导航：首页> 燃烧发动机；热气或燃烧生成物的发动机装置>一种脱毛酶制剂的制备方法及应用

一种脱毛酶制剂的制备方法及应用

文献发布时间：2024-05-31 01:29:11

技术领域

本发明属于制革生产中的脱毛酶技术领域，尤其涉及一种脱毛酶制剂的制备方法及应用。

背景技术

目前，制革是古老的行业之一，通过一系列加工操作使毛皮加工成皮革。直到现在，脱毛工序还是使用硫化物和其他大量的化学品。传统的灰碱法脱毛工艺，导致排放废水中化学需氧量(COD)、生物需氧量(BOD)、总固体悬浮物(TTS)非常高。再者，因使用石灰脱毛，还需要用铵盐脱灰，使废水中的氮含量大幅度增加，使其成为主要污染源。

脱毛的使用不仅可以降低传统硫化物脱毛造成的硫污染酶，而且废液中有机物和污泥含量降低，减轻废水处理负荷，酶法脱毛被看成是保护环境的最好选择，酶被看为许多污染化学品的绿色选择。酶脱毛是一种清洁环保的制革生产技术，应用前景广泛，目前制约其发展的主要原因在于：构成工业酶的组分复杂，具有广泛的底物特异性，现有脱毛酶中通常会具有一定量的胶原蛋白酶的活性，在脱毛进行应用时，酶的作用不充分会导致脱毛不完整，而酶的作用过强会损伤皮内胶原纤维，影响皮革品质，因此酶的使用对控制条件要求苛刻，在脱毛过程中应降低胶原蛋白酶活性。

酶法脱毛正是利用酶水解蛋白多糖(粘蛋白)，使之粘度降低，破坏毛和皮的连接，从而达到脱毛目的。同时，皮中的蛋白多糖得到部分水解，达到松散纤维的作用，为鞣制等后续工艺打下基础。蛋白多糖的水解、脱除对成革性能影响很大。总之，酶对皮中蛋白多糖的水解作用，是酶脱毛、软化作用的基础。而蛋白多糖水解将得到蛋白质和糖两部分。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

(1)传统的灰碱法脱毛工艺，导致排放废水中化学需氧量、生物需氧量、总固体悬浮物非常高，同时使得废水中的氮含量大幅度增加。

(2)市场上的脱毛酶大多是蛋白水解活性强的角蛋白酶或者角蛋白酶与其他酶的复合物，脱毛酶专一性不强，角蛋白酶机械地降解了毛囊根部的多糖蛋白的同时，对皮毛表面的多糖蛋白也有一定的损伤。

(3)构成工业酶的组分复杂，具有广泛的底物特异性，现有脱毛酶中会有胶原蛋白酶的活性，在进行脱毛时，酶的作用不充分会导致脱毛不完整。

(4)酶的作用过强会损伤皮内胶原纤维，影响皮革品质，因此酶的使用对控制条件要求苛刻，在脱毛过程中应降低胶原蛋白酶活性。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种脱毛酶制剂的制备方法及应用，尤其涉及一种环保及无损害牛皮的脱毛酶制剂、制备方法及应用。

本发明是这样实现的，一种脱毛酶制剂的制备方法，所述脱毛酶制剂的制备方法包括：

将高温放线菌Laceyella sacchari TCW40643、绿屈挠杆菌Chloroflexibacterium AL-N1AAB21460 AAB21460、芽孢杆菌Bacillusli cheniforrniss ATCC 14580接种于LB培养基中37℃发酵，当OD600值为0.6～0.8时，加入Iptg诱导剂，于转速为200rpm/min的条件下28℃培养16～18h后停止发酵，制成含有脱毛酶的发酵液；将制成的含有脱毛酶的发酵液收集细胞，将细胞用50mMTris-HCL ph＝8.0，50mM NaCL的buffer在振荡器上振荡，直至细胞分散均匀，用高压匀浆破菌仪将其细胞破开，直至清澈，制成脱毛酶液体制剂。

进一步，所述高温放线菌Laceyella sacchari TCW40643、绿屈挠杆菌Chloroflexi bacterium AL-N1 AAB21460、芽孢杆菌Bacillusli cheniforrniss ATCC14580接入发酵培养基之前进行扩大培养；其中，所述菌种活化的扩大培养包括菌种活化，摇瓶菌种的制备。

进一步，所述菌种活化是将高温放线菌Laceyella sacchari TCW40643、绿屈挠杆菌Chloroflexi bacterium AL-N1AAB21460、芽孢杆菌Bacillus licheniforrniss ATCC14580按1～3％的接种量接种于5mL氨苄抗性的LB培养基中，在37℃、转速200rpm/分钟的条件下培养8～10h。

所述摇瓶菌种是将活化后的菌种接种于50～100mL的氨苄抗性的培养基中，在温度37℃，转速200rpm/分钟的条件下培养10～12h。

进一步，所述脱毛酶制剂的制备方法包括以下步骤：

步骤一，将高温放线菌Laceyella sacchari TCW40643、绿屈挠杆菌Chloroflexibacterium AL-N1 AAB21460、芽孢杆菌Bacillusli cheniforrniss ATCC 14580在NCBI中查找并合成基因；

