T细胞修饰

发明领域

本发明总体涉及修饰T细胞以增加其细胞毒性活性以及修饰的T细胞在免疫疗法中、例如用于治疗癌症的用途。

发明背景

免疫疗法有望改变癌症治疗领域，并有望实现长期存活(McDermott等人, CancerTreat Rev. 2014 Oct; 40(9): 1056-64)。对用以扩大患者群体和肿瘤类型范围的新免疫调节性药物的医学需求明显未得到满足。另外，需要新的药物来增强抗肿瘤应答的强度和持续时间。由于近二十年对控制T-细胞免疫的基本原理的深入理解，这些药物的开发已成为可能(Sharma和Allison, Cell. 2015 Apr 9; 161(2): 205-14)。这通常需要识别由MHC分子呈递的肿瘤相关肽抗原的肿瘤特异性CD4+和CD8+ T-细胞。在一些情况下，不同的接种疫苗策略和离体扩增的肿瘤浸润淋巴细胞的过继转移已证明肿瘤特异性T-细胞治疗晚期癌症的能力(Rosenberg等人, Nat Med. 2004 Sep; 10(9): 909-15)。然而，对肿瘤抗原的高耐受性与经常存在于肿瘤部位处的有效免疫抑制微环境的组合表现为T细胞抗肿瘤活性的次佳活化。因此，由于T-细胞对自身抗原的耐受性，缺乏高亲和力T-细胞的个体可能对免疫检查点阻断疗法(诸如抗PD-1和抗CTLA-4)不应答。

基因工程改造可以通过生成高亲和力T细胞受体(TCR)来辅助克服对肿瘤抗原的内源性高亲和力T细胞的低频率的问题，并且为对用检查点抑制剂的治疗无应答的患者提供临床益处。已显示对几种抗原(包括gp100、MAGE-A3和NY-ESO-1)，该方法使野生型TCR对其天然配体肽/MHC I类复合物的体外亲和力增加10-1000倍(Li等人, Nat Biotechnol.2005 Mar; 23(3): 349-54; Robbins等人, J Immunol. 2008 May 1; 180(9): 6116-31.)。较高亲和力TCR允许T细胞对较低水平的抗原应答；这在肿瘤微环境已适应以降低抗原表达和降低MHC I类分子的表达的情况下是重要的(Barrett和Blazar, N Engl J Med.2009 Jul 30; 361(5): 524-5; Marincola等人, Adv Immunol. 2000; 74: 181-273)。已经经由TCR-工程改造的T细胞疗法或T-细胞重定向生物制剂实现了T细胞对肿瘤的重定向(Bossi等人, Cancer Immunol Immunother. 2014 May; 63(5): 437-48; Fan等人, JHematol Oncol. 2015 Dec 21; 8: 130)。

已经显示T细胞疗法对于治疗一些复发或高风险肿瘤的治愈性潜能(Dudley等人,J Immunother. 2003 Jul-Aug; 26(4): 332-42; Dudley等人, J Clin Oncol. 2005 Apr1; 23(10): 2346-57; Kalos等人, Sci Transl Med. 2011 Aug 10; 3(95): 95ra73)。当前存在两种方法用于基因工程改造患者T细胞以识别肿瘤抗原，包括嵌合抗原受体(CAR)和亲和力成熟的TCR。

然而，CAR限于仅靶向细胞表面上的表位。基于TCR的治疗剂不仅可以识别细胞表面蛋白，而且可以识别内部细胞蛋白。另外，TCR方法通过募集内源性信号传导分子以及T细胞及其特定靶标之间的时空相互作用来更紧密地模拟T细胞的自然功能。然而，其限于共有由TCR识别的适当MHC限制的个体。这种类型的疗法将需要平行开发针对HLA类型和抗原表达的患者选择测定法。

MHC I类-限制的T细胞受体(TCR)与肽-MHC复合物的结合通过称为CD8(分化簇8)的糖蛋白进行稳定，所述糖蛋白也募集Src-家族激酶Lck，并增强信号传导。CD8与I类MHC的恒定部分的结合导致结合亲和力增加以及对靶标细胞上的抗原的应答的阈值降低(Gao,Nature. 1997 Jun 5; 387(6633): 630-4; Artyomov等人, Proc Natl Acad Sci U S A.2010 Sep 28; 107(39): 16916-21)。将CD8转基因添加至TCR慢病毒载体中可以赋予CD4+T细胞类似的增加应答，加强其为CD8+ T细胞提供辅助功能的能力以及额外的直接肿瘤细胞杀伤，可能导致增强的临床效力。

CD8α/CD8β(分化簇8)是一种异二聚体跨膜糖蛋白，其由细胞毒性T细胞、自然杀伤(NK)细胞和树突状细胞表达。其结合I类肽-主要组织相容性抗原(pMHC，在人类中，这些经常被描述为肽-人白细胞抗原或pHLA)上的保守区域，并且在这种情况下，其充当T细胞受体(TCR)的MHC肽-特异性结合的通用共受体。在成熟的CD4+ T细胞中未发现CD8α/CD8，其中它们的抗原特异性TCR结合相关、但不同的II类pMHC抗原，并且其中CD4同二聚体充当TCR共受体。

共受体依赖性TCR的最通常类型是具有α和β多肽链的异二聚体跨膜糖蛋白。当α/βTCR结合I类pMHC抗原时，它们触发磷酸化事件的细胞内信号传导级联，其活化过量细胞事件，包括细胞毒性T细胞对表达pMHC的靶标细胞的杀死。该信号传导级联通过Lck(淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶)对TCR-结合的CD3跨膜蛋白的磷酸化而引发。CD8α/CD8β和Lck之间的细胞内关联被认为增强TCR信号传导。

在人类中，除了CD8α/CD8β异二聚体以外，近似三分之一的CD8+细胞还展示CD8α/CD8α同二聚体形式。在一些肠T细胞、NK细胞和γ/δ T细胞中，仅发现该同二聚体形式。证据表明，在人类中，该CD8α同二聚体可以在功能上完全取代CD8α/CD8β异二聚体(Cole等人,Immunology. 2012 Oct; 137(2): 139-48)。

在体内，TCR和CD8二聚体与I类pHLA的同时结合影响T细胞克隆的胸腺阳性/阴性选择。这决定了由这些T细胞克隆表达的TCR的pHLA抗原亲和力。通常，病原体相关的pHLA-反应性T细胞克隆中的TCR抗原亲和力高于识别癌症相关抗原的等效T细胞克隆。TCR亲和力增强技术可以将癌症反应性TCR的亲和力增加至接近病原体反应性TCR的亲和力。TCR亲和力的这些增加导致通常是CD8共受体不依赖的TCR。用表达这些TCR的基因表达载体对CD4+T细胞的细胞转导产生具有杀伤和辅助功能的I类pHLA-特异性CD4+ T细胞的新型实体，其否则通常只能被II类-特异性肽-抗原活化(Tan等人, Clin Exp Immunol. 2017 Jan; 187(1): 124-137)。与其野生型亲本TCR相比，这些TCR允许T细胞更有效地识别其癌症靶标细胞。重要的是，甚至在CD8+ T细胞中，即在内源性CD8共受体存在的情况下，pHLA抗原特异性也得以维持。

尽管共受体独立性意味着这些亲和力-增强的TCR在CD4+ T细胞中也可以在一定程度上发挥功能，但显然，CD4+ T细胞中的最佳TCR亲和力高于CD8+ T细胞中的最佳TCR亲和力(Tan等人)。

