油脂抗氧化剂的固相微萃取-高效液相色谱在线联用检测方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种油脂抗氧化剂的固相微萃取-高效液相色谱在线联用检测方法。

背景技术

油脂在加工贮存使用过程中如果长期受空气、光照、温度、水分、杂质、重金属离子及微生物等因素的影响则会发生氧化酸败变质，油脂的酸败不仅会影响油脂产品及其制品的品质，还会对人体构成衰老、肿瘤、心血管疾病等健康隐患。食品工业中，通常采取向油脂中添加抗氧化剂的方式来延缓或消除油脂的氧化酸败。酚型抗氧化剂是油脂中常用的抗氧化剂，其代表性物质主要包括：叔丁基对羟基茴香醚（BHA）、没食子酸丙酯（PG）、特丁基对苯二酚（TBHQ）、二丁基羟基甲苯（BHT）等。然而，不容忽视的是，这些抗氧化剂的毒副作用较大，对人体健康有不利影响，如BHA有潜在的致癌性，BHT可能会抑制人体呼吸酶活性，并引起肝脏损伤等。因此，对油脂中的抗氧化剂含量进行高灵敏检测是很有必要的。由于实际样复杂基质对分析检测的干扰，通常在检测前，都需要对样品进行预处理，以减少杂质干扰、富集分析对象、提高检测灵敏度。

共价有机骨架（COFs）是一类由C、H、O、N、B 等轻质元素通过共价键结合形成的多孔有机聚合物，其在样品预处理中显示出良好的应用潜力，其作用机理主要为COFs含有丰富的苯环和-C=N官能团，提供了强的π-π堆积作用，同时COFs的多孔结构也保证了较大的吸附容量。由于BHA、PG、TBHQ等酚型油脂抗氧化剂在化学结构上都带有含苯环的π-π共轭体系，这类物质可以与COFs之间产生π-π堆积相互作用，这为我们开发油脂抗氧化剂的选择性萃取富集材料提供了一种新思路。本发明首先制备共价有机骨架功能化固相微萃取整体柱；再以该整体柱作为固相微萃取介质，利用整体柱中含有的COFs与酚型油脂抗氧化剂之间的π-π堆积作用以及整体柱的脲醛树脂基质与酚型油脂抗氧化剂之间的亲水相互作用的协同作用，实现油脂样品中微量油脂抗氧化剂的高效萃取富集，并消除实际样基质中杂质对分析检测的干扰；并结合固相微萃取-高效液相色谱在线联用系统，建立一种油脂抗氧化剂的在线联用检测方法。目前，尚未有使用共价有机骨架功能化整体柱在线富集萃取油脂抗氧化剂的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种油脂抗氧化剂的固相微萃取-高效液相色谱在线联用检测方法。本发明首先制备共价有机骨架功能化固相微萃取整体柱；再以该整体柱作为固相微萃取介质；得益于整体柱与酚型油脂抗氧化剂之间协同萃取作用（即：共价有机骨架的π-π堆积作用以及脲醛树脂基质的亲水相互作用），实现实际油脂样品中微量抗氧化剂的高效萃取富集与在线净化；并结合固相微萃取-高效液相色谱在线联用系统，建立一种油脂抗氧化剂的在线联用检测方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

固相微萃取-高效液相色谱在线联用系统的构建与运行：

本发明涉及的固相微萃取-高效液相色谱在线联用系统参考相关专利（专利号：2018207623454）构建，主要由一个十通阀、一个六通阀、共价有机骨架功能化固相微萃取整体柱、一台液相色谱输液泵-泵A、0.5 mL PEEK管定量环、一台液相色谱输液泵-泵B、0.2 mLPEEK管定量环、液相色谱分析柱和检测器组成。