步骤二，在脱毛酶的基因前加融合标签后构建Pet23a-TCW40643、Pet23a-AAB21460、Pet23a-ATCC 14580在大肠杆菌BL21(DE3)中表达；

步骤三，将菌接种在氨苄抗性的LB培养基中，接种后于摇床上摇瓶培养，等OD达到0.6～0.8时，加IPTG诱导，停止发酵，离心收集全细胞；

步骤四，将细胞用50mM Tris-HCl ph＝8.0，50mM NaCL的buffer在振荡器上振荡，直至细胞分散均匀，用高压匀浆破菌仪将细胞破开，直至清澈透明；

步骤五，将破菌混合液离心，取上清，进行western Blot，显示蛋白成功表达，同时用上清进行脱毛实验，反应9h。

进一步，所述步骤二中，脱毛酶基因的碱基序列为SEQ ID NO：1，dCE基因的碱基序列为SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：5，DE序列为SEQ ID NO：6。

进一步，所述步骤二中的在脱毛酶的基因前加融合标签包括：

(1)扩增含有脱毛酶和融合标签Sf(-15)Gfp的序列；

(2)将扩增后的序列克隆到表达载体中从而构建重组质粒；

(3)将重组质粒转入大肠杆菌，通过诱导表达得到目的蛋白的脱毛酶。

进一步，所述重组质粒包括Pet23a-sf(-15)Gfp-TCW40643、Pet23asf(-15)Gfp-AAB21460、Pet23asf(-15)Gfp-ATCC-14580、Pet23a-sf(-15)Gfp-DE-TCW40643、Pet23asf(-15)Gfp-DE-AAB21460、Pet23asf(-15)Gfp-DE-ATCC 14580。

通过合成23asf(-15)-Gfp、AAB21460、TCW40643、ATCC 14580序列所构建脱毛酶的重组质粒的序列包括脱毛酶的序列、融合标签的序列、3C酶的序列和6*His的纯化标签序列；所述表达载体为pET23a，所述大杆菌表达菌株为BL21(DE3)并在N端附加6个组氨酸作为标签。

进一步，所述步骤三中，接种后于37℃，转速200rpm的摇床上摇瓶培养8～10h；加0.5～1mM IPTG，在28℃下诱导16～18h停止发酵；在温度4℃，转速8000rpm、时间8min条件下，离心收集全细胞。

本发明的另一目的在于提供一种所述脱毛酶制剂在羊皮以及其他各种同品质皮毛在脱毛中的工业应用，所述脱毛酶制剂在羊皮以及其他各种皮毛在脱毛中的工业应用方法包括(以羊皮为例，其他皮毛类同)：

(1)选用山羊皮，进行常规侵水，去肉处理，

(2)脱毛处理：将步骤(1)中处理后的山羊皮及水加在锥形瓶中，水重量为皮重的50％，加入脱毛酶制剂进行脱毛处理；

(3)将羊皮浸泡在水中20min并除去肉面脂肪；将羊皮剪成2cm×2cm的小块并置于广口瓶，加入破菌菌体和Buffer，于37℃摇床中反应；

(4)设置23a-sf(-15)Gfp为负对照，三个为实验组，每隔三个小时观察各自的脱毛情况。

其中，所述脱毛酶制剂包括5g的菌体和20mL的buffer，用高压匀浆破菌仪进行破菌，直至菌体清澈透明；所述buffer包括50mM TRIS-HCL pH＝7.0，50mM NaCL。

本发明的另一目的在于提供一种所述脱毛酶制剂在牛皮脱毛中的工业应用，所述脱毛酶制剂在牛皮脱毛中的工业应用方法包括：

(1)浸水：将牛皮浸泡在水中30min并除去肉面脂肪；

(2)脱脂：第一次脱脂液比2：1，2％ Na

(3)将牛皮剪成2cm×2cm的小块；

(4)将剪好的小块的牛皮放进广口瓶，加入酶液，液比2.5：1，于37℃摇床中振荡，摇床的转速为200rpm，每隔一定时间，观察脱毛情况以及皮的情况；

(5)设置23a-sf(-15)Gfp为负对照，三个为实验组，每隔三个小时观察各自的脱毛情况。

结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：

第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：

本发明提供的脱毛酶制剂的制备方法，将脱毛酶基因在大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)进行表达，并且融合了超折叠绿色荧光标签SF(-15)GFP标签，通过带融合标签进行异源表达和不带标签进行异源表达的结果比较得出：融合标签超折叠绿色荧光sf(-15)标签对该蛋白有促可溶表达作用，通过酶活性检测，发现带有融合标签的酶和不带融合标签酶相比，带了融合标签的酶不仅提高了蛋白的表达量，而且能够使蛋白具有活性，说明融合标签对该酶的正确折叠具有引导作用，工业生产中，可以不切除融合标签，直接用于酶促反应，并且脱毛酶在50℃条件下具有较好的脱毛效果。不仅节约了时间，而且加快了脱毛速度，便于该酶在大规模工业生产中广泛应用。

