从鱼或甲壳类动物的成熟活卵生产鱼子酱或类鱼子酱产品的方法及其产品

本发明涉及一种由鱼或甲壳类动物的成熟活卵中生产鱼子酱或类鱼子酱产品的方法，所述成熟活卵处于可受精但未受精的状态，并且在卵血浆中具有天然的钾含量，通过在不破坏卵的盐溶液中和然后在包含水和至少一种溶解于其中的阳离子成分的至少一种溶液中处理成熟活卵，从而使成熟活卵的卵壳稳定以得到鱼子酱或类鱼子酱产品。

制备的未受精卵，尤其是鱼类的未受精卵，被认为是美味佳肴，并且越来越多地被食用。术语“卵子(roe)”用于描述(以外行的术语)处于任何成熟阶段的卵，即从未成熟到成熟，而卵的发育程度并没有明确定义。“产卵(Spawn)”是指由雌性的鱼类、龙虾或其他水生动物在水中产的鲜活成熟的用于受精的卵。排卵(Ovulated eggs)是成熟、可育的活卵，它们从卵巢的卵泡壳中释放出来并释放到体腔中。然后它们从那里孵出或剥离。根据粮农组织食品法典，鱼子酱只能用各种鲟鱼的雌性鱼的卵生产。除了野生鲟鱼，在淡水水产养殖设备中繁殖的鲟鱼现在也用于鱼子酱生产。除少数例外，鲟鱼产卵仅在淡水中发生。最著名的鲟鱼种类(鲟科)包括西伯利亚鲟(A.baerii)、俄罗斯鲟(A.guldenstaedtii)、达氏鲟(也称为白鲟)(Huso，也叫Beluga sturgeon)、高首鲟(A.transmontanus)、小体鲟(A.ruthenus)及其白化体。然而，施氏鲟(A.schrenckii)(雌性)和达氏鳇(A.dauricus)(雄性)的杂交种和与鲟鱼密切相关的美国“白鲟”(匙吻鲟，Polydon spatula)也被命名。各种类型鱼子酱是市场上已知的，诸如闪光鲟鱼子酱(Sevruga)、奥西特拉鱼子酱(Osietra)和卡露伽鱼子酱(beluga)。白鱼子酱(也称为“金鱼子酱”)是从白化鲟鱼获得的。小体鲟(A.ruthenus)白化体有时在水产养殖设施中用于生产所谓的“沙皇鱼子酱”。然而，这是不是“真正的沙皇鱼子酱”，它来源于原始的达氏鲟的白化体，是非常罕见的。

目前，生产和销售由大约38种不属于鲟鱼的其他鱼类生产的类鱼子酱产品，例如参见P Bronzi et al.:"Present and future sturgeon and caviar production andmarketing:A global market overview"(Journal of Applied Ichthyology 2014,30SI,6,1536-1546)。这些鱼类包括金枪鱼、圆头鱼、鲑鱼、鳟鱼、鲱鱼、鳕鱼、鲤鱼、白鱼和毛鳞鱼，其未成熟的鱼卵被用来制作类鱼子酱产品(也称为“鱼子酱替代品”或“假鱼子酱”)。龙虾，大龙虾和其他甲壳类动物的鱼卵也可以加工成类鱼子酱产品。本发明要求保护的方法和可以生产产品是指这些鱼类和甲壳类(以及其他合适但未提及的鱼类和甲壳类)。除非明确提到是来自鲟鱼的鱼子酱，否则以下内容通常意指并包括来自鲟鱼以外的鱼类和甲壳类动物特别是龙虾和小龙虾的鱼子酱以及类鱼子酱产品。

鱼子酱和类鱼子酱产品是有价值的食物。鱼子酱富含蛋白质，其中含有大量必需氨基酸和脂肪。鱼子酱含有维生素D、E、B

目前市场上有一些鱼子酱产品是用鲟鱼的成熟排卵的卵制成的。然而，如今，仍主要未成熟的卵子与被杀死的鲟鱼的卵巢提供鱼子酱。这是常规的鱼子酱提取方法。以水产养殖鲟鱼的鱼子酱为例，最初也认为，就像过去的野生鱼子酱一样,不成熟的卵具有足够的强度，无需进一步进行侵入性清洗步骤的处理，即可去除性腺组织的残留物，并用于重新包装。然而，过去20年从水产养殖鲟鱼中提取鱼子酱的经验表明，这种死的水产养殖鲟鱼的未成熟鱼卵太软，只能通过使用硼砂或其他防腐剂或巴氏灭菌法进一步加工成适合重新包装的产品并保存2到3个月以上。

