每种离子的m个r(j，i)比率，为n种i离子中的每种离子计算预期比率r

在步骤1350中，对于m个样品中的每个样品，根据下式计算均衡于j离子的不确定度加权平均值量X：

其中w

用于延展动态范围的计算机程序产品

在各种实施例中，计算机程序产品包括非暂时性有形计算机可读存储介质，其内容包括具有指令的程序，所述指令在处理器上执行以便执行用于根据定量实验本身计算两种或更多种定量离子的均衡量的不确定度加权平均值的方法。该方法由包括一个或多个不同软件模块的系统来执行。

图14是根据各种实施例的包括一个或多个不同软件模块的系统1400的示意图，该系统执行用于根据定量实验本身计算两种或更多种定量离子的均衡量的不确定度加权平均值的方法。系统1400包括控制模块1410和分析模块1420。

控制模块1410指示质谱仪随着时间的推移对m个不同实验样品中的每个样品中的关注化合物的n种已知i离子进行质量分析，从而为m个不同样品中的每个样品产生n个XIC峰。

分析模块1420选择参考离子j，其为n种i离子中的j离子或为假设离子j。分析模块1420对于m个样品中的每个样品，计算j离子的峰面积与n种i离子中的每种离子的峰面积的比率r(j，i)，从而为n种i离子中的每种离子产生m个r(j，i)比率。分析模块1420根据n种i离子中的每种离子的m个r(j，i)比率，为n种i离子中的每种离子计算预期比率r

其中w

虽然结合各种实施例描述了本教导，但并不旨在将本教导限制于此类实施例。相反，如本领域技术人员将理解的，本教导涵盖各种替代、修改和等同方案。

此外，在描述各种实施例时，说明书可能已经将方法和/或过程呈现为步骤的特定序列。然而，就该方法或过程不依赖于本文阐述的步骤的特定顺序的程度而言，该方法或过程不应限于所描述的步骤的特定序列。如本领域普通技术人员将理解的，其他步骤序列也是可能的。因此，说明书中阐述的步骤的特定顺序不应被解释为对权利要求的限制。另外，针对方法和/或过程的权利要求不应限于按所写顺序执行它们的步骤，并且本领域技术人员可以容易地理解，序列可以改变并且仍然保持在各种实施例的精神和范围内。