由于本发明提供的酶法脱毛的方法不需要添加硫化物，不仅可以减少污染，改善皮革的质量而且减少了大量污泥及含硫废水，废水中BOD、COD和TSS含量。传统的脱毛方法采用石灰和硫化钠，脱毛效率良好，但皮肤较硬，柔软度较差，色泽灰暗，皮肤的质量受到严重的影响。胶原酶蛋白酶会对皮造成较大的损害，这种损伤会随着制革处理过程的进行而增加。而我们的所拥有的就是低胶原酶活性的脱毛酶，对皮毛的伤害较小，利于皮革粒面清晰，不烂面、不松面。脱毛效果大为提高，便于大规模生产控制和工业应用。由于本发明提供的绿色环保酶法脱毛工艺，废毛可以回收利用，可以创造更大的经济利益。

第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：

本发明提供了一种制革用牛皮酶法脱毛，不仅脱毛快，缩短了脱毛所用的时间，脱毛干净，对皮的表面和粒面无任何损伤，绿色环保。

本发明制备得到的环保及无损害牛皮的脱毛酶制剂有效的解决了传统硫化物脱毛导致的污染，酶法脱毛被看成是保护环境的最好选择，酶被看为许多污染化学品的替代品。废液中有机物和污泥含量降低，减轻废水处理负荷，脱下的毛保存较为完整，不影响再利用。同时，本发明也解决了脱毛酶制剂中胶原蛋白酶水解胶原蛋白而造成的烂皮、粒面破损的技术难题，进而实现了脱毛过程的清洁化生产和获得手感柔软、无粒面损伤和松面的皮毛。

第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：

(1)本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：

经过十多年的发展，我国的皮革皮具产业发展已经形成了一定的规模，成为很多地区重要的新生经济力量。目前，我国的皮革皮具发展主要是低端产品，而中高端的皮具品牌主要还是集中在少数发达国家的手中。其中限制因素主要在意皮革在脱毛过程中，对皮革本身的破坏，导致了皮具品质的降低；同时，传统的灰碱法脱毛不仅伤皮，而且导致严重的环境污染。严重地限制了我国皮革产业的发展。

本发明的酶法专一性温和脱毛方法，包含了一种重要的内肽酶，针对毛囊根部的酶的内部进行水解，从内部瓦解毛囊根本的结构，从而使皮毛脱落，作用温和，不产生副产物，同时没有任何污染。作为灰碱法脱毛的一种替代产品，该方法具有极大的商业价值。

(3)本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：

本发明使用的酶，是一种谷氨酸内肽酶，专一性水解毛囊根本糖蛋白的谷氨酰胺键，使得毛囊松软，皮毛容易脱落。目前，市场上的脱毛酶都是用角蛋白酶然后添加一部分复合的蛋白酶。该脱毛剂解决了灰碱法脱毛中的环境污染问题，但是具有强大的蛋白水解功能的角蛋白酶也会同时水解皮革表面的胶原蛋白，破坏皮革的粒面完整性，降低皮革的品质。利用该方法和该酶进行脱毛，融合了SF(-15)GFP标签，使得该酶被固定在菌体的表面或者周质空间，并且实验表面，融合标签对酶的活性没有影响。工程菌种经过高密度发酵之后，可以直接脱膜，就可以直接用于脱毛，减少了破壁后工程菌种内部的蛋白酶释放对皮革的伤害，很好的保持皮革的粒面完整下，提高皮革的品质。

从已经发表的文献和现有的专利查询上来看，该方法是目前国内外第一个使用内肽酶进行脱毛酶制备的方法。

(3)本发明的技术方案解决了人们一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题：

本发明能够一方面解决灰碱法脱毛中的环境污染问题，同时解决了目前市面上酶法脱毛中，蛋白酶对皮革的胶原蛋白的水解，从而降低皮革的品质的问题。使用专一性的内肽酶作为脱毛剂的主要成分，酶水解位置专一，具有很好的商业化前景。

(4)本发明的技术方案克服了技术偏见：

本发明，利用了SF(-15)GFP标签对蛋白酶进行了融合表达，从实验室结果显示，融合标签能将蛋白酶从不可溶表达，促溶到可溶表达，并且正取折叠。通过SDS-PAGE的结果来看，该融合标签可以将该酶锚定在工程菌种的膜上，这样通过简单的洗膜处理，就可以将大部分的内肽酶洗脱下来，减少了工业生产中的破菌的过程。降低了生产成本，同时也避免了破菌后，菌种内本身的蛋白酶释放对脱毛活性的影响，提高脱毛后皮革的质量，是一种新的可有效用于脱毛的脱毛酶。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的脱毛酶制剂的制备方法流程图；

图2是本发明实施例提供的基因和载体扩增图；其中，M：DL 1Kb DNA Marker；泳道1～2：pET23a-sf(-15)gfp载体反扩片段，以pET23a-sf(-15)Gfp-F和pET23a-sf(-15)Gfp-R为引物PCR扩增获得；泳道3～4：pET23a-sf(-15)Gfp-DE载体反扩片段，以pET23a-sf(-15)Gfp-F和pET23a-sf(-15)Gfp-DE-R为引物PCR扩增获得；泳道5～6：TCW40643基因扩增片段，以TCW4064-F和TCW4064-R为引物PCR扩增获得；泳道7～8：AAB21460基因扩增片段，以AAB21460-F和AAB21460-R为引物PCR扩增获得；泳道9：ATCC 14580基因扩增片段，以ATCC14580-F和ATCC 14580-R为引物PCR扩增获得；