为了从野生捕获物中提取鱼子酱而杀害雌性，加上过度捕捞、工业、农业和生活废水污染水域，以及堰坝和水坝的建造阻碍了向淡水产卵场迁移的路线，已经对大约27种不同种类鲟鱼的野生种群造成了巨大威胁。尽管《华盛顿濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)对鲟鱼进行了保护，但在许多地区，偷猎和非法黑市贸易仍然盛行。根据世界鲟鱼保护协会(World Sturgeon Conservation Society)的报告显示，全世界都启动了成本高昂的鲟鱼重新繁殖计划，但不幸的是，这些计划在中国收效甚微，在伊朗和俄罗斯也是如此。只有在美国和加拿大，保护和重新增加种群的措施才初见成效。除了允许捕获产卵动物外，各种水产养殖的鲟鱼也被放归野外，并取得了不同程度的成功，这是保护计划的一部分，以挽救濒临灭绝的鱼类。小龙虾和贵族小龙虾种群也受到环境污染和小龙虾瘟疫等输入性疾病的严重威胁。在水产养殖中小龙虾养殖的决定性进展和广泛的放养措施在保护本地种群方面发挥了重要作用。在水产养殖中，使雌性动物存活下来进行繁殖，并通过剥离获得卵。然而，在水产养殖鱼子酱生产中，由于没有掌握更温和的方法，雌性鲟鱼通常只是简单地用传统方法宰杀。这完全忽略了它们随着年龄増长而显示出明显提高的繁殖能力的事实。在俄罗斯也部分实行“剖宫产法”，这绝不是一种温和的方法，因为它与用这种方法处理的鲟鱼的高死亡率有关。

现有技术

从RU 2 232 523 C2中得知用经过排卵的鲟鱼卵生产颗粒鱼子酱的方法。首先将收获的排卵的卵子在热的1.5％至2％的防腐剂水溶液中进行处理，以备随后在65℃至70℃的温度下进行巴氏灭菌。除了每个加热过程都会对对鱼卵的味道都有显著影响的事实之外，使用卵膜非常柔软且粘稠的排卵的卵子不能保证它们能够承受后续的防腐剂处理而不会破裂。然而，由于很难去除破卵，即使是很小一部分的破卵也会显著降低鱼子酱的质量。巴氏杀菌使有价值的蛋白质变性并赋予鱼子酱粉状的风味。

关于从鲟鱼中提取排卵的卵子，例如，从M.Szczepkowski et al.:"A simplemethod for collecting sturgeon eggs using a catheter"(Arch.Pole.Fich.(2011)19:123-128)中已知为此目的使用导管。结果，卵可以很容易地被真空除去或吸掉。从鲟鱼的腹腔简单地按摩取出卵也是众所周知的。这种方法被称为“剥离”，是最温和的收获方法。

与本发明最接近的现有技术在WO 2007/045233 A1中公开。描述了一种从水生动物最好是鱼类的排卵但未受精的成熟卵子中生产鱼子酱或类鱼子酱产品的方法，通过在溶液中对成熟卵进行外源性处理，其中无细胞卵膜的内源性形态变化，使卵细胞(具有周围卵膜的卵浆)与外界环境分离，结构稳定。所使用的溶液包含水和至少一种阳离子组分(钙阳离子Ca

所描述的反应链在文献中称为“第二反应”。这是一个缓慢的新陈代谢反应,在第一个精子与卵子融合后会形成永久的物理-机械结构，以保护卵免受卵外聚集的其他精子(多精子)的侵害，但最重要的是免受环境毒素、微生物和机械损坏新兴的胚胎。在已知的方法中，该第二反应是在没有精子受精的情况下引发的。所获得的结构稳定性在产品被消耗时提供了“蠕变效应”和液态卵浆的爆炸性排放。对扑通效应特定强度的偏好在很大程度上取决于鱼子酱的用途和客户。

此外，从EP 2 522 226 B1中知道，以类黄酮和抗氧化剂紫杉酚(二氢槲皮素)和有机盐特别是柠檬酸钾的组合物来保存在水产养殖中养育的未成熟鱼卵。然而,所使用的高浓度组合物导致细胞内离子环境的明显变化，从而引发程序性细胞死亡(细胞凋亡)。因此，用这种方法处理过的鱼卵立即被杀死。出版物SU 1662469 A1和RU 2 048 111 C1还显示了保存鲟鱼卵的方法，其中钾化合物的使用浓度非常高，以至于卵中的细胞凋亡立即被引发并死亡。对应于上述RU 2 232 523 C2的EP 2 868 207 B1也同样适用，其中通过加热进行额外的变性。

G.E.Bledsoe et al.:"Caviars and Fish Roe products"(critical Reviewsin Food Science andNutrition,Vol.43,No.3,May 1,2003,pages 317to 356)公开了在其上下文中的硝酸盐作为螃蟹、鲟鱼和其他鱼类卵的一般防腐剂的应用中使用硝酸钾。然而，正如所有保藏过程中惯常发生的，在如此高浓度的情况下，会产生细胞毒性作用，从而极大地破坏了渗透平衡，并立即杀死处理过的卵。此外，被宰杀的鱼只保留了处于发育初期的未成熟卵，一方面必须将其从性腺中机械擦拭，以承受可能的损害，另一方面还没有充分形成任何成熟的卵膜结构，所以他们不能使用的发明。