持续需要新的和改进的基于TCR的疗法，以增强患者中的抗肿瘤应答的幅度和持续时间。

发明概述

在第一个方面，本发明提供了修饰的T细胞，其呈递外源CD8共受体或其片段和T细胞受体(TCR)。在第一个方面的一个实施方案中，所述修饰的T细胞可以包含核酸构建体，所述核酸构建体包含(i)编码CD8共受体或其片段的第一核苷酸序列，和(ii)编码T细胞受体(TCR)的第二核苷酸序列。

在第二个方面，本发明还提供了药物组合物，其包含多种本发明的第一个方面的修饰的T细胞和药学上可接受的载体，所述修饰的T细胞呈递CD8共受体或其片段和TCR。

在第三个方面，本发明还提供了治疗人中的癌症的方法，其包括向所述人施用本发明的第二个方面的药物组合物。

当结合附图阅读时，将更好地理解本发明的优选实施方案的以下详述。为了举例说明本发明的目的，在附图中显示目前优选的实施方案。然而，应理解的是，本发明不限于附图中显示的实施方案的精确排列和手段。

图/附图描述

图1显示用于生成全长CD8α_F2A_NY-ESO

图2显示CD8α NY-ESO-1

图3显示响应于抗原的T细胞的活化，如通过在未转导的(ntd) T细胞、CD8α NY-ESO

图4显示响应于抗原阳性(A375)和阴性(HCT-116)细胞系的ntd、NY-ESO

图5显示响应于抗原阳性细胞系A375的来自ntd、NY-ESO-1

图6显示在用NY-ESO-1肽(SLLMWITQC)刺激后，ntd、NY-ESO-1

图7显示与NY-ESO-1阳性和阴性A375 GFP 3D球状体的共培养的ntd、NY-ESO-1

图8显示当NY-ESO-1阳性细胞与ntd、NY-ESO-1

图9显示3D细胞培养测定(A375-GFP细胞的3D培养物中的ntd、NY-ESO-1

图10显示来自单个供体的NY-ESO-1

图11显示当对于7个供体经0-51小时的时间范围与A375靶标细胞共同孵育时，CD8α NY-ESO-1

图12显示与NY-ESO-1

图13显示Wave147和Wave149 CD8α NY-ESO-1

发明详述

本发明提供了修饰的T细胞，其呈递外源CD8共受体或其片段和T细胞受体(TCR)。在一个实施方案中，所述CD8共受体是CD8α同二聚体。在另一个实施方案中，所述CD8共受体包含与CD8α (SEQ ID NO:1)具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列。

CD8α的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:1中。

在另一个实施方案中，所述TCR是亲和力成熟的。在另一个实施方案中，所述TCR包含α链和β链。在另一个实施方案中，所述TCR是NY-ESO-1 TCR。NY-ESO-1

在另一个实施方案中，所述NY-ESO-1 TCR的氨基酸序列包含与NY-ESO-1

NY-ESO-1

NY-ESO-1

本发明还提供了核酸构建体，其包含编码CD8共受体或其片段的第一核酸序列和编码T细胞受体(TCR)的第二核酸序列。在一个实施方案中，所述CD8共受体是CD8α。在另一个实施方案中，所述CD8共受体包含与CD8α (SEQ ID NO:4)具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的核酸序列。

CD8α的核酸序列显示于SEQ ID NO:4中。

在另一个实施方案中，所述核酸构建体中的TCR是亲和力成熟的。在另一个实施方案中，所述TCR包含α链和β链。在另一个实施方案中，所述TCR是NY-ESO-1 TCR。在另一个实施方案中，所述NY-ESO-1 TCR的核酸序列包含与NY-ESO-1

NY-ESO-1

NY-ESO-1

在一个实施方案中，提供了包含本发明的核酸构建体的表达载体。在另一个实施方案中，可以使用基因编辑技术，将所述核酸构建体直接引入T细胞。在另一个实施方案中，提供了包含所述核酸构建体或表达载体的修饰的T细胞。

本文还提供了修饰的T细胞，其用于疗法中。在一个实施方案中，所述疗法是同种异体的。在另一个实施方案中，所述疗法是自体的。

本文还提供了工程改造修饰的T细胞的方法，其包括：(i)提供T细胞；(ii)将本发明的包含编码CD8共受体或其片段和T细胞受体(TCR)的核苷酸构建体的表达载体引入所述T细胞中；和(iii)在修饰的T细胞中表达所述CD8共受体或其片段和T细胞受体(TCR)。

在一个实施方案中，提供了药物组合物，其包含多种呈递CD8共受体或其片段和TCR的修饰的T细胞以及药学上可接受的载体。在一个实施方案中，所述药物组合物包含同种异体T细胞。在另一个实施方案中，所述药物组合物包含自体T细胞。

在另一个实施方案中，提供了治疗人中的癌症的方法，其包括向所述人施用有效量、例如治疗有效量的所述药物组合物。在一个实施方案中，所述方法进一步包括在向所述人施用之前离体扩增所述修饰的T细胞的群体。尽管可以通过临床试验确定适当的剂量，但施用的量和频率将由诸如患者的状况以及患者的疾病的类型和严重程度等因素来确定。在一些实施方案中，所述癌症可以是滑膜肉瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、粘液样圆形细胞脂肪肉瘤(MRCLS)或多发性骨髓瘤(MM)。

本领域普通技术人员将认识到，可能需要多次施用本文考虑的组合物以实现期望的疗法。例如，可以在1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年、2年、5年、10年或更长的持续时间内1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多次施用组合物。

在一个实施方案中，向有此需要的受试者施用有效量的组合物以增加所述受试者中针对癌症的细胞免疫应答。所述免疫应答可以包括由能够杀死受感染细胞的细胞毒性T细胞、调节性T细胞和辅助性T细胞应答介导的细胞免疫应答。也可以诱导主要由能够活化B细胞、因此导致抗体产生的辅助T细胞介导的体液免疫应答。可以使用各种技术来分析由所述组合物诱导的免疫应答的类型，这是本领域中充分描述的；例如，Current Protocols inImmunology, 编者: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies,Ethan M. Shevach, Warren Strober (2001) John Wiley & sons, NY, N.Y.)。

在另一个实施方案中，本发明还提供了如本文所述的修饰的T细胞的群体，如本文所述的核酸构建体，如本文所述的载体，或如本文所述的药物组合物，其用于治疗患有癌症的受试者的方法中。

在本说明书中引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请，都如同完全阐述的一样通过引用并入本文。

在本文和权利要求中所用，单数形式 “一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”包括复数对象，除非上下文另有清楚指出。因此，例如，对“肽链”的提及是对一条或多条肽链的提及，并且包括本领域技术人员已知的其等效物。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等效的任何组合物和方法都可以用于本公开的方法的实践或测试中，但本文描述了示例性的组合物和方法。也可以组合本文描述的公开内容的任何方面和实施方案。例如，可以多重组合本文公开的任何从属权利要求或独立权利要求的主题(例如，来自每个从属权利要求的一个或多个陈述可以基于它们所从属的独立权利要求被组合成单个权利要求)。

本文提供的范围包括所描述的特定范围内的所有值和在特定范围的端点附近的值。本公开的附图和表格还描述了范围和离散值，其可以构成本文公开的任何方法的要素。

本文所述的浓度在环境温度和压力下确定。例如，这可以是室温下或工艺流的特定部分内的温度和压力。优选地，在25℃和1巴的压力的标准状态下确定浓度。

术语“约”意指任何特定测量值的平均值在两个标准偏差内的值。

如本文所用的术语“活化”是指已经被足够刺激以诱导可检测的细胞增殖的T细胞的状态。活化也可以与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关。术语“活化的T细胞”尤其是指正在经历细胞分裂的T细胞。