所述的联用系统具体操作步骤如下：

第一步，在线联用系统的十通阀和六通阀都处于LOAD位置；装载液通过泵A平衡共价有机骨架功能化固相微萃取整体柱，流速为0.1 mL/min；流动相通过泵B直接经分析柱以获得色谱分离需要的稳定基线，流速为1.0 mL/min；同时，通过进样针将样品溶液注满0.5mL PEEK管定量环；

第二步，六通阀调至INJECT位置，在线固相微萃取开始，0.5 mL PEEK管定量环中的样品经由装载液带入共价有机骨架功能化固相微萃取整体柱，经过给定的时间，六通阀调回LOAD位置；

第三步，将泵A输送的溶液由装载液换成洗脱液，流速设为0.1 mL/min，利用洗脱液将共价有机骨架功能化固相微萃取整体柱上富集的分析对象洗脱，并收集在0.2 mLPEEK管定量环中；当洗脱完成时，十通阀调节至INJECT位置，利用流动相将收集的洗脱液送入液相色谱分析柱中进行分离，接着利用检测器进行检测。

其中，所述的样品溶剂和装载液组成为：按体积分数比计，乙腈/5 mmol/L pH=6.0甲酸铵水溶液=40/60；所述的流动相为：按体积分数比计，乙腈/0.05%甲酸水溶液= 60/40；所述的洗脱液为：乙腈；所述的分析柱为C18液相色谱分析柱；所述的检测器为紫外检测器；柱温箱温度为40 ℃，检测波长为201 nm。

所述共价有机骨架功能化固相微萃取整体柱，由共价有机骨架纳米微球、尿素水溶液、甲醛水溶液以及催化剂混合制备而成，其中共价有机骨架纳米微球、尿素水溶液、甲醛水溶液、催化剂的质量比为2:9:11:2。所述尿素水溶液，其浓度为1 g/mL；所述甲醛水溶液，其中甲醛的质量浓度为33% ~ 37 %；所述催化剂为盐酸水溶液，其浓度为0.1 mol/L。

所述共价有机骨架功能化固相微萃取整体柱的制备方法，包括如下步骤：

（1）清洗空管：用色谱纯甲醇冲洗空聚四氟乙烯管，然后置于60℃烘箱中烘干，待用；其中，所用的聚四氟乙烯管管长为10 cm，内径为750 μm；

（2）制备共价有机骨架纳米微球；将0.04 mmol 1,3,5-三(4-氨苯基)苯和0.06mmol 对苯二甲醛混溶于5 mL乙腈中，超声处理1分钟后加入1 mL 12 mol/L冰醋酸，涡流混合并剧烈振荡10 秒后，在室温下静置72小时，离心收集沉淀；接着用无水四氢呋喃和无水乙醇分别洗涤三次，60℃真空干燥24 小时，即得到共价有机骨架纳米微球。

（3）管内快速缩聚：将共价有机骨架纳米微球、甲醛水溶液、尿素水溶液、催化剂按比例均匀混合，快速振荡1分钟，再将混合物快速注满洗净干燥的聚四氟乙烯管中，两端封闭并浸于65℃水浴中恒温加热10分钟；

（4）冲洗整体柱：待反应完成后，以水为流动相，使用液相色谱泵冲洗整体柱，去除柱床内残留的溶剂与未反应物质，即得到所述共价有机骨架功能化固相微萃取整体柱；在进行在线固相微萃取操作前，整体柱使用装载液平衡半小时。

本发明的显著优点在于：

1）传统的酚型油脂抗氧化剂的富集萃取主要使用反相固定相，油脂中大量的非极性物质会对分析对象的富集萃取造成较大干扰；本发明以共价有机骨架功能化固相微萃取整体柱作为固相微萃取介质，利用整体柱与酚型油脂抗氧化剂之间协同萃取作用（即：共价有机骨架的π-π堆积作用以及脲醛树脂基质的亲水相互作用），实现分析对象的高效富集萃取；此外，整体柱基质的亲水作用大大降低了非极性杂质的吸附，减少了实际样基质对分析对象富集与分析的影响。