DE 2 416 685 A公开了一种在保存鲑鱼卵或鲑鱼籽时，通过添加食品法允许的柠檬酸盐形式的食品添加剂来改善红色保存的方法。方法完成后，后者在最终产品中仍可检测到并改变其组成。所使用的高浓度(5至10重量％)在接触后会立即杀死活卵。只有使用未成熟的鱼卵才可以用水冲洗。如前所述，成熟的鱼卵将形成粘稠的凝胶层。由于未发育和不稳定的卵膜不能保护卵，所以冷冻鱼卵子保存前后都会导致冷冻破坏卵膜并导致水分流失。JP S63-36763 A公开了一种降低鱼卵保存中氯化钠含量以降低咸味的方法。氯化钠也被各种钾化合物取代。然而，这种情况再次发生在如此高浓度的情况下，以至于卵，即未成熟的卵，并且不再能够进行代谢工作。JP 2001-299285 A公开了一种处理未成熟冷冻的卵以改善质地的方法。将卵在5℃下使用含钾的化学物质漂洗长达24小时。如此长的处理时间会中断每个代谢过程。由于鱼卵被冷冻而没有防止防冻保护，所以未成熟的鱼卵不再具有任何新陈代谢活性，也不能繁殖。因此它们也不能用于要求保护的发明。然而，本发明要求保护的并不涉及后续和杀灭保存、脱色或冷冻，而是涉及来自未经处理的成熟活卵的鱼子酱和类鱼子酱产品的原始生产。活卵处理后的保存或冷冻仅是本发明中可选的附加步骤。因为没有必要，所以完全不需要脱色。

由Huang Hui et al.:"Effect of Synthetic Preservatives on VolatileFlavor Compounds in Caviar of Sturgeon"(Huso dauricus×A.schrenckii)([J]FOODSCIENCE,2015,36(12):97-103)知道，优选通过用防腐剂山梨酸钾(E202，山梨酸)和抗坏血酸盐(维生素C)合成保存来防止在鱼子酱冷藏时的味道损失。在各试验组中使用恒定的0.5/ml的山梨酸钾。由于进行了防腐处理，未成熟的卵被用来获得更强烈的味道。山梨酸钾被认为可以抑制霉菌的生长和发酵，但也会损害产品的味道。

由L.Dufresne et al.:"Kinetics ofactin assembly attendingfertilization or artificial activation ofsea urchin eggs"(Experimental CellResearch,Elsevier,Amsterdam,NL,vol.172,No.1,September 1987,pages 32to 42)涉及海胆卵的人工活化。尽管本发明不涉及海胆卵的处理，因为它们没有显示合适的结构(仅具有两层的卵膜)，但是这里将简要讨论该出版物。一方面，使用通过向海胆腹腔内注射浓度极高的0.5M KCl溶液而获得的海胆卵。结果，卵的极化状态已经受到很大的影响，并且卵浆中的天然钾含量明显改变。此外，所有海胆卵在处理前都与水接触并形成凝胶层，随后必须对其进行机械去除。这也从根本上改变了脱细胞卵膜的形态和生理特性。海胆卵不能用于本发明，不仅因为它们的结构根本不同，而且因为在收获过程中用氯化钾进行了大量的代谢干预。此外，无钙海水并未去离子化，它包含：每升含有超过10克钠、0.43克钾、1.3克镁和20克氯以及其他。因此，在无钙水中漂洗卵并不等同于在不损害成熟活卵的盐溶液中漂洗卵。

鱼和甲壳类动物的卵膜结构遵循基本模式，并且根据Siddique et al.:"Areview of the structure ofsturgeon egg membranes and ofthe associatedterminology",(J.Appl.Ichthyol.(2014),1–10)中的技术对该方法进行了描述。以下是有关如何建立概念一致性的简要说明。

在动物卵巢中成熟的卵(卵母细胞、卵细胞)中，卵泡由颗粒细胞(也称为卵泡细胞、卵泡膜、卵泡上皮)和鞘细胞(也称为内膜和外膜)组成，将卵环绕以向其提供信号物质和营养。在颗粒细胞和鞘细胞之间还有基底层(在科学上也称为滤泡膜、膜、基底层)。卵浆(卵母细胞浆、鞘膜、细胞质、内卵)被卵膜(卵母细胞膜、质膜PM、卵细胞膜)所包围。在排卵过程中，卵从卵泡细胞中取出并释放到鱼的腹腔中。排卵的卵仅保留其非细胞卵膜(在科学上也称为细胞外基质或细胞外膜)，该膜是在卵成熟过程中形成的，其结构由外而内由以下组成：

·肺泡层AL(在科学上也称为凝胶层、黏附层、凝胶壳、(第二外)凝胶壳、第3层、绒毛膜(2))，最外层的非细胞卵膜

·外放射带ZRE(科学上也称为外卵黄质鞘(放射带＝卵黄质鞘)、外卵黄质区、外卵黄质膜、第2层、绒毛膜层2、外透明带、外放射带、卵黄鞘的外层、鞘层1B，第二鞘层)、卵黄质鞘的外部，直接位于肺泡层之下

·外延层EP(科学上也称为外延层1，第4层，第1膜的外层)，将ZRE与ZRA分离，并非所有类型的卵中都存在

·内放射带ZRI(科学上也称为内卵黄质鞘、内卵黄质区、内卵黄质膜、绒毛膜层1、内透明带、内放射带、鞘层1A、第一鞘的内层)，卵黄膜的内部，其与ZRA紧密相连

·卵黄周间隙(科学上也称为卵母细胞外基质，与卵浆微绒毛突起之间的间隙)，ZRI和卵膜之间的狭窄空间，卵浆中插入了许多微绒毛(MV)。

活排卵的卵子细胞可通过位于其质膜上的离子通道进行电激发。此外，质膜的电学性质的变化是卵活化的先决条件，并且对卵膜有影响。对海洋无脊椎动物的开创性研究表明，钾离子通过卵膜的离子流会导致整个膜上电位的暂时变化(受精电位FP)。该电位是通过激活瞬态电压依赖性的向内电流进入卵的内部而产生的。膜电位(RP)的去极化显示是由于离子流过卵膜(离子电流(受精电流FC))引起的。该电流流经非特异性和高导电性离子通道的开口，这些通道可以通过精子或人工化学或机械效应激活。迄今为止，不同离子通道和相关离子的作用的假设模型显示出物种特异性的差异。