如本文所用的术语“过继细胞疗法”或“过继免疫疗法”是指人T淋巴细胞或NK淋巴细胞的过继转移，所述人T淋巴细胞或NK淋巴细胞通过基因转移工程改造以表达对于靶标细胞上表达的表面抗原或肽MHC复合物特异性的CAR或基因修饰的TCR。这可用于治疗多种疾病，这取决于选择的靶标、例如肿瘤特异性抗原(以治疗癌症)。过继细胞疗法涉及使用称为白细胞分离术的方法除去供体或患者的白血细胞的一部分。然后可以将T细胞或NK细胞扩增并与包含CAR/TCR多核苷酸的表达载体混合，以将CAR/TCR支架转移至T细胞或NK细胞。再次扩增T细胞或NK细胞，并且在扩增结束时，将工程改造的T细胞或NK细胞洗涤，浓缩，且然后冷冻以留出时间用于测试，运输和储存，直至患者准备好接受工程改造的细胞的输注。

“亲和力”是一个分子与另一个分子的结合的强度。抗原结合蛋白与其靶标的结合亲和力可以通过平衡方法(例如酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA))或动力学(例如BIACORE™分析)测定。

如本文所用的术语“同种异体的”是指源自相同物种的不同动物的任何材料。

如本文所用的术语“抗原”是指被抗原结合蛋白选择性识别的大分子的结构。抗原包括但不限于包含一个或多个T细胞表位的蛋白(具有或不具有多糖)或蛋白组成。如本文所考虑，抗原结合蛋白的靶标结合结构域可以识别糖蛋白的糖侧链，而不是大分子的特定氨基酸序列。因此，所述糖部分或硫酸化的糖部分充当抗原。

如本文所用的术语“抗肿瘤作用”是指可以显现为肿瘤生长速率的降低、肿瘤体积的减少、肿瘤细胞数目的减少、转移瘤数目的减少、预期寿命的增加或与癌性状况相关的各种生理症状的改善的生物学作用。“抗肿瘤作用”也可以首先显现为本发明的肽、多核苷酸、细胞和抗体在预防肿瘤发生中的能力。

如本文所用的术语“自体的”是指源自受试者的任何材料，后来将所述材料重新引入相同的受试者中。

如本文所用的术语“亲合力(avidity)”是两种分子在多重位点处彼此结合的强度的总和，例如考虑到相互作用的化合价。

如本文所用，术语“癌症”、“赘生物”和“肿瘤”可互换使用，并且以单数或复数形式，是指已经历使其对宿主生物病理性的恶性转化的细胞。可以通过具体实施方案中考虑的组合物和方法靶向的细胞的说明性实例包括但不限于以下癌症：滑膜肉瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、粘液样圆形细胞脂肪肉瘤(MRCLS)和多发性骨髓瘤(MM)。通过充分建立的技术，特别是组织学检查，可以容易地将原发性癌细胞与非癌性细胞区分开。如本文所用，癌细胞的定义不仅包括原发性癌细胞，还包括衍生自癌细胞祖先的任何细胞。这包括转移的癌细胞，以及衍生自癌细胞的体外培养物和细胞系。当提及通常表现为实体瘤的癌症类型时，“临床可检测的”肿瘤是基于肿瘤块可检测的肿瘤；例如，通过程序，诸如在体检时的计算机断层摄影(CT)扫描、磁共振成像(MRI)、X射线、超声或触诊，和/或由于在可得自患者的样品中的一种或多种癌症特异性抗原的表达而可检测的肿瘤。肿瘤可以是造血的(或血液、血液学或血液相关的)癌症，例如衍生自血细胞或免疫细胞的癌症，其可以被称为“液体肿瘤”。基于血液肿瘤的临床状况的具体实例包括白血病，诸如慢性髓性白血病、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病和急性淋巴细胞性白血病；浆细胞恶性肿瘤，诸如多发性骨髓瘤、MGUS和华氏巨球蛋白血症；淋巴瘤，诸如非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤；等等。

癌症可以是其中存在异常数目的胚细胞或不需要的细胞增殖、或者被诊断为血液学癌症的任何癌症，所述血液学癌症包括淋巴样和髓样恶性肿瘤两者。髓样恶性肿瘤包括但不限于急性髓样(或粒细胞性或骨髓性或成髓细胞性)白血病(未分化或分化型)、急性前髓样(或早幼粒细胞性或前骨髓细胞性或前成髓细胞性)白血病、急性骨髓单核细胞性(或粒单核母细胞性)白血病、急性单核细胞性(或单核母细胞性)白血病、红白血病和巨核细胞性(或巨核母细胞性)白血病。这些白血病可以统称为急性髓样(或粒细胞性或骨髓性)白血病(AML)。髓样恶性肿瘤还包括骨髓增殖性病症(MPD)，其包括但不限于慢性粒细胞性(或髓样)白血病(CML)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)、原发性血小板增多症(或血小板增多)和真性红细胞增多症(PCV)。髓样恶性肿瘤还包括骨髓增生异常(或骨髓增生异常综合症或MDS)，其可以被称为难治性贫血(RA)、难治性贫血伴原始细胞增多(RAEB)、以及转化中的难治性贫血伴原始细胞增多(RAEBT)；以及伴有或不伴有原因不明的髓样化生的骨髓纤维化(MFS)。

造血系统癌症还包括淋巴样恶性肿瘤，其可能影响淋巴结、脾、骨髓、外周血和/或结节外部位。淋巴样癌症包括B细胞恶性肿瘤，其包括但不限于B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)。B-NHL可能是惰性的(或低分级的)、中等分级的(或侵袭性的)或高分级的(高度侵袭性的)。惰性B细胞淋巴瘤包括滤泡性淋巴瘤(FL)；小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)；边缘区淋巴瘤(MZL)，包括淋巴结MZL、结节外MZL、脾MZL和伴有绒毛淋巴细胞的脾MZL；淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL)；和粘膜相关淋巴样组织(MALT或结节外边缘区)淋巴瘤。中等分级B-NHL包括伴有或不伴有白血病牵涉的套细胞淋巴瘤(MCL)，弥漫性大细胞淋巴瘤(DLBCL)，滤泡性大细胞(或3级或3B级)淋巴瘤和原发性纵隔淋巴瘤(PML)。高分级B-NHL包括伯基特淋巴瘤(BL)，伯基特样淋巴瘤，小无裂细胞淋巴瘤(SNCCL)和淋巴母细胞淋巴瘤。其它B-NHL包括免疫母细胞性淋巴瘤(或免疫细胞瘤)，原发性渗出性淋巴瘤，HIV相关(或AIDS相关)淋巴瘤、以及移植后淋巴增殖性病症(PTLD)或淋巴瘤。B细胞恶性肿瘤还包括但不限于慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，幼淋巴细胞性白血病(PLL)，华氏巨球蛋白血症(WM)，毛细胞白血病(HCL)，大颗粒淋巴细胞(LGL)白血病，急性淋巴样(或淋巴细胞性或成淋巴细胞性)白血病和Castleman病。NHL还可以包括T细胞非霍奇金淋巴瘤(T-NHL)，其包括但不限于非特指型T细胞非霍奇金淋巴瘤(NOS)、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、血管免疫母细胞淋巴样病症(AILD)、鼻天然杀伤(NK)细胞/T细胞淋巴瘤、γ/δ淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿和塞扎里综合症。

