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一种桑叶发酵饲料及其制备方法

文献发布时间：2023-06-19 11:42:32

技术领域

本发明属于农业技术领域，具体涉及一种桑叶发酵饲料及其制备方法。

背景技术

桑叶生长快速，年产量可以达到20吨/公顷。然而，只有1％～3％桑叶资源可利用，剩余老旧桑叶产量巨大

桑具有种植广，范围大，抗逆性和生态环境适应力强等特点

发酵是利用有益微生物将植物茎叶成分转化为微生物蛋白质、活性小肽和活性物质

CN201711243661.7公开了一种发酵型桑叶牛饲料及其制备方法，采用桑叶或嫩枝条、玉米粉、发酵菌液为原料，所述发酵菌液由酵母菌、植物乳酸菌和枯草芽孢杆菌制备而成，通过在桑叶或嫩枝条和玉米粉物料上喷洒发酵菌液，密封发酵制成牛饲料。在该案中仅论证了发酵桑叶饲料相比于未添加发酵桑叶饲料的案例来说，牛的抵抗力和料肉比有所增加。

CN201810083315.5公开了一种桑叶发酵高蛋白水产饲料及其制备方法。本发明采用豆粕和桑叶作为植物性蛋白源，并添加部分鱼粉和卤虫粉，同时添加了其他多种营养元素，保障了水产生长所需。经过发酵的原料不仅提高了蛋白的溶解度和植物蛋白的生物转化率，可以直接被动物吸收，同时含有多种有益成分，可以促进矿物质吸收、增强免疫力、促进动物生长，减少疫苗、抗生素等药物使用量，提高水产的成活率，绿色环保，其使用的菌种为乳酸杆菌和芽孢杆菌。

CN201410102720.9公开了一种桑叶饲料及其加工方法和用途。所属桑叶饲料为将干桑叶粉利用经过筛选的酵母菌、乳酸杆菌、米曲霉菌株复合菌进行人工发酵，可以较好地改善桑叶粉的口感，提高饲料动物的采食性，提高饲料的表观消化率。

综合来说，现有技术中，桑叶发酵饲料所用的菌种大多为酵母菌、植物乳酸菌、枯草芽孢杆菌、米曲霉菌株复合菌进行发酵。以上技术均未对桑叶单宁的降解提供技术方案。

芽孢杆菌主要产生蛋白酶，乳酸菌和乳杆菌主要消除抗营养因子，乳酸菌和地衣芽孢杆菌等繁殖过程中会产生纤维素酶和淀粉酶等酶类，可对桑叶中的粗纤维以及大分子物质进行解，从而大量消除抗营养因子

本案所要解决的技术问题是：如何通过工艺和菌种优化提高粗蛋白质含量的同时降低单宁含量。

发明内容

针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种桑叶发酵饲料及其制备方法。

通过系列化的正交试验和对比实验我们可以得到以下结论：本发明的桑叶发酵饲料的菌种选择、桑叶和麸皮的配比对于单宁、粗蛋白质的含量有着积极的影响，其相比于非青贮饲料、采用其他菌种进行厌氧发酵的方案来说，优势明显。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种桑叶发酵饲料，将桑叶和麸皮在复合菌种存在的条件下进行密封固态发酵得到，所述桑叶和麸皮的重量比为7:3～10:1；复合菌种为酒窖片球菌和地衣芽孢杆菌的组合；桑叶和麸皮中复合菌种接种量为每100重量份的桑叶和麸皮中接种4.5×10

在上述的桑叶发酵饲料中，所述复合菌种中，酒窖片球菌和地衣芽孢杆菌的比例为1:2～2:1。

在上述的桑叶发酵饲料中，发酵时间为3～8天。

在上述的桑叶发酵饲料中，所述桑叶和麸皮的重量比为9:1；每100重量份的桑叶和麸皮中接种6×10

此外，本发明还公开了一种如上任一所述的桑叶发酵饲料的制备方法，包括如下步骤：

1)将鲜桑叶切短，按照比例添加麸皮混合均匀；

2)按照所需菌种组合和接种量添加菌种并搅拌均匀，压实后密封发酵；

2)发酵3～6天即可。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1)经过验证，采用复合菌种为酒窖片球菌和地衣芽孢杆菌的组合时，单宁值降低到7.6g/kg以下，粗蛋白提高到23.4％。

2)正交试验优化组合为：桑叶与麸皮质量比＝9:1，菌种组合为酒窖片球菌+地衣芽孢杆菌，接种量为2％，发酵4天。

3)验证试验表明，优化组合发酵桑叶测得粗蛋白质含量为26.18％，单宁含量为4.73g/kg，均优于正交试验表中最优值。

4)对比试验表明，发酵桑叶提高了粗蛋白质、粗脂肪、灰分和磷含量，降低单宁、中性洗涤纤维、碳水化合物、非必需氨基酸含量和pH值。发酵桑叶必需氨基酸组成和饲用价值比未发酵桑叶更优。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