2）本发明基于在线联用系统进行分析检测，与常规检测方法相比检测效率大大提高，系统的自动化程度也得到提升。

附图说明

图1为以共价有机骨架功能化整体柱作为固相微萃取介质，构建固相微萃取-高效液相色谱在线联用系统，在线富集检测没食子酸丙酯（PG）、特丁基对苯二酚（TBHQ）、叔丁基对羟基茴香醚（BHA）时，装载液中乙腈含量对分析对象富集效率的影响。

图2为以共价有机骨架功能化整体柱作为固相微萃取介质，构建固相微萃取-高效液相色谱在线联用系统，在线富集检测食用油添加的微量油脂抗氧化剂的色谱图。a为常规液相色谱系统分析色谱图；b为在线联用系统分析色谱图。

图3为以共价有机骨架功能化整体柱作为固相微萃取介质，构建固相微萃取-高效液相色谱在线联用系统，在线富集检测不同食用油实际样品的色谱图。a为某品牌调和油的在线联用系统分析色谱图；b为某品牌葵花籽油的在线联用系统分析色谱图；c为某品牌花生油的在线联用系统分析色谱图。

具体实施方式

为了使本发明所述内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

所述共价有机骨架功能化固相微萃取整体柱，由共价有机骨架纳米微球、尿素水溶液、甲醛水溶液以及催化剂混合制备而成，其中共价有机骨架纳米微球、尿素水溶液、甲醛水溶液、催化剂的质量比为2:9:11:2。

所述尿素水溶液，其浓度为1 g/mL；所述甲醛水溶液，其中甲醛的质量浓度为37%；所述催化剂为盐酸水溶液，其浓度为0.1 mol/L。

所述共价有机骨架功能化固相微萃取整体柱的制备方法，包括如下步骤：

（1）清洗空管：用色谱纯甲醇冲洗空聚四氟乙烯管，然后置于60℃烘箱中烘干，待用；其中，所用的聚四氟乙烯管管长为10 cm，内径为750 μm；

（2）制备共价有机骨架纳米微球；将0.04 mmol 1,3,5-三(4-氨苯基)苯和0.06mmol 对苯二甲醛混溶于5 mL乙腈中，超声处理1分钟后加入1 mL 12 mol/L冰醋酸，涡流混合并剧烈振荡10 秒后，在室温下静置72小时，离心收集沉淀；接着用无水四氢呋喃和无水乙醇分别洗涤三次，60℃真空干燥24 小时，即得到共价有机骨架纳米微球。

（3）管内快速缩聚：将共价有机骨架纳米微球、甲醛水溶液、尿素水溶液、催化剂按比例均匀混合，快速振荡1分钟，再将混合物快速注满洗净干燥的聚四氟乙烯管中，两端封闭并浸于65℃水浴中恒温加热10分钟；

（4）冲洗整体柱：待反应完成后，以水为流动相，使用液相色谱泵冲洗整体柱，去除柱床内残留的溶剂与未反应物质，即得到所述共价有机骨架功能化固相微萃取整体柱；在进行在线固相微萃取操作前，整体柱使用装载液平衡半小时。

实施例2

所述的联用系统具体操作步骤如下：

第一步，在线联用系统的十通阀和六通阀都处于LOAD位置；装载液通过泵A平衡共价有机骨架功能化固相微萃取整体柱（实施例1制备的整体柱），流速为0.1 mL/min；流动相通过泵B直接经分析柱以获得色谱分离需要的稳定基线，流速为1.0 mL/min；同时，通过进样针将样品溶液注满0.5 mL PEEK管定量环；

第二步，六通阀调至INJECT位置，在线固相微萃取开始，0.5 mL PEEK管定量环中的样品经由装载液带入共价有机骨架功能化固相微萃取整体柱，经过给定的时间，六通阀调回LOAD位置；