相比E.Tosti et al:"Electrical events during gamete maturation andfertilization in animals and humans"(2004Human Reproduction Update,vol.10,no.pp 53-65)，在卵细胞中，钾在自然界中起着核心作用。钾K

技术问题

基于根据WO 2007/045233 A1的本发明最接近的现有技术，该现有技术也用于生产鱼子酱和类鱼子酱产品，本发明的问题在于，在鱼或甲壳类动物的活的、未受精的、成熟的卵的基础上以这样的方式进一步开发其中描述的方法：可以改进成熟卵在质地、味道、运输、储存和深度冷冻方面的感官特性。然而，由此本发明也要求保护的通过该方法或其他方法可生产的鱼子酱或类鱼子酱产品也将保持上述优点。这项任务的解决方案从主要的权利要求中获得。本发明的有利的进一步实施例显示在从属权利要求和产品权利要求中，并且下面结合本发明对其进行更详细的说明。

根据本发明的要求保护的基于鱼或甲壳动物的成熟活卵的鱼子酱或类鱼子酱产品的生产方法的特征在于，在钾暴露步骤中，钾溶解在水中作为水中的阳离子成分，其浓度不损害成熟活卵且不改变其天然钾含量，在添加钾供体以形成阳离子成分之前将水去离子化，并且水处于对成熟活卵无害的温度下，在溶液中处理该成熟卵钾暴露时间，直到达到所需的卵壳弹性稳定性。

在本发明要求保护的方法中，使用成熟活卵，这些卵可以在不损害鱼或甲壳类动物的情况下自然获得。成熟活卵可受精，但未受精。通过事先用盐溶液冲洗除去卵巢液，该盐溶液不会伤害成熟活卵，因此在外壳上不会形成粘性凝胶层。此外，这些卵还具有天然的、未经人工改变的钾含量。仅使用细胞生理有效浓度的钾离子。活卵在鱼和甲壳类动物的卵壳中有超过两层，即三层或三层以上，是电激活的。起始产品是具有完整功能代谢的鲜活成熟可受精但未受精的卵，因此即使是最低浓度的钾离子，不会造成损害且在卵中不留任何痕迹的材料，也会触发通过卵膜的运输过程以及卵浆中的代谢过程。以这种方式生产的鱼子酱或类鱼子酱产品具有新的质地，其通过卵膜中新的透明无细胞层(弹性稳定层)具有有利的稳定弹性，该层在室温下变得较软而不限制鱼子酱的稳定性。所需的弹性稳定度可以通过自检(卵的弹性度)轻松确定。味道鲜辣爽口，没有“腥味”。即使不添加防腐剂例如已被许多国家禁止的硼砂，所用卵的纯度也能在在-2℃至-4℃的标准温度下具有较长的保存期限(9至12个月)。用这种方法处理过的卵也可以先冷冻，而不会降低质量，从而在储存和运输方面带来巨大的优势，请参见下文。

根据本发明，通过使成熟活卵以生理学的，即非破坏性的浓度与钾阳离子(K

卵活化包括并通过了整个系列的细胞-生物学级联反应。在WO 2007/045233 A1中使用的具有皮层反应的“第二(慢)反应”(慢阻断)之后是钙依赖性酶活化，通过在内放射带和外放射带的不可逆酪氨酸连接的蛋白链，用于卵膜的扩増和最终大规模结构。在自然界中，这为胚胎发育准备了第一次细胞分裂。相反，在本发明的某些实施方式中使用的具有随后的去极化/超极化的“第一(快速)反应”(快速阻断、电阻断、快速电阻断)及其取决于动物种类的不同持续时间的稳定化处于所有细胞生物-级联反应的开始。这两个过程因所使用的物质不同而显著不同，即A)钾离子，用于快速电阻断卵膜的去极化作用，从而触发卵激活和在卵膜中形成单一、另外一个新的区域(形成弹性结构层)和B)钙离子，在现有的卵膜层用于缓慢机械阻塞与酶控制的形态转化(形成结构稳定层)。