造血系统癌症还包括霍奇金淋巴瘤(或疾病)，其包括经典霍奇金淋巴瘤、结节性硬化性霍奇金淋巴瘤、混合细胞性霍奇金淋巴瘤、淋巴细胞为主型(LP)霍奇金淋巴瘤、结节性LP霍奇金淋巴瘤和淋巴细胞消减型霍奇金淋巴瘤。造血系统癌症还包括浆细胞疾病或癌症，诸如多发性骨髓瘤(MM)包括郁积型MM、意义未明(或未知或不确定)的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、浆细胞瘤(骨、髓外)、淋巴浆细胞性淋巴瘤(LPL)、华氏巨球蛋白血症、浆细胞白血病和原发性淀粉样变性(AL)。造血系统癌症还可以包括另外的造血细胞的其它癌症，所述另外的造血细胞包括多形核白细胞(或嗜中性粒细胞)、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞、血小板、红细胞和天然杀伤细胞。在本文中称为“造血细胞组织”的包括造血细胞的组织包括骨髓；外周血；胸腺；以及外周淋巴样组织，诸如脾、淋巴结、与粘膜相关的淋巴样组织(诸如与肠相关的淋巴样组织)、扁桃体、派尔集合淋巴结和阑尾、以及与其它粘膜相关的淋巴样组织例如支气管衬里。

术语“包含”涵盖“包括”或“由……组成”，例如“包含”X的组合物可以仅由X组成，或者可以包括另外的物质，例如X + Y。

术语“基本上由……组成”将特征的范围限制为指定的材料或步骤以及不实质性影响请求保护的特征的一种或多种基本特征的那些。

术语“由……组成”排除任何另外的一种或多种组分的存在。

如本文所用的术语“细胞免疫疗法”是指其中免疫调节细胞被遗传修饰以便靶向疾病且然后被引入患者的疗法的类型。关键聚焦的领域是将嵌合抗原受体(CAR)或基因修饰的T细胞受体(TCR)引入免疫调节细胞上，以使其成为靶标特异性的。

如本文所用，术语“保守序列修饰”意指不显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。此类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域中已知的标准技术(诸如定点诱变和PCR-介导的诱变)将修饰引入本发明的抗体或抗体片段。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的氨基酸取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

术语“结构域”是指折叠的蛋白结构，其保留其三级结构而不依赖于蛋白的剩余部分。通常，结构域负责蛋白的离散功能特性，并且在许多情况下，可以被添加、除去或转移至其他蛋白，而不损失蛋白的剩余部分和/或结构域的功能。

如本文所用的“有效量”意指提供治疗或预防益处的量。

“编码”是指多核苷酸(诸如基因、cDNA或mRNA)中的特定核苷酸序列充当用于在生物过程中合成其他聚合物和大分子的模板的固有特性，所述其他聚合物和大分子具有限定核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或限定氨基酸序列以及由此产生的生物特性。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白，则该基因编码该蛋白。用作基因或cDNA的转录模板的编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同且通常在序列表中提供的)和非编码链两者均可以被称为编码该基因或cDNA的蛋白或其他产物。

如本文所用的术语“表位”是指与特定结合结构域、例如TCR分子的靶标结合结构域接触的抗原的该部分。表位可以是线性的或构象的/不连续的。构象或不连续的表位包含被其他序列分开、即不在抗原的一级序列中的连续序列中的氨基酸残基。尽管残基可能来自肽链的不同区域，但它们在抗原的三维结构中非常接近。在多聚体抗原的情况下，构象或不连续的表位可以包括来自不同肽链的残基。可以通过计算机建模程序或经由通过本领域中已知的方法、诸如X-射线晶体学获得的三维结构来确定表位内包含的特定残基。如本文所考虑，术语表位包括对多肽的翻译后修饰(其可以被抗原结合蛋白或结构域识别)，诸如糖基化蛋白的糖部分。

如本文所用的术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含可操作连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域中已知的所有那些，诸如并入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

如本文所用的术语“免疫调节性细胞”是指在免疫应答中发挥功能的细胞，或其祖细胞或后代。免疫调节性细胞的实例包括：T细胞(也称为T-淋巴细胞)，其可以是炎性、细胞毒性、调节性或辅助性T细胞；B细胞(或B-淋巴细胞)，其可以是浆B细胞或记忆B细胞；自然杀伤细胞；嗜中性粒细胞；嗜酸性粒细胞；嗜碱性粒细胞；肥大细胞；树突状细胞；或巨噬细胞。

术语“个体”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。在一个实施方案中，所述受试者是哺乳动物，诸如灵长类动物，例如狨猴或猴，或人。在一个进一步实施方案中，所述受试者是人。

如本文所用的术语“分离的”意指从自然状态改变或除去。例如，活动物中天然存在的核酸或肽不是“分离的”，但与其天然状态的共存材料部分或完全分离的相同的核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白可以以基本上纯化的形式存在，或可以存在于非天然环境、诸如例如宿主细胞中。

如本文所用的术语“慢病毒载体”意指源自慢病毒基因组的至少一部分的载体，尤其包括如Milone等人, Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)中提供的自灭活慢病毒载体。可以在临床上用作pELPS载体的替代方案的其他实例或慢病毒载体包括但不限于，例如，来自Oxford BioMedica的LentiVector®基因递送技术，来自Lentigen的LentiMax™载体系统等。慢病毒载体的非临床类型也是可用的，并且是本领域技术人员已知的。

如本文所用的术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，其能够感染非分裂细胞；它们可以将大量的遗传信息递送至宿主细胞的DNA中，因此它们是基因传递载体中最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。源自慢病毒的载体提供了在体内实现显著水平的基因转移的手段。

术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特别限定，否则该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参考核酸相似的结合特性，并以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另有说明，否则特定核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指示的序列。具体地，简并密码子取代可以通过生成其中一个或多个选择的(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等人, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka等人, J.Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); 和Rossolini等人, Mol. Cell. Probes 8:91-98(1994))。

术语“可操作连接的”是指调节序列和异源核酸序列之间的功能连接，其导致后者的表达。例如，当第一核酸序列被置于与第二核酸序列的功能关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则该启动子可操作连接至该编码序列。通常，可操作连接的DNA序列是连续的，并且在必需连接两个蛋白编码区域的情况下，它们在同一阅读框中。

如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白”可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基构成的化合物。蛋白或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可以构成蛋白或肽的序列的最大氨基酸数没有限制。多肽包括包含两个或更多个通过肽键彼此连接的氨基酸的任何肽或蛋白。如本文所用，该术语是指短链(其例如在本领域中通常也称为肽、寡肽和寡聚体)和长链(其在本领域中通常称为蛋白，其中有许多类型)两者。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白、等等。所述多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。

查询核酸序列和主题核酸序列之间的“百分比同一性”是表示为百分比的“同一性”值，当主题核酸序列在进行成对BLASTN比对之后与查询核酸序列具有100%查询覆盖率时，所述“同一性”值通过BLASTN算法来计算。查询核酸序列和主题核酸序列之间的此类成对BLASTN比对通过使用National Center for Biotechnology Institute的网站上可得的BLASTN算法的默认设置来进行，其中关闭低复杂性区域的过滤器。重要的是，查询核酸序列可以通过本文的一项或多项权利要求中鉴定的核酸序列来描述。

查询氨基酸序列和主题氨基酸序列之间的“百分比同一性”是表示为百分比的“同一性”值，当主题氨基酸序列在进行成对BLASTP比对之后与查询氨基酸序列具有100%查询覆盖率时，所述“同一性”值通过BLASTP算法来计算。查询氨基酸序列和主题氨基酸序列之间的此类成对BLASTP比对通过使用National Center for Biotechnology Institute的网站上可得的BLASTP算法的默认设置来进行，其中关闭低复杂性区域的过滤器。重要的是，查询氨基酸序列可以通过本文的一项或多项权利要求中鉴定的氨基酸序列来描述。

查询序列可以与主题序列具有100%同一性，或者其与主题序列相比可以包括最多达特定整数的氨基酸或核苷酸改变，使得%同一性小于100%。例如，查询序列与主题序列具有至少50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%同一性。此类改变包括至少一个氨基酸缺失、取代(包括保守和非保守取代)或插入，并且其中所述改变可以发生在查询序列的氨基或羧基末端位置或那些末端位置之间的任何位置，其单独散布在查询序列中的氨基酸或核苷酸之间或查询序列内的一个或多个连续组中。