图3是本发明实施例提供的菌落PCR鉴定重组子示意图；其中，M：DL1kbDNAMarker；泳道1～17：样品PCR泳道(以菌液为模板扩增)；泳道18：正对照(以ATCC 14580质粒为模板扩增)；

图4是本发明实施例提供的蛋白表达跑胶图；其中，M：PageRulerTM PrestainedProtein Ladder；泳道1：23asf(-15)Gfp-TCW40643全菌，23asf(-15)Gfp-TCW40643上清；23asf(-15)Gfp-TCW40643沉淀；泳道4：23asf(-15)Gfp-AAB21460全菌，泳道5：23asf(-15)Gfp-AAB21460上清，泳道6：23asf(-15)Gfp-AAB21460沉淀，泳道7：pET23a-sf(-15)Gfp-ATCC 14580上清，pET23a-sf(-15)Gfp-ATCC 14580沉淀，pET23a-sf(-15)Gfp-ATCC 14580全菌；

图5是本发明实施例提供的Pet23a-sf(-15)Gfp-TCW40643、Pet23asf(-15)Gfp-AAB21460、Pet23asf(-15)Gfp-ATCC-14580、Pet23a-sf(-15)Gfp-DE-TCW40643、Pet23asf(-15)Gfp-DE-AAB21460、Pet23asf(-15)Gfp-ATCC 14580脱毛酶在50℃下牛皮脱毛效果图；图(a)为23asf(-15)gfp对照，图(b)为Pet23asf(-15)Gfp-AAB2146，图(c)为Pet23a-sf(-15)Gfp-TCW40643，图(d)为Pet23asf(-15)Gfp-ATCC 14580；

图6是本发明实施例提供的Pet23a-sf(-15)Gfp-TCW40643、Pet23asf(-15)Gfp-AAB21460、Pet23asf(-15)Gfp-ATCC-14580、Pet23a-sf(-15)Gfp-DE-TCW40643、Pet23asf(-15)Gfp-DE-AAB21460、Pet23asf(-15)Gfp-ATCC 14580脱毛酶牛皮脱毛效果图；图(a)为未反应前，图(b)为23asf(-15)gfp对照，图(c)为化学脱毛法，图(d)为Pet23asf(-15)Gfp-AAB2146，图(e)为Pet23a-sf(-15)Gfp-TCW40643，图(f)为Pet23asf(-15)Gfp-ATCC 14580；

图7是本发明实施例提供的Pet23a-sf(-15)Gfp-TCW40643、Pet23asf(-15)Gfp-AAB21460、Pet23asf(-15)Gfp-ATCC-14580、Pet23a-sf(-15)Gfp-DE-TCW40643、Pet23asf(-15)Gfp-DE-AAB21460、Pet23asf(-15)Gfp-ATCC 14580脱毛酶羊皮脱毛效果图；图(a)为23asf(-15)gfp对照，图(b)为Pet23asf(-15)Gfp-AAB2146，图(c)为Pet23a-sf(-15)Gfp-TCW40643，图(d)为Pet23asf(-15)Gfp-ATCC；

图8是本发明实施例提供的pET23a-sf(-15)Gfp-DE-TCW40643、pET23a-sf(-15)Gfp-DE-AAB21460、pET23a-sf(-15)Gfp-DE-ATCC 145800脱毛酶牛皮脱毛效果图；图(a)为23a-sf(-15)Gfp-DE对照，图(b)为23a-sf(-15)Gfp-DE-AAB214，图(c)为23a-sf(-15)Gfp-DE-TCW40643，图(d)为23a-sf(-15)Gfp-DE-ATCC 14580；

图9是本发明实施例提供的pET23a-sf(-15)Gfp-DE-TCW40643、pET23a-sf(-15)Gfp-DE-AAB21460、pET23a-sf(-15)Gfp-DE-ATCC 145800脱毛酶羊皮脱毛效果图；图(a)为23a-sf(-15)Gfp-DE对照，图(b)为23a-sf(-15)Gfp-DE-AAB214，图(c)为23a-sf(-15)Gfp-DE-TCW40643，图(d)为23a-sf(-15)Gfp-DE-ATCC 14580；

图10是本发明实施例提供的羟脯氨酸标准曲线图；

图11是本发明实施例提供的测的羟脯氨酸含量示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种脱毛酶制剂、制备方法及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。

一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。

如图1所示，本发明实施例提供的脱毛酶制剂的制备方法包括以下步骤：

S101，将高温放线菌Laceyella sacchari TCW40643、绿屈挠杆菌Chloroflexibacterium AL-N1 AAB21460、芽孢杆菌Bacillusli cheniforrniss ATCC 14580在NCBI中查找并合成基因；

S102，在脱毛酶的基因前加融合标签后构建Pet23a-TCW40643、Pet23a-AAB21460、Pet23a-ATCC 14580在大肠杆菌BL21(DE3)中表达；