第一个电事件是在几毫秒内迅速去极化甚至发生超极化，目的是防止自然受精后进一步的精子粘附到卵子上。在接下来的60分钟内(对于某些水生动物，例如龙虾，甚至长达5小时)，快速的超极化与稳定的超极化脱离。尽管残留在卵子附近的精子在快速电阻断后仍然可以附着并保留在卵膜的卵黄膜(软膜)中，但是它不能穿透卵的质膜进行实际的受精，因为可以在软体动物上显示。如果按照本发明的某些方法实施方式继续进行钾离子暴露，则在活的、可受精的、但未受精的和成熟的卵子中观察到一个全新的、透明的(透明、玻璃状、凝胶状)区域(弹性稳定层)形成，至今尚无文献报道，它是GAG阳性的(糖胺聚糖的发生率增加)和嗜酸性粒细胞的(可用红色酸性诊断染料伊红染色)，可用于细胞器、血浆蛋白、结缔组织及其前体的可视化，并且精子会卡在其中。这种弹性稳定层的形成首先在持续10秒甚至更长时间的超极化过程中发生在卵膜上的部分区域，并在完成后位于卵中外放射带和肺泡层之间，活卵具有结构设计类似于鱼类和结甲壳类动物(卵膜中至少有两层)。形成新的弹性稳定层的原因是根据本发明的通过生理浓度的钾离子供应卵膜的连续去极化。

根据欧盟成员国关于食品补充剂的立法，只在其中列出了钾化合物，例如碳酸氢钾(碳酸氢钾，KHCO3)(CAS号298-14-6)、碳酸钾(K2CO3)(CAS号584-08-7)、柠檬酸钾(CAS号6100-05-6)、氢氧化钾(KOH)(CAS号1310-58-3)、氯化钾(KCl)(CAS号7447-40-7)、K、碘化钾(KI)(CAS号7681-11-0)、碘酸钾(KIO3)(CAS号7758-05-6)，可用于营养目的。类似地，2003年11月10日颁布的欧洲议会和理事会法规提案(COM(2003)671final)允许将这些化合物添加到食品中。某些钾化合物，例如柠檬酸钾(E 332)、乳酸钾(E 326)、正磷酸钾(E 340)，也可以出于技术目的添加到食品中。根据本发明的方法，所述方法用与细胞相容的浓度(生理浓度，即对卵无害)且不形成残留物的钾离子处理鱼或甲壳类动物的成熟活卵，允许生产鱼子酱或类鱼子酱产品，以满足主管部门、分销商和客户的所有国家和国际质量要求。在阿尔弗雷德韦格纳研究所(Alfred Wegener Institute)，利用光发射光谱法(OES)对卵细胞质中的细胞内离子浓度进行了研究，在该研究中，钾被用作使卵外膜连续去极化的新物质，即使处理的浓度和时间不同，经过处理后卵浆中的浓度没有变化。因此，在根据本发明的某些方法实施方式中使用的钾离子清楚地用作加工助剂。加工助剂用于食品的工业加工和生产中。加工助剂是食品添加剂，添加这些加工助剂式为了例如切割和过滤之类的技术过程。然而，在最终产品中，加工助剂必须完全不存在或仅存在于不可避免的(少量)残留物中。与必须在包装上声明的改变的食品添加剂相反，加工助剂必须不再对最终产品产生任何影响，这是特别有利的。它们的使用必须在技术上不可避免，技术上无效，对健康无害，无臭无味。由于这些物质在处理过的食品中不再存在或没有活性，因此不必标明其用途。这也适用于残留物、反应产物或残留含量。

优选和有利的是至少一种钾盐，优选柠檬酸的盐(柠檬酸钾E332)和/或盐酸的盐(氯化钾E508)和/或山梨酸的盐(山梨酸钾E202)，溶解在水中作为钾供体，用于形成阳离子组分。钾供体是指含有钾的化合物，其在水中溶解后会提供钾离子，其浓度取决于水中特定钾化合物的浓度及其结构式。所提及的钾盐甚至全部被批准为具有E值的食品添加剂，尽管在本发明的某些实施方式中它们仅用作加工助剂，其不再存在于最终产品中，并且无需声明。在具有预先去离子水的溶液中钾离子的有利且优选的浓度为0.1mmol/l至3.0mmol/l，优选0.1mmol/l、0.5mmol/l、0.65mmol/l、1.6mmol/l或2.0mmol/l，特别根据实施方式优选1.0mmol/l或1.5mmol/l。所有边界值和中间值(整数和非整数)也应始终包含在本发明范围内的所有范围(以及其他参数)。为了产生水中提到的钾离子浓度，必须将其去离子。但是，由于水分子也在水中不断分解，因此可以理解，通过技术手段只能达到一定程度的去离子化(25℃下水中的电导率在1μS到15μS之间，作为可以实现去离子化的测量标准)。

此外，钾暴露步骤中的钾暴露时间优选且有利地为5分钟至30分钟，优选为10分钟、12分钟、15分钟、20分钟或25分钟。此范围内的其他钾暴露时间也很容易选择。在处理成熟龙虾卵(甲壳类动物)时，甚至可能会出现长达50分钟或更长时间的暴露时间。处理开始后几秒钟(最长10s)就开始形成新的弹性稳定层，该层密封卵膜。但是，由于卵并不能同时与连续去极化反应并在卵膜表面的部分区域形成稳定层，因此建议将处理时间延长至10分钟以在所有处理过的卵中实现连续去极化。随着处理时间的増加，它迁移并定位在卵周围整个卵膜中的外放射带和肺泡层之间。结果，成熟活卵通过本发明以这样的方式弹性地稳定化，使得它们可以被盐腌、重新包装和深度冷冻而没有问题。