如本文所用的术语“启动子”被定义为起始多核苷酸序列的特异性转录所需的细胞的合成机制或引入的合成机制识别的DNA序列。如本文所用，术语“启动子/调节序列”意指表达可操作连接至启动子/调节序列的基因产物所需的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，并且在其他情况下，该序列也可以包括表达基因产物所需的增强子序列和其他调节元件。所述启动子/调节序列可以是例如以组织特异性方式表达基因产物的启动子/调节序列。

“诱导型”启动子是这样的核苷酸序列，当其与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作连接时，基本上仅当对应于该启动子的诱导物存在于细胞中时，才引起在细胞中产生该基因产物。

如本文所用的“序列同一性”是如通过比较序列确定的两个或更多个氨基酸序列或两个或更多个核酸序列之间的相关性程度。序列的比较和序列同一性的测定可以使用数学算法来完成；本领域技术人员将意识到可用于比对两个序列并测定它们之间的百分比同一性的计算机程序。技术人员将理解，不同的算法可以产生略微不同的结果。

“组织特异性”启动子是这样的核苷酸序列，当与编码基因或由基因指定的多核苷酸可操作连接时，基本上仅当细胞是对应于该启动子的组织类型的细胞时，其才引起在该细胞中产生该基因产物。

如本文关于抗体所用的术语“特异性结合”及其语法变体意指识别且结合特定抗原、但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗体或抗体片段。例如，特异性结合来自一种物种的抗原的抗体也可以结合来自一种或多种物种的该抗原。但是，这种跨物种反应性本身不改变将抗体分类为特异性的。在另一个实例中，特异性结合抗原的抗体也可以结合抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身不改变将抗体分类为特异性的。在一些情况下，关于抗体、蛋白或肽与第二化学物质的相互作用，可以使用术语“特异性结合”或“特异性地结合”，以意指相互作用取决于化学物质上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别并结合特定蛋白结构，而不是总体结合蛋白。如果抗体对表位“A”是特异性的，则在含有标记的“A”和抗体的反应中的含有表位A(或游离，未标记的A)的分子的存在将减少与抗体结合的标记的A的量。

在免疫受体工程改造的TCR/CAR T细胞或CAR NK细胞的背景下使用的术语“刺激”意指通过刺激分子(例如，TCR/CD3或CAR/CD3复合物)与其同源配体的结合诱导的初步应答，由此介导信号转导事件，诸如但不限于经由CAR/CD3或TCR/CD3复合物的信号转导。刺激可以介导某些分子的表达改变，诸如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的重组等。

如本文所用的术语“T细胞受体”(“TCR”)是指存在于T细胞的表面上的受体，其识别作为与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的肽的抗原片段。天然TCR以αβ和γδ形式存在，其结构相似，但存在于不同的位置，并被认为具有不同的功能。TCR的细胞外部分具有两个恒定结构域和两个可变结构域。可变结构域含有多态环，其形成TCR的结合位点，且类似于抗体中的互补决定区(CDR)。在细胞免疫疗法的背景下，通常对TCR进行基因修饰以改变或改善其抗原识别。例如，通过引用并入本文的WO01/055366和WO2006/000830描述用于用异源TCR转染T细胞的基于逆转录病毒的方法。WO2005/113595 (其通过引用并入本文)描述了高亲和力NY-ESO T细胞受体。

合适的TCR特异性结合展示肿瘤抗原的肽片段的癌细胞的表面上的主要组织相容性复合物(MHC)。MHC是一组细胞表面蛋白，其允许获得性免疫系统识别‘外来’分子。蛋白在细胞内被降解，并被MHC呈递在细胞表面上。展示‘外来’肽(例如病毒或癌症相关肽)的MHC被具有适当TCR的T细胞识别，促进细胞破坏途径。癌细胞的表面上的MHC可展示肿瘤抗原的肽片段，即存在于癌细胞上但不存在于相应的非癌细胞上的抗原。识别这些肽片段的T细胞可以对癌细胞发挥细胞毒性作用。

在一些实施方案中，TCR的单独链(例如TCRα和TCRβ链)的编码序列可以通过切割识别序列分开。这允许TCR的链被表达为单一融合体，其经历细胞内切割以生成两个分开的蛋白。合适的切割识别序列是本领域中众所周知的，并且包括2A-弗林蛋白酶序列。

优选地，所述TCR不是由T细胞天然表达的(即，TCR是外源的或异源的)。异源TCR可以包括αβTCR异二聚体。合适的异源TCR可以特异性结合表达肿瘤抗原的癌细胞。例如，可以修饰T细胞以表达异源TCR，所述异源TCR特异性结合MHC，所述MHC展示由特定癌症患者中的癌细胞表达的肿瘤抗原的肽片段。由癌症患者中的癌细胞表达的肿瘤抗原可以使用标准技术鉴定。

异源TCR可以是合成或人工的TCR，即自然界中不存在的TCR。例如，可以工程改造异源TCR以增加其对肿瘤抗原的亲和力或亲合力(即亲和力增强的TCR)。相对于天然存在的TCR，亲和力增强的TCR可以包含一个或多个突变，例如，TCRα和β链的可变区的高变互补决定区(CDR)中的一个或多个突变。这些突变增加TCR对展示由癌细胞表达的肿瘤抗原的肽片段的MHC的亲和力。生成的亲和力增强的TCR的合适方法包括使用噬菌体或酵母展示筛选TCR突变体的文库，并且是本领域中众所周知的(参见例如Robbins等人 J Immunol (2008)180(9):6116; San Miguel等人 (2015) Cancer Cell 28 (3) 281-283; Schmitt等人(2013) Blood 122 348-256; Jiang等人 (2015) Cancer Discovery 5 901)。

如本文所用的术语“治疗的”意指治疗和/或预防。通过抑制、缓解或根除疾病的状态获得治疗效果。

术语“治疗有效量”是指将引发研究者、兽医、医师或其他临床医生所寻求的组织、系统或受试者的生物学或医学应答的主题化合物的量。术语“治疗有效量”包括当施用时足以防止所治疗的病症或疾病的一种或多种体征或症状的发展或在某种程度上减轻的化合物的量。治疗有效量将取决于化合物、疾病及其严重程度以及待治疗的受试者的年龄、重量等而不同。

如本文所用的术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原代受试细胞及其后代。

如本文所用的术语“转移载体”是指可用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。许多载体是本领域中已知的，包括但不限于线性多核苷酸，与离子或两亲性化合物相关的多核苷酸，质粒和病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制质粒或病毒。该术语还应被解释为进一步包括促进核酸转移至细胞中的非质粒和非病毒化合物，诸如例如聚赖氨酸化合物，脂质体等。病毒转移载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、γ逆转录病毒载体、慢病毒载体等。

如本文所用，术语“治疗”及其语法变化意指治疗性疗法。在提及特定病况时，治疗意指：(1)改善或预防病况的一种或多种生物学表现的病况，(2)干扰(a)导致或负责病况的生物学级联中的一个或多个点、或(b)病况的一种或多种生物学表现，(3)减轻与病况或其治疗相关的一种或多种症状、效应或副作用，(4)减缓病况或者病况的一种或多种生物学表现的进展和/或(5)通过持续一段时间将所述病况的一种或多种生物学表现消除或降低至不可检测的水平(其被视为该表现的缓解状态，而在缓解时段内无需额外的治疗)来治愈所述病况或所述病况的一种或多种生物学表现。本领域技术人员将理解被认为是特定疾病或病况的缓解的持续时间。由此也考虑了预防性疗法。技术人员应了解，“预防”不是绝对术语。在医学中，“预防”应理解为指药物的预防性施用，以基本上减小病况或其生物学表现的可能性或严重程度、或者延迟此类病况或其生物学表现的发作。例如，当受试者被视为处于发展癌症的高风险时，诸如当受试者具有强癌症家族史或受试者已暴露于致癌物时，预防性疗法是适当的。