S103，将菌接种在氨苄抗性的LB培养基中，接种后于摇床上摇瓶培养，等OD达到0.6～0.8时，加IPTG诱导，停止发酵，离心收集全细胞；

S104，将细胞用50mM Tris-HCl ph＝8.0，50mM NaCL的buffer在振荡器上振荡，直至细胞分散均匀，用高压匀浆破菌仪将细胞破开，直至清澈透明；

S105，将破菌混合液离心，取上清，进行Western Blot，显示蛋白未表达，同时用上清进行脱毛实验，反应9h。

本发明实施例提供的促溶及提升脱毛酶活性的方法为：在脱毛酶上融合标签sf(-15)GFP标签；其中，脱毛酶基因的碱基序列为SEQ ID NO：1，dCE基因的碱基序列为SEQ IDNO：2～SEQ ID NO：5，DE序列为SEQ ID NO：6。

No:1-23a:

gatccggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggattggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatggatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgcagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacagggatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgcctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtctggcttctgataaagcgggccatgttaagggcggttttttcctgtttggtcactgatgcctccgtgtaagggggatttctgttcatgggggtaatgataccgatgaaacgagagaggatgctcacgatacgggttactgatgatgaacatgcccggttactggaacgttgtgagggtaaacaactggcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaatcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggtgttccacagggtagccagcagcatcctgcgatgcagatccggaacataatggtgcagggcgctgacttccgcgtttccagactttacgaaacacggaaaccgaagaccattcatgttgttgctcaggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgcttcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattctgctaaccagtaaggcaaccccgccagcctagccgggtcctcaacgacaggagcacgatcatgcgcacccgtggccaggacccaacgctgcccgagatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactatagggagaccacaacggtttccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgcaccatcatcatcatcat

NO:2-TCW40643序列：

atgaccaagaagaagagaattggtttgtccattgtgtccttgtccttgtccgccgttttggccatgccatttgctgttggtacccccaccgcctctgccacctctggtaagttgtccccccatactccagtttcctctgatggtactgtttttgaagctgctaagactttttctggtgttgttactgaagctaatggttcttacgttaagggttatgaaggtactggaaagaagtctcccgttaagattaagggtggtaaggttgctcctgtgagatctgctgaaggtaacgagggtgatgtttctactgaaagtgttattggtacagatgagagaactagagtgactaacactactacttacccatacagagctatcgctcatattgaatccgatattggtggttgtactggttggatgatagatgctgatactgttgctactgctggtcactgcatttatgatccaggatcaggaaagtgggcttcctgggctaaggtttaccctggtagaaacggttctactgctccttacggttacgctaatgctgttaattttttttctgtcaccggttggacccaaaacggtgatactaactacgattatggtgctattaagcttgataagccaattggtgattctactggttggtttggtcttagagttgtttctggttctcttaatggaatggctcaaaatataagtggttaccctggtgataagacttacggtactcaatgggaagatgctgatcaagttagagagacttacacttataaggttcattacgctaacgatacttatggtggtcaatccggatccccagtttacaattcttcttcttgcggtacttgttctattgctattcatactaatggtgtgtacggtggtaacccatataacagaggtactagaatcactcaagaggtctttaacaaccttaatacttggaagaacaga

NO:3-AAB21460序列：

atgccaacctttagagtttttgccagattgagaaccattgccgttactataaccgtttttttgtccattgttatcttgttgtcccacgccgttcccgcccaagcccaaaacaccgacggtgatccagagcaaccagatgatgccaagatgcacaagactgtttcctctgatggttacattccaccctctctggctgctcatgaaactgtggatttctccccagcctttgaaggaaacggtcaattggtcaacaacggtgctgaattggtttttgataagcctgttgctccagttgctgttcccggtgatggtgctggtatagaatctgtcattggtccagattctagataccaaattactaacactacttcttctacttacagaaagattgttcatatcacttctaacatcggtggttgtactggttggttgatttccgctaacactgttgctactgctggtcattgtatatacaacggtggatgggcttctaacgttagagtctacccaggtagaaacggttcttctactccatatggttcttgttctgctcaaagattgtactctactactggttggactcaatctagatctcctaactatgattacggagccattaagttgaactgtactgtcggtaaccaaacaggttggtttggttttaagtggaaggatggtggtagaaacggagagggtactaacattgccggttacccaggtgataagccatatgctaccatgtggagatctaatgataaggttagagttactcagtcattgagattgttttacgctaacgataccataggtggtatgtccggtagtccagtttggaacaacgccttgtgtaatcaatgtgctatagctatccatgcctatggtgttggatccaccggttacaacggtggtactagaattactcagcaagttttcaataacttgacttcttggaagaactcc

NO:4-ATCC 14580序列：

gctccatctccacacactccagtttcttccgatccatcttacaaggccgagacttccgttacttacgacccaaacattaagtccgaccagtacggtctgtactccaaggcttttactggtactggtaaggtcaacgagacaaaagagaaggctgagaagaagtccccagctaaggctccatactctatcaagtccgttattggttccgacgacagaaccagagttaccaacactactgcttacccatacagagccatcgtccacatttcatcctccatcggttcttgtaccggttggatgattggtccaaagactgttgctactgccggtcactgtatctacgatacctcttctggttccttcgctggtactgctactgtttctccaggtagaaacggtacttcttacccttacggttccgtcaagtccaccagatacttcattccatctggttggagatccggtaacaccaactacgactacggtgctattgaactgtccgagccaatcggtaacactgttggttacttcggttactcctacaccacttcttccctggttggtactaccgttaccatctctggttacccaggtgataagactgctggtactcaatggcaacactccggtccaattgctatctccgagacttacaagttgcagtacgctatggacacttacggtggtcaatctggttctccagttttcgaacaatcctcctccagaactaactgttccggtccatgttctttggccgttcacactaacggtgtttacggtggatcttcctacaacagaggtactaggatcaccaaagaggtgttcgacaacctgaccaactggaagaactccgctcag