作为进一步的可选改进，根据本发明的方法的某些实施方式还提供了钙暴露步骤，其可以在钾暴露步骤之后或之前进行。卵膜的各自变化在其描述的特征上在两个过程中彼此独立地发生。在钙暴露步骤中，钙优选且有利地以不破坏成熟活卵的浓度(即生理学浓度)溶解于含有水的另一种溶液中作为阳离子组分，其中在添加钙供体之前将水去离子化。在钙暴露步骤中处理成熟活卵，直到达到所需的卵膜结构稳定为止。所需的结构稳定程度可以通过自我测试(卵的扑通效应程度)轻松确定。在钙暴露步骤中，至少一种钙盐，优选柠檬酸钙、氯化钙和/或山梨酸钙有利地并且优选用作钙供体(钙供应体，定义参见钾供体)。钙盐在欧洲联盟中被授权为食品添加剂，其编号为E333和E509，无数量限制，编号为E203，无数量限制。在德语中，选择拼写形式“Kalium(钾)”和“钙(Calcium)”(而不是Kalzium)，以便更好地区别使用两种离子类型。

钙已经在生理上存在于卵细胞中，并且是细胞代谢中必不可少的成分。从WO2007/045233 A1中知道，氯化钙用于通过掺入酪氨酸分子不可逆地交联蛋白质而在结构上増强卵膜。除了通过本发明基本上实现了卵膜的改善的和可调节的弹性以外，它还可以通过钙暴露步骤在结构上机械地固化。因此，对于某些鱼子酱类型和鱼子酱替代品，可以实现最佳的、稳定的组合。这对于非常大的不稳定卵(直径大于3.2毫米，例如来自白鲸或白鲟的卵)或成熟时特别柔软的卵(最大力小于或等于0.3N，直到它们在硬度测试中爆裂，例如来自小体鲟的卵)是特别有利的。这两个处理步骤的应用可为有问题(大小、柔软度)的卵提供高质量的鱼子酱或类鱼子酱产品。

另一种溶液中钙离子的浓度有利地在0.1mmol/l至3.0mmol/l之间，优选为0.1mmol/l、0.5mmol/l、0.8mmol/l、1.0mmol/l、1.5mmol/l、1.6mmol/l、或2.0mmol/l。钙暴露时间优选在9分钟至30分钟之间，优选10分钟、12.5分钟、15分钟、16分钟、20分钟或25分钟。选择处理时间时应考虑到以下事实：卵膜的强度会随着钙暴露时间的増加而稳定性増加，直至达到极限值。在自然界中，鱼的受精卵大约经过60分钟后就会形成坚硬的卵膜，不再适合食用。龙虾最多可能需要24个小时。

在根据本发明的方法的某些实施方式中，重要的工艺参数是处理成熟卵的溶液的温度。据说这是生理性的，这意味着它不会阻碍活卵中的自然过程。在某些实施方式中，溶液的温度总是在鱼或甲壳类动物的自然产卵温度范围内。这确保了在钾暴露步骤中引起的卵膜电激活能可靠地进行，并且在静止电位开始去极化。在非自然的产卵温度下，例如鱼类或甲壳类动物在高于15℃的极性地区中，卵的电激活不会发生，并且成熟活卵不能被电或酶稳定。它们变得闭锁。来自混合区和热带区的鱼或甲壳类动物的卵也是如此。基本规律是，在高于35℃的温度下，溶液的变性会导致卵品质严重下降。

为了使溶液的温度适应自然栖息地，本发明将在自然繁殖期间可以使用其卵的鱼和甲壳类动物的生活区大致分为三个气候区：极地区(在两极)、温带(在两极和热带之间)、热带(赤道周围)。本发明优选并且有利地利用以下事实：一种溶液(钾暴露)和/或另一种溶液(钙暴露)的温度选自1℃至15℃之间的极性温度范围，优选5℃至12℃之间，特别优选10℃，10℃至20℃之间的中等温度范围，优选15℃，特别优选12℃，或20℃至29℃之间的热带温度范围，优选27℃，特别优选21℃。本发明优选避免温度导致卵的改变-变性、细胞死亡，例如通过加热至高于40℃的温度进行巴氏灭菌的情况。本发明优选地在过程中的任何时候都避免这种情况。

由于在根据本发明的方法的某些实施方式中使用的阳离子浓度触发电性(钾暴露)和代谢性(钙暴露)的动物特异性生理反应，并因此影响加工过程，从而产生稳定的可食用终产物，假定溶液中存在去离子水，以达到电(钾)或代谢(钙)活性阳离子(带正电)的精确浓度。因此，如果25℃的去离子水的电导率在1μS/cm到15μS/cm之间，优选为10μS/cm或更小，特别优选为1μS/cm，则在技术上是可实现的并且因此是优选的和有利的。取决于地区来源的饮用水和井水由不同离子的组成成分差异很大，在某些情况下甚至可能对细胞代谢产生拮抗作用。当温度为25℃时，例如，纯水的电导率为0.055μS/cm，去离子水1μS/cm，雨水50μS/cm或饮用水500μS/cm。为了能够获得可再现的结果，了解去离子水的电导率是重要的。