第一部分：正交实验获取和验证最优配方

1材料与方法

1.1材料

桑叶：来自广东省农业科学院花都基地。测得干物质、粗蛋白质、粗脂肪含量分别为30.50％、23.67％、2.52％，单宁含量为13.21g/kg。

酒窖片球菌(CGMCC1.3787)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，地衣芽孢杆菌、葡萄牙棒孢酵母均来源来自广东省农科院动物科学研究所。

1.2主要试剂及仪器

MRS肉汤培养基、营养肉汤培养基、马铃薯葡萄糖培养基购自广东环凯微生物科技有限公司。单宁酸购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，茚三酮购自上海伯奥生物科技有限公司，氨基酸标准品及相关试剂等购自日本和光纯药工业株式会社，其余试剂均为分析纯。

全自动凯氏蛋白质测定仪(FOSS 8400)，多功能酶标仪(Spectra Max M5)，半自动脂肪测定仪(FOSS)，纤维分析仪(Ankom 220)，马弗炉(上海一恒科技有限公司SX2-4-10)，氨基酸分析仪(Hitachi L8900)等。

1.3实验方法

1.3.1种子液的制备

取0.1mL酒窖片球菌(X)保存液于100mL灭菌MRS肉汤培养基中，37℃静置培养24h。取0.1mL地衣芽孢杆菌(Y)保存液于100mL灭菌营养肉汤培养基中，37℃振荡培养24h。取0.1mL葡萄牙棒孢酵母(Z)保存液于100mL灭菌马铃薯葡萄糖培养基中，28℃振荡培养24h。用灭菌水调整上述菌液浓度为1.5×10

1.3.2发酵基质的制备

将鲜桑叶切短(约1～2cm)，按照比例添加麸皮混合均匀，按照所需菌种组合和接种量添加菌种并搅拌均匀，pH自然，每个发酵袋200g发酵基质，压实后密封发酵。

1.3.3正交试验

为了获得高粗蛋白质含量和低单宁含量的发酵桑叶的优化组合，以桑叶与麸皮质量比(A)、菌种组合(B)、接种量(C)和发酵时间(D)为影响因素，运用SPSS19软件进行L9(3

表1正交试验因素与水平表

Table 1Factors and levels of orthogonal test

注1：酒窖片球菌(X)，地衣芽孢杆菌(Y)，葡萄牙棒孢酵母(Z),下同。

注2：X+Y中，X:Y＝1:1；X+Z中，X:Z＝1:1；X+Y+Z中，X:Y:Z＝1:1:1。

注3：上述接种量％是指100重量份的桑叶和麸皮中加入任一一种菌液的体积，如当菌种组合为X+Y，则2％是指，100重量份的桑叶和麸皮中加入2mL酒窖片球菌菌液(菌液浓度为1.5×10

1.3.4验证试验

根据正交试验得出的条件，进行桑叶发酵，比较最优条件下发酵桑叶和正交组合中最优粗蛋白质和单宁含量。

1.3.5对比试验

根据最优组合进行桑叶发酵(10个重复)，比较未发酵桑叶和发酵桑叶的营养价值。

1.3.6相关指标测定

粗蛋白质的测定参照GB/T6432-1994；单宁的测定参照分光光度法(邻二氮菲-铁(Ⅲ))

1.3.7饲用价值指标的计算

参照文献[12,13]，总可消化养分TDN(％DM)＝82.38-0.7515×ADF(％DM)，干物质消化率DDM(％DM)＝88.9-0.779×ADF(％DM)，干物质采食量DMI(％BW)＝120/NDF(％DM)，饲料相对值RFV＝DMI(％BW)×DDM(％DM)/1.29，相对牧草品质RFQ＝TDN(％DM)×DMI(％BW)/1.23。

1.4数据处理

用SPSS19.0进行单因素方差分析(one-way ANOVA)及独立样本t检验，用Duncan氏法进行多重比较。结果用平均值和平均标准误(SEM)表示，P<0.05表示差异显著。P<0.01表示差异高度显著；P<0.001表示差异极显著。

2结果

2.1正交试验极差分析

通过直观分析方法，比较表2极差(R)大小可知，对粗蛋白质含量影响因素大小排序为：桑叶与麸皮比例(A)、菌种组合(B)、接种量(C)、发酵时间(D)。根据Ki值的大小判断最优水平，得到各因素对粗蛋白质含量的最优组合为A1B2C2D2。同理，对单宁含量影响因素大小排序为：菌种组合(B)、发酵时间(D)、桑叶与麸皮质量比(A)、接种量(C)，单宁含量最低的组合为A1B2C2D1。综合上述分析，桑叶发酵最优方案为A1B2C2D1或A1B2C2D2，即桑叶：麸皮＝9:1，菌种组合为X+Y，接种量为2％，发酵4d或6d。