NO:5-Gfp序列：

atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgcgcggcgagggcgagggcgatgccaccaacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcagcttcaaggacgacggcacctacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaacttcaacagccacaacgtctatatcaccgccgacaagcagaagaacggcatcaaggccgaatttgaaattcgtcataatgtggaagatggcagcgtgcagctggcggatcattatcagcagaataccccgattggcgatggcccagtgctgctgccggatgaccactatctgagcaccgaaagcgtgctgagcaaagatccgaatgaagatcgtgatcatatggtcctgctggaatttgtgaccgcggcaggcattgatctgggcatggatgaactgtataaa

NO:6-DE序列：

gacgaggatgaggatgaagatgaggacgaagacgaa

本发明实施例提供的促溶并通过简单的洗膜处理就可以进行皮革脱毛的方法包括以下步骤：

将扩增后的序列克隆到表达载体中构建重组载体；

扩增含有脱毛酶和融合标签的序列；

通过武汉擎科生物工程有限公司合成23asf(-15)gfp、AAB21460、TCW40643、ATCC14580序列并在其N端附加6个组氨酸作为标签，利用表1所示的引物，将融合标签和脱毛酶串联起来，取首尾引物(5～10mM)作为引物，进行pcr扩增，最终以琼脂糖凝胶上，大小正确的DNA确定为疑似正确DNA，切胶回收大小正确的DNA，装入Pet23a-(sf-15)载体上，测序检测基因正确性。

载体构建所需引物见表1。

表1载体构建所需引物

具体操作步骤如下：利用引物F：23a-GFP-F和引物R：23a-GFP-R以合成的23a-GFP基因载体为模板，获得23a-GFP的基因；利用引物F：23a-GFP-F和引物R：23a-GFP-DE-R以合成的23a-GFP-DE基因载体为模板，获得23a-GFP-DE的基因；利用引物F：TCW40643和引物R：TCW40643，以合成的TCW40643基因为模板，获得TCW40643基因；利用引物F：ATCC 14580和引物R：ATCC 14580，以合成的基因ATCC 14580为模板，获得ATCC 14580基因；利用引物F：AAB21460和引物R：AAB21460以合成的基因AAB21460为模板，获得AAB21460的基因；利用引物F：23a-GFP-F和引物R：23a-GFP-DE-R，以合成的23a-GFP-DE-R基因为模板，获得23a-GFP-DE-R基因。

得到扩增片段后，用DPNI酶对扩增片段进行消化处理，本实验外源DNA片段的装配均采用T5核酸外切酶介导的装配方法操作，对线性化DNA片段从5′端到3′端进行消化。因此在设计引物时在两条引物的5′端分别带有载体酶切位点处的15bp左右的同源臂；经T5核酸外切酶对外源DNA和载体片段进行处理，再借助大肠杆菌的修复功能，即得到重组表达载体。按载体片段与外源片段摩尔比1：3取相应体积的DNA片段混合；于冰水混合物上加入一个酶活单位的T5核酸外切酶，并在此条件下反应5min；反应完毕后加入克隆感受态细胞，进行常规转化。37℃培养18h后，挑取筛选平板上的单克隆菌落，抽提质粒，用扩增片段两端的引物作为引物，质粒作为模板，PCR验证重组子，测序确认重组质粒的正确性，得到质粒pET23a-sf(-15)Gfp-AAB21460、pET23a-sf(-15)Gfp-ATCC14580、pET23a-sf(-15)Gfp-TCW40643、pET23a-sf(-15)Gfp-DE-TCW40643、pET23a-sf(-15)Gfp-DE-AAB21460、pET23a-sf(-15)Gfp-DE-ATCC 145800，-20℃保存待用。

pET23a-sf(-15)Gfp-AAB21460、pET23a-sf(-15)Gfp-ATCC14580、pET23a-sf(-15)Gfp-TCW40643、pET23a-sf(-15)Gfp-DE-TCW40643、pET23a-sf(-15)Gfp-DE-AAB21460、pET23a-sf(-15)Gfp-DE-ATCC 145800在大肠杆菌Bl21中表达，将菌接种在氨苄抗性的LB培养基中，接种后于37℃，转速200rpm摇床上摇瓶培养，等OD达到0.6～0.8时，加0.5～1mMIPtg诱导。