由于以可活化的成熟卵母细胞形式的活细胞用本发明方法的某些实施方式处理，除此之外，尤其重要的是，使溶液适应细胞的代谢，从而在该方法中诱导代谢过程也可以发生。因此有利和优选的是，一种和/或另一种溶液具有在6.8至8.0之间，优选在7.0至7.9之间，特别优选在7.2或7.4或7.5的pH(生理的，对生物无害)。特别地，溶液中调节的pH与钙暴露步骤中缓慢的代谢反应有关。由于细胞中的酶促过程受pH高度调节，因此还检测了钾暴露步骤(电过程)中的细胞内pH。然而，用不同浓度和持续时间的各种钾基物质处理过的卵的卵浆中的pH值在最佳pH值7到8之间基本上保持不变，并且在个体鱼和甲壳类动物的情况下显示了预期的个体差异。

在本发明的实施方式中，不同的暴露步骤用于稳定成熟活卵的内源卵膜(在结构上弹性地并且任选地)。因此，鱼子酱或类鱼子酱产品已经准备好用于进一步加工，例如腌制和包装。在排卵过程中，将鲜活成熟的排卵的卵子从卵泡细胞中排出，这样就不会再有血管或卵泡细胞残留的组织残留物附着在细菌或真菌上。因此，收获的排卵的卵子具有良好的纯度，因此是长保质期的最佳条件。如果在进行防腐和增香的最后一个暴露步骤之后，以相对于的鱼子酱或类鱼子酱产品含量的2.0％至3.8％，优选3.5％的氯化钠进行了温和的盐化，则可以可靠地确保这一点。氯化钠应优选不含钾和钙供体，例如滴入助剂中所含的，因为这可以防止由于盐分引起的卵膜不受控制的变化。鲟鱼卵的鱼子酱是用简单的普通盐(氯化钠NaCl)干盐腌制的，当将其他鱼类的鱼卵加工成类鱼子酱产品(例如鲑鱼和鳟鱼鱼子酱)时，通常会进行湿盐腌。可以选择使用本发明的在指定区域内进行盐腌是非常轻巧的盐腌过程，也可以称为“马洛索(malossol)”，这是高质量的明显标志。对本发明要求保护的鱼子酱或类鱼子酱产品巴氏灭菌或加热到60℃和以上的温度优选完全降低，因为这是不必要的，并且只会危害产品的质量及其感官特性。由于马洛索盐腌，使用上述方法生产的鱼子酱或类鱼子酱产品如果在-2℃下储存，则至少具有至少9至12个月的最低保质期。在加工过程中，由于轻的盐含量，它不会冻结。

根据进一步的变型，将鱼子酱或类鱼子酱产品在密封玻璃容器中存储几个月，优选一至三个月，则可以从本发明的某些实施方式中进一步改善所生产的鱼子酱或类鱼子酱产品的质量，优选并有利地在防腐和增强风味之后进行。鱼子酱通过储存“成熟”，并且取决于成熟程度，味道强度会增加。然而，这种成熟是从口味(例如奶酪)的进一步发展的意义上来看的，而与本发明中使用的成熟卵的“成熟度”在生物学发展意义上没有关系。这里，成熟是指受精的可能性，因此是指活卵的发育状态。当鱼子酱相对于口味成熟时，它被存储在玻璃容器中，这为鱼子酱的成熟提供了足够空间，因为它没有被压制(如包装在金属卡扣式盖罐中)，因此保留了其口味浓郁的油。因此，根据本发明某些实施方式包装在玻璃中的鱼子酱不应与也经常包装在玻璃中的巴氏灭菌的鱼子酱混淆。此外，将其存储在环保的玻璃容器中可避免通常包装在金属容器中的鱼子酱经常被批评的金属味。

根据该方法的另一个变型，优选且有利的是在-20℃至-15℃的温度范围内，优选在-18℃下冷冻鱼子酱或类鱼子酱产品，然后保存并增强风味或风味的储存和成熟。理想的情况是，鱼子酱的口味适合人类食用，并达到各自客户的期望的成熟程度，并且可以在生产后14天或成熟后最多3-4个月新鲜冷冻。将鱼子酱在重新包装之前或在重新包装之后的冷冻在500g玻璃容器中，以便最终客户将其放在30g、50g、125g、250g或500g(可能高达1000g)的玻璃容器中，然后将其抽真空。在常规屠宰中获得的鱼子酱不能冷冻。尽管经过巴氏杀菌或加热的鱼子酱可以冷冻，但由于热处理，会导致极高的质量损失。根据本发明的冷冻鱼子酱或类鱼子酱产品的可能性使得能够实现满足方便食品当前需求的最佳鱼子酱销售。由于特定的运输和存储温度为-2℃至-4℃，因此到目前为止，营销已达到其极限，必须严格遵守这些温度，因为大多数供应商无法维持这些温度。因此，将常规获得的鱼子酱用诸如硼砂之类的有害防腐剂进行处理或巴氏灭菌，以便将其保存至少12个月或更长时间。但是，用本发明的实施方式生产的鱼子酱可以简单地冷冻，因此可以保存并保持新鲜更长的时间。实验表明，鱼子酱在+4℃至+7℃的冰箱中缓慢解冻不会失去味道或质地。