如本文所用的短语“在转录控制下”或“可操作连接”意指启动子相对于多核苷酸处于正确的位置和方向，以控制RNA聚合酶的转录起始和多核苷酸的表达。

“载体”是包含能够转移或运输另一种核酸分子的核酸分子的物质组合物。转移的核酸通常连接至，例如插入，载体核酸分子。载体可以包括指导细胞中的自主复制的序列，或者可以包括足以允许整合入宿主细胞DNA的序列。有用的载体包括例如质粒(例如，DNA质粒或RNA质粒)、转座子、粘粒、细菌人工染色体和病毒载体。有用的病毒载体包括例如复制缺陷型逆转录病毒和慢病毒。

实施例

实施例1：克隆策略和结果

构建了编码单个CD8α_F2A_NY-ESOc259α TCR_P2A_NY-ESOwtβ TCR ORF的慢病毒载体转基因表达质粒。其经过设计，使得在转导至T细胞中之后，整合的载体转基因盒将充当模板，以通过在每个2A部分的末端的翻译肽键跳跃的方式来产生3种单独蛋白中的每一种。在设计中，然后通过弗林蛋白酶切割来除去残留的C-末端2A部分。所得的CD8α蛋白形成同二聚体，以通过亲和力增强的NY-ESO α/β TCR辅助I类肽-HLA抗原的结合。

通过经由重叠PCR融合两个单独的PCR片段，生成编码CD8α_F2A_NY-ESOc259αTCR_P2A_NY-ESOwtβ的全长序列。第一PCR片段编码CD8α与C-末端弗林蛋白酶/SGSG接头序列。第二PCR片段编码N-末端弗林蛋白酶/SGSG接头序列与F2A跳跃肽和NY-ESOc259α TCR_P2A_NY-ESOwtβ TCR序列。编码弗林蛋白酶/SGSG接头序列的核苷酸序列提供了两个PCR产物之间的互补区。PCR策略的示意图显示于图1中。

从现有的内部质粒扩增PCR产物1，所述质粒编码与内部TCR序列读框符合的CD8α和F2A肽。该片段还含有5' Nhel位点和紧接在起始ATG上游的Kozak序列GCTAGCCGCCACC。用引物Lenti_eF1a (AGGCCAGCTTGGCACTTGAT)和Furin_CD8_rev (ACCACTACCACTTCTTTTAGCTCTTGAACCGACGTATCTCGCCGAAAGGC)扩增PCR产物1。用这些引物的扩增产生871 bp的产物(注意，引物Lenti_eF1a位于EF1a启动子区域中，且因此PCR产物1编码EF1a启动子的部分片段，其在用NheI消化后除去)。

从分开的内部质粒扩增PCR产物2，所述质粒编码与NY-ESOc259α TCR_P2A_NY-ESOwtβ TCR序列和中间F2A肽融合的额外基因。用引物FurinF2AF (GGTTCAAGAGCTA AAAGAAGTGGTAGTGGTGCCCCTGTGAAGCAGACC)和Lenti WDCHr (CGTATCCACATA GCGTAAAAGG)扩增PCR产物2。用这些引物的扩增产生2038 bp的产物。该片段编码TCR序列与紧接在TAA终止密码子之后的3' SalI GTCGAC位点(注意，引物Lenti WDCHr位于lenti骨架(WPRE序列)内，并且该额外序列在用SalI消化后除去)。

在PCR后，两种产物均通过凝胶提取纯化，并通过用5'引物Lenti_eF1a和3'引物Lenti WDCHr的重叠PCR融合在一起。该扩增产生2879 bp的产物。扩增全长CD8α_F2A_ NY-ESOc259α TCR_P2A_NYESOwtβ序列后，将PCR产物进行凝胶纯化，并用NheI和SalI消化。将消化的产物连接至慢病毒载体骨架中独特的NheI和SalI位点之间。通过限制性酶消化和DNA测序来筛选来自该连接的克隆。选择单个克隆用于在巨大制备规模上进一步纯化质粒DNA。

内部生成其中已经除去WPRE序列的新的慢病毒载体骨架。通过用NheI和SalI限制性消化从上面生成的构建体移取CD8α_F2A_ NY-ESOc259α TCR_P2A_NYESOwtβ编码序列，并亚克隆至新骨架的独特的NheI和SalI限制性位点之间。这产生慢病毒ADB1035。变体ADB1035_kan的质粒图谱呈现于图2中。

实施例2：CD8α表达对T细胞活化的影响

CD40配体(CD40L，也称为CD154)主要在活化的T细胞(优选CD4+ T细胞)上表达。其充当共刺激分子，其结合抗原呈递细胞(APC)上的CD40。CD40-CD40L相互作用许可APC活化抗原特异性初始CD8+ T细胞。其响应于TCR-介导的信号传导以及非生理刺激(诸如抗CD3靶向)而表达；并且是瞬时表达的(TCR活化后5 min至6小时)。

CD40L用作响应于抗原的早期T细胞活化的标志物，并且在CD4+ T细胞中测量到。将来自3个供体(第124、147、149袋(Wave))的模拟临床规模袋的T细胞与靶细胞孵育5小时，并且针对细胞内CD40L进行染色。使用的靶细胞是A375 (NY-ESO-1+/LAGE-1A-)、Mel624(NY-ESO-1+/LAGE-1A+)和阴性对照HCT-116 (NY-ESO-1/LAGE-1A-)。包括含有额外NY-ESO-1肽SLLMWITQC的孔作为阳性对照，并且包括单独的T细胞(未刺激)作为反映CD40L基线的阴性对照。结果显示于图3中。使用识别NY-ESO-1

总体而言，响应于抗原阳性细胞暴露的CD40L上调表明CD8α NY-ESO-1

实施例3：抗原特异性T细胞增殖

为了确定CD8α同二聚体共受体对CD8α NY-ESO-1

CD4+ T细胞通常不识别与MHC-I类分子缔合的肽。然而，由于NY-ESO-1

还通过计算Vβ+CD8+和CD4+ T细胞亚群响应于NY-ESO-1阳性细胞系A375的增殖指数(PI)来评价抗原特异性增殖(图5)。PI代表所有响应细胞的平均分裂数。

在该测定中，用紫色增殖染料(VPD450)负载的细胞将该染料均匀地分布在子细胞之间。在流式细胞术测定中染料的减少指示细胞分裂并因此指示增殖。静息的T细胞用VPD450染色，并单独孵育3天或与抗原呈递细胞(T细胞：靶细胞比率= 5：1)和经照射的靶细胞在10

计算来自三个不同供体(第128袋、第147袋和第149袋)的ntd、NY-ESO-1

如从图5可见，尽管对于CD8+ T细胞没有观察到PI的统计学显著性差异，但在组合分析中，CD8α NY-ESO-1

实施例4：CD8α表达对CD4+细胞Th1和Th2细胞因子应答的影响

初始CD4+ T细胞在活化后经历向不同亚群的极化，其分泌不同的细胞因子组合。这些亚群中首先定义且最佳表征的是Th1和Th2亚群。Th1细胞的特征在于分泌细胞因子、诸如IFN-γ、TNFα和IL2。它们被认为主要通过增强CD8+ T细胞应答或通过直接活化巨噬细胞吞噬细胞内病原体来负责针对细胞内病原体的免疫应答。相比之下，Th2细胞通常分泌特征细胞因子IL4、IL5和IL13，它们被认为通过支持B细胞增殖和分化以及抗体类别转换而对体液免疫是重要的(Kim和Cantor, Cancer Immunol Res. 2014 Feb;2(2):91-8)。