B.脱毛酶制剂制备：在28℃下诱导18h停止发酵，在温度4℃，转速8000rpm、时间8min条件下，离心收集其的全细胞。将pET23a-sf(-15)Gfp-AAB21460、pET23a-sf(-15)Gfp-ATCC14580、pET23a-sf(-15)Gfp-TCW40643其细胞用50mM Tris-HCl pH＝8.0、50mM NaCL的buffer在振荡器上振荡，直至细胞分散均匀，用高压匀浆破菌仪将其细胞破开，直至清澈透明，便可用做脱毛酶制剂pET23a-sf(-15)Gfp-DE-TCW40643、pET23a-sf(-15)Gfp-DE-AAB21460、pET23a-sf(-15)Gfp-DE-ATCC 145800收集细胞，直接用细胞做脱毛酶制剂。

为便于适于工业化生产，优选的技术实施方式是，所述的将高温放线菌Laceyellasacchari TCW40643、绿屈挠杆菌Chloroflexi bacterium AL-N1AAB21460、芽孢杆菌Bacillus licheniforrniss ATCC 14580接入发酵培养基之前进行扩大培养。所述的扩大培养包括菌种活化，摇瓶菌种的制备。

所述的菌种活化是将高温放线菌Laceyella sacchari TCW40643、绿屈挠杆菌Chloroflexi bacterium AL-N1AAB21460 AAB21460、芽孢杆菌Bacillusli cheniforrnissATCC 14580按1～3％接种量接种于5mL氨苄抗性的LB培养基中，在温度37℃、转速200rpm/分钟的条件下培养8～10h。

摇瓶菌种是将活化后的菌种接种于50～100mL的氨苄抗性的培养基中，在温度37℃，转速200rpm/分钟的条件下培养10～12h。

本发明实施例提供的基因和载体扩增图如图2所示，菌落PCR鉴定重组子示意图如图3所示，蛋白表达跑胶图如图4所示。

二、应用实施例。为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用实施例。

实施例1：脱毛酶制剂在羊皮脱毛中的应用

本发明实施例提供的脱毛酶制剂在羊皮脱毛中的应用包括如下工艺步骤：

1.选用山羊皮，进行常规侵水，去肉处理；

2.脱毛处理：将步骤1中处理后的山羊皮及水加在锥形瓶中，水重量为皮重的50％，加入脱毛酶制剂进行脱毛处理；

脱毛酶制剂包括5g的菌体和20mL的buffer(50mM TRIS-HCL pH＝7.0，50mMNaCL)，用震荡器把菌悬起来，用高压匀浆破菌仪进行破菌，直至菌体清澈透明；把菌体8000rpm离心20min，收集离心上清；

3.浸水：把羊皮浸泡在水中，泡20min，使羊皮充分柔软；

4.将步骤1所制备的侵水后的羊皮除去肉面脂肪；

5.把羊皮剪成2cm×2cm的小块；

6.把剪好的小块的羊皮放进广口瓶，加入8mL破菌菌体和8mL Buffer，于37°摇床中振荡，摇床的转速为200rpm，每隔一定时间，观察脱毛情况以及皮的情况。

7.设置23a-sf(-15)Gfp为负对照，三个为实验组，每隔三个小时观察各自的脱毛情况。

本发明实施例提供的Pet23a-sf(-15)Gfp-TCW40643、Pet23asf(-15)Gfp-AAB21460、Pet23asf(-15)Gfp-ATCC-14580、Pet23a-sf(-15)Gfp-DE-TCW40643、Pet23asf(-15)Gfp-DE-AAB21460、Pet23asf(-15)Gfp-ATCC 14580脱毛酶羊皮脱毛效果图如图7所示。

实施例2：脱毛酶制剂在牛皮脱毛中的应用

本发明实施例提供的脱毛酶制剂在牛皮脱毛中的应用包括如下工艺步骤：

1.浸水：把牛皮浸泡在水中，泡20min，侵水不仅能高效的对皮内纤维间质发生作用，去除一些非纤维蛋白，例如球蛋白、白蛋白、黏蛋白等，使生皮迅速恢复至新鲜状态，保证皮的柔软度；

2.将步骤1所制备的侵水后的牛皮除去肉面脂肪；

3.脱脂：第一次脱脂，液比2：1，2％ Na

4.最后，把皮剪成2cm×2cm的小块；

5.把剪好的小块的牛皮放进广口瓶，加入酶液，液比2.5：1，于37℃摇床中振荡，摇床的转速为200rpm，每隔一定时间，观察脱毛情况以及皮的情况；

6.设置23a-sf(-15)Gfp为负对照，三个为实验组，每隔三个小时观察各自的脱毛情况。

将目的基因片段与载体片段进行转化，并在长出菌体后，进行菌落PCR筛选重组子。对于阳性菌落送菌液至金开瑞送测，筛选出组合正确的菌体，并对其进行质粒的抽提。以pET23a-sf(-15)gfp-ATCC 14580-F为例，进行菌落PCR的凝胶电泳结果如图3所示。