第三步，将泵A输送的溶液由装载液换成洗脱液，流速设为0.1 mL/min，利用洗脱液将共价有机骨架功能化固相微萃取整体柱上富集的分析对象洗脱，并收集在0.2 mLPEEK管定量环中；当洗脱完成时，十通阀调节至INJECT位置，利用流动相将收集的洗脱液送入液相色谱分析柱中进行分离，接着利用检测器进行检测。

按照本发明技术方案，首先制备共价有机骨架功能化整体柱（实施例1制备的整体柱），并以该整体柱作为固相微萃取介质，参考相关专利（专利号：2018207623454）构建固相微萃取-高效液相色谱在线联用分析系统。接着，依托在线联用系统在线富集检测油脂中的抗氧化剂，并考察装载液中乙腈含量对样品富集效率的影响。检测样品中几种抗氧化剂浓度为1.0 mg/kg；装载液组成为乙腈和5mM pH=6.0的甲酸铵水溶液，进样样品溶剂组成为乙腈/5mM pH=6.0的甲酸铵水溶液=40/60 (v/v)，进样流速0.1 mL/min，进样体积500 μL；洗脱液组成为纯乙腈，洗脱流速0.1 mL/min，洗脱体积200 μL（收集前两分钟洗脱液）；分离流动相为乙腈/ 0.05%甲酸水溶液=60/40 (v/v)，分离流速为1.0 mL/min，柱温箱温度为40℃，检测波长为201 nm。

如图1所示，当装载液乙腈含量从20% (v/v)增加至40% (v/v)时，分析对象的富集效率不断提高，这体现了整体柱脲醛树脂基质与分析对象之间典型的亲水相互作用；随着装载液乙腈含量从40% (v/v)继续提高至60% (v/v)时，分析对象的富集效率没有明显提高或反而有所降低，这应该是分析对象与共价有机骨架之间的π-π堆积作用随着乙腈含量的提高而被明显削弱；由此，我们可以看出几种抗氧化剂与共价有机骨架功能化整体柱之间的萃取作用模式为亲水作用和π-π堆积作用的协同萃取作用。因此，我们选择装载液乙腈比例为40% (v/v)为最优比例。

实施例3

按照实施例2的技术方案，首先制备实施例1的共价有机骨架功能化整体柱，并以该整体柱作为固相微萃取介质，参考相关专利（专利号：2018207623454）构建固相微萃取-高效液相色谱在线联用分析系统。接着，依托在线联用系统在线富集检测油脂中的抗氧化剂，联用系统运行优化参数为：样品装载液为ACN/5 mM pH=6.0甲酸铵溶液=40%/60% (v/v)；洗脱液为乙腈；进样流速为0.10 mL/min；洗脱流速为0.10 mL/min；洗脱体积200 μL（收集前两分钟洗脱液）；流动相为ACN/0.05%甲酸溶液=60%/40% (v/v)；流动相流速为1.0 mL/min；柱温箱温度为40 ℃；检测波长设定为201 nm。

图2对比了在线联用系统和常规液相色谱系统检测食用油中添加的1.0 mg/kg几种油脂抗氧化剂的色谱图。图2中，检测峰1为没食子酸丙酯（PG），检测峰2为特丁基对苯二酚（TBHQ），检测峰3为丁基羟基茴香醚（BHA）。由图2-b可见，在该联用系统条件下，食用油中添加的微量油脂抗氧化剂得到了高效富集萃取与高灵敏检测，几种分析对象的检测限分别为2.0 μg/kg（PG）、0.9 μg/kg（TBHQ）、0.3 μg/kg（BHA）。而使用常规液相色谱系统进行相同样品的分析时，检测对象的信号较弱，检测灵敏度较低（图2-a）。图3为使用本发明构建的在线联用系统，在线富集检测不同食用油实际样品的色谱图。从图中可以看出，3种食用油样品中均检出了BHA，其含量为140 μg/kg（调和油）、100 μg/kg（葵花籽油）和225 μg/kg（花生油）。这表明了本发明建立的方法的实用性和可靠性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。