Th1细胞被认为比Th2细胞具有更有效的抗肿瘤作用，这可能归因于产生大量IFN-γ，其增强CD8+ T细胞的引发和扩增。此外，Th1细胞帮助将其他免疫细胞(包括自然杀伤(NK)细胞和I型巨噬细胞)募集至肿瘤部位，其可以共同起作用以根除肿瘤。Th1细胞及其产生的细胞因子(诸如IFN-γ)与许多癌症类型的良好临床结果强烈相关(Fridman等人, NatRev Cancer. 2012 Mar 15;12(4):298-306)。相反，存在证据表明Th2细胞可能反而促进一些癌症中的肿瘤生长(Kim和Cantor)，并且大多数时间与不良的临床结果和侵袭性肿瘤相关(Fridman等人)。因此，用CD8α转导的CD4+ T细胞对Th1细胞因子的诱导或增强可能被认为在肿瘤微环境内是期望的，而向Th2表型的偏向可能不太有利。

当用NY-ESO-1抗原攻击NY-ESO-1

Th1细胞因子应答–临床前袋规模数据

白介素2 (IL-2)是T淋巴细胞的生长、存活和分化因子，其在促进和控制T细胞应答和功能中发挥至关重要的作用。IL-2主要由CD4+ T细胞在活化后早期产生，并且可以以自分泌或旁分泌方式发挥作用。其刺激CD4+和CD8+ T细胞的存活、增殖和分化。图6显示通过Luminex

干扰素-γ (IFN-γ)由活化的CD4+和CD8+ T细胞(但主要由活化的CD8+ T细胞产生)和NK细胞产生。IFN-γ通过刺激MHC分子和许多参与抗原加工的蛋白的表达来促进抗原向T细胞的呈递。其还通过促进CD4+ T细胞分化为产生IFN-γ的Th1亚型并抑制Th2和Th17细胞的发育来放大这些作用。其也是主要的活化巨噬细胞的细胞因子。

肿瘤坏死因子α (TNFα)是一种促炎细胞因子，其响应于许多不同的微生物产物而分泌；主要通过组织巨噬细胞和树突状细胞，但也通过其他细胞类型，包括脂肪细胞、CD4 T细胞和成纤维细胞分泌。其增强血管内皮对白细胞的粘附性，并促进跨内皮迁移。其还在许多其作用(包括MHC诱导和巨噬细胞活化)中与IFN-γ协同作用。TNFα是介导针对细菌和其他感染性微生物的免疫应答中的重要因素，并且对各种各样的肿瘤细胞是细胞毒性的。

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)近来已经在前列腺癌疫苗试验中作为新佐剂进行测试，并被证明增强CD8+细胞毒性T细胞向肿瘤微环境的募集。已经显示GM-CSF优先增强1型树突状细胞(DC1)(负责起始细胞毒性免疫应答的DC亚群)的数量和活性。

结果与IL2类似，并且在3个供体中的2个中对于Th1细胞因子IFN-γ、TNFα和GM-CSF看到，其中在48小时时间点，与单独的NY-ESO-1

除了2D测定以外，通过测量IFN-γ来测定T细胞对抗原阳性3D球状体的应答(图7)。在添加T细胞后139h收集上清液，并通过ELISA测量上清液中的IFN-γ的水平。图展示由外周血淋巴细胞(PBL)、CD4+或NY-ESO-1

Th2细胞因子应答

Th2 CD4+ T细胞被认为就过继免疫应答而言是抑制性的，并且已经与不佳的癌症预后相关。在这项研究中检查了最广泛描述的Th2细胞因子IL4、IL5、IL10和IL13。

在研究规模上，从CD8α NY-ESO-1

实施例5：CD8α表达对其他细胞因子和趋化因子的NY-ESO-1

除了Th1和Th2应答以外，还检查额外细胞因子和趋化因子的水平。NY-ESO-1

表1. 由CD8α NY-ESO-1

从表1的结果来看，观察到CD4+ CD8α NY-ESO-1

实施例6：通过CD8α共表达增强颗粒酶B表达

颗粒酶B是一种在CTL的颗粒中发现的丝氨酸蛋白酶。其由T细胞释放，并且摄取导致细胞凋亡级联和靶细胞的杀伤。因此，其表达是T细胞杀伤活性的替代物。经由颗粒酶BELISA，在与A375细胞共培养的从24小时和48小时共培养测定(Th1/Th2细胞因子应答)收集的上清液中，评价转导的T细胞的细胞毒性功能(图8)。当用抗原阳性A375细胞攻击时，存在从CD8α NY-ESO-1

还进行测量颗粒酶B的NY-ESO-1肽稀释测定。在较高的肽浓度下，这显示来自CD8αNY-ESO-1

3-维(3D)细胞培养测定中的颗粒酶B表达

在3D球状体系统中进行许多测定(包括颗粒酶B和细胞毒性)。使用编码GFP的载体转导的A375人黑素瘤细胞(A375-GFP)在具有细胞排斥涂层的板中生长，以促进细胞彼此粘附以形成3D细胞结构。以两种不同的密度接种细胞，以产生“中”(400 μm直径)和“大”(500μm直径)结构。然后添加针对转导效率归一化的袋规模(Wavescale)的T细胞。对于该测定，测试2袋，147和149。颗粒酶B测定的结果显示于图9中。在添加T细胞后139h收集上清液，并通过ELISA测量上清液中的颗粒酶B的水平。图9中的图表展示由外周血淋巴细胞(PBL)、CD4+或CD8+ NY-ESO-1

实施例7：CD8α T细胞的细胞毒性

进行三组细胞毒性T细胞杀伤测定，其将CD8α NY-ESO-1

CD8α的研究规模细胞毒性

在研究规模上，从全血分离来自7个供体的PBL、CD4+和CD8+细胞，转导，扩增14天，然后进行测定。使用对NY-ESO-1没有亲和力的模拟TCR (TCR1)作为对照。使用HLA-A2+/NY-ESO-1+人黑素瘤细胞系A375、SKMel37和NY-ESO-1抗原阴性细胞HepG2作为靶细胞。细胞用SLLMWITQV或TC1肽脉冲处理。通过添加来自相同供体的非转导T细胞来使转导效率归一化。使用CellPlayer™ 96-Well Kinetic Caspase-3/7试剂(Essen Biosciences)测量效应T细胞杀伤，其中在IncyCyte Zoom系统上获取图像。添加T细胞后每两小时获取数据图像，持续最长达96小时。分析图像，包括排除门以从分析消除死亡/垂死的效应细胞。CD8α NY-ESO-1

对于测试的所有七个供体，仅用c259 TCR转导的PBL和CD8+ T细胞能够强健地杀死表达NY-ESO-1的A375细胞。CD4+ NY-ESO-1

数据表明，CD8α与c259 TCR在CD4 T细胞中的共表达已经通过增加TCR-pMHC相互作用的结合亲合力而增强其肽敏感性。当抗原水平低时，这可能是重要的，因为当靶细胞用高水平的同源肽脉冲处理时，在NY-ESO-1

对于细胞系SKMel37，看到类似的结果，在7个供体中的5个中，具有CD8α NY-ESO-1

临床前袋规模细胞毒性数据

为了进一步评价CD8α NY-ESO-1

靶细胞与分离的CD4+ T细胞(在旁边为PBL)一起孵育。还将CD8α NY-ESO-1

图12显示CD8α NY-ESO-1

用于临床前摇袋T细胞生产的培养条件与用于实验的研究规模包装的那些相比存在差异。这可以解释研究和临床前实验之间在CD8α对细胞杀伤的影响中的一些差异；例如研究和临床前T细胞过程之间CD3/CD28珠粒的除去时间的差异可能导致体外培养中的差异的T细胞活化状态。