实施例3：脱毛酶制剂在羊皮脱毛中的应用

本发明实施例提供的脱毛酶制剂在羊皮脱毛中的应用包括如下工艺步骤：

1.用山羊皮，进行常规侵水，去肉处理；

2.脱毛处理：将步骤1中处理后的山羊皮及水加在锥形瓶中，水重量为皮重的50％，加入脱毛酶制剂进行脱毛处理；

脱毛酶制剂包括0.65g的菌体和20mL的buffer(50mM TRIS-HCL pH＝7.0，50mMNaCL)，用震荡器把菌悬起来，直接用全细胞作反应；

3.浸水：把羊皮浸泡在水中，泡20min，使羊皮充分柔软；

4.将步骤3所制备的侵水后的羊皮除去肉面脂肪；

5.把羊皮剪成2cm×2cm的小块；

6.把剪好的小块的羊皮放进广口瓶，加入8mL细胞和8mL Buffer(50mM TRIS-HCLpH＝7.0，50mM NaCL)，于37℃摇床中振荡，摇床的转速为200rpm，每隔一定时间，观察脱毛情况以及皮的情况；

7.设置23a-sf(-15)Gfp-DE为负对照，三个为实验组，每隔三个小时观察各自的脱毛情况。

本发明实施例提供的pET23a-sf(-15)Gfp-DE-TCW40643、pET23a-sf(-15)Gfp-DE-AAB21460、pET23a-sf(-15)Gfp-DE-ATCC 145800脱毛酶羊皮脱毛效果图如图9所示。

实施例4：脱毛酶制剂在牛皮脱毛中的应用

本发明实施例提供的脱毛酶制剂在牛皮脱毛中的应用包括如下工艺步骤：

2.将步骤1所制备的侵水后的牛皮除去肉面脂肪；

3.脱脂：第一次脱脂，液比2：1，2％ Na

4.最后，把皮剪成2cm×2cm的小块；

5.把剪好的小块的牛皮放进广口瓶，把0.65g的细胞用20mL buffer(50mM TRIS-HCL pH＝7.0，50mM NaCL)在振荡器上振荡，于37℃摇床中反应，摇床的转速为200rpm，每隔一定时间，观察脱毛情况以及皮的情况；

6.设置23a-sf(-15)Gfp-DE为负对照，三个为实验组，每隔三个小时观察各自的脱毛情况。

本发明实施例提供的pET23a-sf(-15)Gfp-DE-TCW40643、pET23a-sf(-15)Gfp-DE-AAB21460、pET23a-sf(-15)Gfp-DE-ATCC 145800脱毛酶牛皮脱毛效果图如图8所示。

实施例5：不同酶脱毛工艺脱毛废液液中羟脯氨酸含量测定

羟脯氨酸(hydroxyproline)是胶原蛋白的一种特有氨基酸。其测定对胶原蛋白代谢的研究有重要意义。

实验方法和步骤：羟脯氨酸含量的测定采用氯胺T氧化法。

1.柠檬酸缓冲液的配制：准确称取13g柠檬酸，12.15g氢氧化钠，39g乙酸钠，125mL正丙醇，用去离子水溶解并定容至500mL。

2.氯胺T溶液配制：准确称取1.41g氯胺T，用10mL正丙醇溶解，用柠檬酸缓冲液定容至100mL。(现配现用)显色剂的配制：称取对二甲氨基苯甲醛10g，用正丙醇/高氯酸2：1(v/v)溶液溶解并定容至100mL。

3.标准曲线绘制：取6只试管，分别标记0、1、2、3、4、5，加入0、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0mL 20μg/mL L-羟脯氨酸标准溶液，用水补充至4mL。分别加入氯胺T溶液2mL，25℃下反应20min，再加入对二甲氨基苯甲醛显色剂2mL，充分摇匀，60℃下反应15min，然后冷却10min。以0号管为空白组，于558nm下比色，制作标准曲线。

4.羟脯氨酸含量测定：取样品液4mL于试管中，然后加入2mL氯胺T溶液，25℃下反应20min，再加入2mL对二甲氨基苯甲醛显色剂，震荡混合，60℃下加热15min，然后冷却10min。于558nm下比色，测得的OD值代入标准曲线中计算出样品液中的羟脯氨酸含量，平行测定三次取平均值。

本发明实施例提供的羟脯氨酸标准曲线图如图10所示，本发明实施例提供的测的羟脯氨酸含量示意图如图11所示。

三、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。

(1)与现有技术相比，本发明提供的酶是通过sf(-15)Gfp的标签使得一种新的谷氨酰胺内肽酶能够分泌到大肠杆菌的外膜和周质空间中，利用该方法得到工程菌种，目前未见报道。属于国际上首次这样尝试。通过该方法获得工程菌种，可以不用破壁，直接洗膜就可以实现皮革脱毛，减少了工业生产中的破壁这道工艺。

(2)本发明提供的酶法脱毛的方法，用本方法脱毛跟市面上的脱毛剂的脱毛进行比较，发现只有本发明脱毛后溶液里的羟脯氨酸含量达到0.03mg/mL后就不再增加，但是脱毛效果依然存在。而市面上的脱毛酶脱毛后，羟脯氨酸含量一直升高，说明市面上的脱毛酶对皮革表面的胶原蛋白的伤害是明显存在的。

(3)本发明相对于传统的灰碱法脱毛，具有极大的环境友好优势。脱毛后的毛发可以再次水解利用制备多肽和氨基酸；相对于市面上的脱毛酶，具有水解专一，不伤皮，不破坏粒面，提高皮革脱毛后的品质等优势。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

<110>湖北大学

<120>一种脱毛酶制剂的制备方法及应用

<160>15

<210>1

<211>3584

<212>DNA