表2正交试验极差分析表

2.2正交试验方差分析

由表3可知，粗蛋白质的校正模型P值为0.032<0.05，说明校正模型对试验结果有显著影响，正交试验结果具有可信度。桑叶与麸皮质量比(A)和菌种组合(B)显著影响发酵桑叶粗蛋白质含量，说明因素A和B是影响发酵桑叶粗蛋白质含量的主要因素。根据F值得到，对粗蛋白质含量影响因素大小排序为：A、B、C、D。对因素A分析，A1的粗蛋白质含量显著高于A3，A2与A1、A3的含量差异均不显著，因此选择A1。同理，因素B选择B2。因素A和B对粗蛋白质含量的最优组合为A1B2。

同理，菌种组合(B)和发酵时间(D)是影响单宁含量的主要因素。因素B和D对单宁含量的最优组合为B2D1。综合粗蛋白质和单宁的最优组合，得到桑叶发酵最优组合为A1B2C1D1。

表3正交试验方差分析表

注：*表示差异显著(P<0.05)；**表示差异高度显著(P<0.01)；***表示差异极显著(P<0.001)，下同。

2.3验证试验

综合极差分析(A1B2C2D1或A1B2C2D2)和方差分析(A1B2C1D1)结果，桑叶发酵的最优组合为A1B2C2D1，即桑叶：麸皮＝9:1，菌种组合为酒窖片球菌+地衣芽孢杆菌，接种量为2％，发酵4d。由于所分析出来的最优组合A1B2C2D1不在表2正交试验设计之内，因此对该组合进行了验证试验。测得粗蛋白质含量为26.18％，高于正交试验表最高粗蛋白质含量(25.60％)，测得单宁含量为4.73g/kg，低于正交试验表最低单宁含量(6.73g/kg)，从而验证了桑叶发酵优化组合为A1B2C2D1。

2.4对比试验

发酵桑叶颜色黄绿，有桑叶清香，味道酸甜。由表4可知，发酵桑叶粗蛋白质和粗脂肪含量分别比未发酵桑叶提高了16.82％和30.57％(P<0.01)。发酵桑叶灰分和磷含量显著高于未发酵桑叶(P<0.01)。与未发酵桑叶相比，发酵桑叶单宁、中性洗涤纤维、碳水化合物含量分别显著降低56.40％、16.78％、7.29％(P<0.001)。发酵桑叶pH值极显著低于未发酵桑叶(P<0.001)。二者干物质、粗纤维、酸性洗涤纤维、钙含量差异不显著(P>0.05)。

表4发酵桑叶营养成分

2.5发酵桑叶氨基酸含量

由表5可知，与未发酵桑叶比较，发酵桑叶的赖氨酸、组氨酸含量有降低趋势(0.50≤P<0.10)，精氨酸、丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、总非必需氨基酸、总氨基酸含量显著降低(P<0.05)，而丙氨酸含量显著提高(P<0.05)。

表5发酵桑叶氨基酸

2.6发酵桑叶必需氨基酸组成

由表6可知，发酵桑叶的胱氨酸+蛋氨酸、苏氨酸、亮氨酸、酪氨酸+苯丙氨酸、必需氨基酸组成均显著高于未发酵桑叶(P<0.01)。与未发酵桑叶相比，发酵桑叶缬氨酸组成有提高的趋势(0.05

表6发酵桑叶必需氨基酸组成

2.7发酵桑叶饲用价值

由表7可知，发酵桑叶的DMI、RFV、RFQ均极显著高于未发酵桑叶(P<0.001)。发酵或未发酵桑叶的TDN、DDM、RFV、RFQ的最低值分别比苜蓿的对应最优值高22.36％、56.49％、61.09％、21.38％。未发酵桑叶的DMI与苜蓿DMI接近，而发酵桑叶的DMI比苜蓿的最优值高18.18％。

表7发酵桑叶饲用价值

苜蓿的饲喂价值参考

第二部分：近似配方的验证

参考第一部分的实验方法，配方如下表8；

表8不同工艺参数条件下的发酵结果

第三部分：常用的菌种验证对比测试

参考第一部分的实验方法，配方如下表9；

表9不同菌种条件下的发酵结果

综述：

通过以上第一部分至第三部分的实验，可以得到以下结论：

1)经过验证，采用复合菌种为酒窖片球菌和地衣芽孢杆菌的组合时，单宁值降低到7.6g/kg以下，粗蛋白质提高到23.4％。

2)正交试验优化组合为：桑叶与麸皮质量比＝9:1，菌种组合为酒窖片球菌+地衣芽孢杆菌，接种量为2％，发酵4天。

3)验证试验表明，优化组合发酵桑叶测得粗蛋白质含量为26.18％，单宁含量为4.73g/kg，均优于正交试验表中最优值。

5)本发明的复合菌种为酒窖片球菌和地衣芽孢杆菌的组合时，其相比于传统工艺中使用的酵母菌、植物乳酸菌、枯草芽孢杆菌、米曲霉菌株复合菌中任意组合的复合菌种均具有明显的优势。