临床前袋规模3D球状体细胞毒性测定

使表达NY-ESO-1的HLA-A*02阳性A375-GFP细胞在具有细胞排斥涂层的板中生长，以促进细胞彼此粘附，以形成3D细胞球状体。以两种不同的密度接种细胞，以产生“中”(400μm直径)和“大”(500 μm直径)3D“细胞结构”。将袋规模T细胞针对在添加至测定之前的转导效率归一化。

在中和大球状体间，在CD4+ T细胞级分中，CD8α NY-ESO-1

序列表

<110> GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Limited

ADAPTIMMUNE LIMITED

<120> T细胞修饰

<130> PU66650

<150> US 62/727103

<151> 2018-09-05

<160> 6

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 235

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 1

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Ser Gln Phe Arg Val Ser Pro Leu Asp Arg Thr

20 25 30

Trp Asn Leu Gly Glu Thr Val Glu Leu Lys Cys Gln Val Leu Leu Ser

35 40 45

Asn Pro Thr Ser Gly Cys Ser Trp Leu Phe Gln Pro Arg Gly Ala Ala

50 55 60

Ala Ser Pro Thr Phe Leu Leu Tyr Leu Ser Gln Asn Lys Pro Lys Ala

65 70 75 80

Ala Glu Gly Leu Asp Thr Gln Arg Phe Ser Gly Lys Arg Leu Gly Asp

85 90 95

Thr Phe Val Leu Thr Leu Ser Asp Phe Arg Arg Glu Asn Glu Gly Tyr

100 105 110

Tyr Phe Cys Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe

115 120 125

Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg

130 135 140

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg

145 150 155 160

Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly

165 170 175

Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr

180 185 190

Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His

195 200 205

Arg Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val Lys Ser

210 215 220

Gly Asp Lys Pro Ser Leu Ser Ala Arg Tyr Val

225 230 235

<210> 2

<211> 274

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 2

Met Glu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln Trp

1 5 10 15

Val Ser Ser Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val

20 25 30

Pro Glu Gly Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala

35 40 45

Ile Tyr Asn Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr

50 55 60

Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg

65 70 75 80

Leu Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile

85 90 95

Ala Ala Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Arg

100 105 110

Pro Leu Tyr Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr Ser

115 120 125

Leu Ile Val His Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln

130 135 140

Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp

145 150 155 160

Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr

165 170 175

Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser

180 185 190

Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn

195 200 205

Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro

210 215 220

Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp

225 230 235 240

Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu

245 250 255

Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp

260 265 270

Ser Ser

<210> 3

<211> 312

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 3

Arg Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp

1 5 10 15

Ala Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val

20 25 30

Leu Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn

35 40 45

His Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg

50 55 60

Leu Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val

65 70 75 80

Pro Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu

85 90 95

Arg Leu Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala

100 105 110

Ser Ser Tyr Val Gly Asn Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser

115 120 125

Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val

130 135 140

Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala

145 150 155 160

Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu

165 170 175

Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp

180 185 190

Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys

195 200 205

Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg

210 215 220

Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp

225 230 235 240

Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala

245 250 255

Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln

260 265 270

Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys

275 280 285

Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met

290 295 300

Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly

305 310

<210> 4

<211> 745

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 4

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccgagccagt tccgggtgtc gccgctggat cggacctgga acctgggcga gacagtggag 120

ctgaagtgcc aggtgctgct gtccaacccg acgtcgggct gctcgtggct cttccagccg 180

cgcggcgccg ccgccagtcc caccttcctc ctatacctct cccaaaacaa gcccaaggcg 240

gccgaggggc tggacaccca gcggttctcg ggcaagaggt tgggggacac cttcgtcctc 300

accctgagcg acttccgccg agagaacgag ggctactatt tctgctcggc cctgagcaac 360

tccatcatgt acttcagcca cttcgtgccg gtcttcctgc cagcgaagcc caccacgacg 420

ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc 480

ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc 540

tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg 600

gttatcaccc tttactgcaa ccacaggaac cgaagacgtg tttgcaaatg tccccggcct 660

gtggtcaaat cgggagacaa gcccagcctt tcggcgagat acgtcggttc aagagctaaa 720

agaagtggta gtggtgcccc tgtga 745

<210> 5

<211> 822

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 5

atggagaccc tgctgggcct gctgatcctg tggctgcagc tccagtgggt gtccagcaag 60

caggaggtga cccagatccc tgccgccctg agcgtgcccg agggcgagaa cctggtgctg 120

aactgcagct tcaccgactc cgccatctac aacctgcagt ggttccggca ggaccccggc 180

aagggcctga ccagcctgct gctgatccag agcagccagc gggagcagac cagcggacgg 240

ctgaacgcca gcctggacaa gagcagcggc cggagcaccc tgtacatcgc cgccagccag 300

cccggcgaca gcgccaccta cctgtgcgct gtgcggcctc tgtacggcgg cagctacatc 360

cccaccttcg gcagaggcac cagcctgatc gtgcacccct acatccagaa ccccgacccc 420

gccgtgtacc agctgcggga cagcaagagc agcgacaagt ctgtgtgcct gttcaccgac 480

ttcgacagcc agaccaatgt gagccagagc aaggacagcg acgtgtacat caccgacaag 540

accgtgctgg acatgcggag catggacttc aagagcaaca gcgccgtggc ctggagcaac 600

aagagcgact tcgcctgcgc caacgccttc aacaacagca ttatccccga ggacaccttc 660

ttccccagcc ccgagagcag ctgcgacgtg aaactggtgg agaagagctt cgagaccgac 720

accaacctga acttccagaa cctgagcgtg atcggcttca gaatcctgct gctgaaggtg 780

gccggattca acctgctgat gaccctgcgg ctgtggagca gc 822

<210> 6

<211> 939

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工合成的序列

<400> 6

aggatgagca tcggcctgct gtgctgcgcc gccctgagcc tgctgtgggc aggacccgtg 60

aacgccggag tgacccagac ccccaagttc caggtgctga aaaccggcca gagcatgacc 120

ctgcagtgcg cccaggacat gaaccacgag tacatgagct ggtatcggca ggaccccggc 180

atgggcctgc ggctgatcca ctactctgtg ggagccggaa tcaccgacca gggcgaggtg 240

cccaacggct acaatgtgag ccggagcacc accgaggact tccccctgcg gctgctgagc 300

gctgccccca gccagaccag cgtgtacttc tgcgccagca gctatgtggg caacaccggc 360

gagctgttct tcggcgaggg ctccaggctg accgtgctgg aggacctgaa gaacgtgttc 420

ccccccgagg tggccgtgtt cgagcccagc gaggccgaga tcagccacac ccagaaggcc 480

acactggtgt gtctggccac cggcttctac cccgaccacg tggagctgtc ctggtgggtg 540

aacggcaagg aggtgcacag cggcgtgtct accgaccccc agcccctgaa ggagcagccc 600

gccctgaacg acagccggta ctgcctgtcc tccagactga gagtgagcgc caccttctgg 660

cagaaccccc ggaaccactt ccggtgccag gtgcagttct acggcctgag cgagaacgac 720

gagtggaccc aggaccgggc caagcccgtg acccagattg tgagcgccga ggcctggggc 780

agggccgact gcggcttcac cagcgagagc taccagcagg gcgtgctgag cgccaccatc 840

ctgtacgaga tcctgctggg caaggccacc ctgtacgccg tgctggtgtc tgccctggtg 900

ctgatggcta tggtgaagcg gaaggacagc cggggctaa 939