在本发明的某些实施方式中，将卵在溶液浴(水溶液、含水的溶液)中处理。将卵添加并将留在溶液浴中，直到达到所需的稳定度(弹性的，可能是结构性的)，这取决于所用卵的类型。然后将卵从浴中取出即可。为了可靠地防止在通过在仍然粘附的溶液中的阳离子去除后的不希望的进一步稳定化，在本发明的某些实施方式中，根据该方法的下一个变型，如果在达到所需的弹性(和可选的结构)稳定性后，将从成熟卵中各自引入的阳离子去除，将成熟活卵浸入(短暂地浸泡)在不损害它们的盐溶液(生理盐溶液)中，则是优选和有利的。这会冲洗掉阳离子，并立即破坏它们引起的稳定过程。迄今所获得的卵膜的(期望的)稳定度被可靠地保存为最终状态。

在本发明的某些实施方式中使用的成熟活卵是可受精的，但不能受精。它们通常不被水润湿，并且在卵浆中具有天然的钾含量。这样的活卵可以从性腺中释放到鱼的腹腔中，并通过生殖器开口从那里收获。例如，可以通过自然产卵、剥离(从外部按摩腹腔)或使用导管将卵从腹腔中排出或吸出来完成。从性腺释放到腹腔的卵被称为排卵的卵子(成熟度为5)，仍然被粘液状的排卵液包围。为了避免卵与水接触后形成粘附层，在开始处理之前，用生理盐水溶液冲洗排卵液。排卵的卵子可以从活的动物中获得，这是特别可持续的。然而，成熟水平为3或4的成熟活卵也可以用于本发明，其取自死动物的性腺中，然后分离。I.G.Katsiadaki et.al.:"Assessment ofquality ofcodroes and relationshipbetween quality and maturity stage"(J.Sci Food Agric 79:1249-1259(1999))，尤其是在表1中，对鳕鱼的不同成熟水平进行了很好的概述。在所谓的“极化指数”的帮助下，成熟度的数值定义是可能的。这是根据细胞核与细胞膜之间的距离与动物与营养极之间的冰直径(大半轴)之比计算得出的。因此，根据本发明的下一个实施方式，优选和有利的是用0.05≤PI≤0.15，优选0.05≤PI≤0.12的极化指数PI处理鱼或甲壳类的成熟的活卵。具有该PI的卵特别适合于收获以进行根据本发明的处理。有关卵的极化指数PI的更多信息，例如，可在鲟鱼育种指南中找到(出版物FAO Ankara 2011Fisheries and AquacultureTechnical Paper 570"Sturgeon Hatchery Practises and Management for Release-Guidelines)。

本发明要求保护的方法可用于处理鱼和甲壳类动物(学名Crustacea)的成熟活卵，其卵具有本发明所需的基本结构(在卵膜中超过两层)并且适合于以鱼子酱或类鱼子酱产品形式食用。优选的和有利的是，处理来自野生或水产养殖中捕获的鱼或甲壳类动物的成熟活卵，所述卵通过产卵或剥离以排卵状态收获，例如导管插入法，排卵并获得。这样，例如，还可以收获打算从野外进行补养的动物，例如来自补养项目的动物。鱼子酱和类鱼子酱产品的销售收益然后可以退还给储存措施。在本发明的某些实施方式中，如果处理最近的和天然的活骨鱼优选活的鲟鱼的成熟活卵，则是特别优选和有利的。然后，本发明的实施方式可以用于生产最高质量的(纯正的)鱼子酱。根据本发明的方法的实施方式，来自龙虾或其他甲壳类例如小龙虾的其他类鱼子酱产品也可以生产最高质量。此外，由于本发明方法的实施方式也可以任选地包括两个暴露步骤，使卵膜具有弹性(电刺激)和结构(酶促)稳定化，所以可以优选和有利地处理非常大(直径大于3.2mm)或柔软、不稳定的卵(硬度测试中的硬度低于0.3N，高于该数值卵会破裂)。

最后，本发明的实施方式还包括与鱼或甲壳动物的成熟活卵不同产品，其可以用本发明要求保护的方法生产，也可以用其他方法生产。该产品的特征在于，在卵膜中还另外形成了具有嗜酸性的透明层形式的弹性稳定层，其中掺入了糖胺聚糖。然而，在这种情况下，活卵未受精，这就是为什么自然界中不会出现弹性稳定层的原因。在本发明的某些实施方式中，弹性稳定层位于内放射带和肺泡层之间，优选介于放射外带和肺泡层之间。因此，只有在具有超过两层卵膜结构的活卵的情况下，它才可能发生。例如，海胆仅在卵膜内显示两层。新的稳定层是透明的、凝胶状和弹性的，可以在组织学上用伊红染成红色，并用阿尔辛染成蓝色。在使用本发明的某些实施方式的生产过程中，其特性受钾暴露步骤中所用钾阳离子浓度的影响，并且其位置受钾暴露时间的影响。

为了除去卵巢液，在处理之前，用不损害卵的盐溶液处理成熟活卵。优选并且有利地，这是生理盐水溶液。此外，有利和优选的是，盐溶液形成为0.6％至1.0％的盐溶液，特别优选为0.9％的盐溶液。例如，要制备0.9％的盐水溶液，每使用1升水，要溶解9g氯化钠(NaCl)。该浓度对应于人类有机体中的天然发生，因此被称为“生理”盐溶液。

本发明的某些实施方式还涉及水生动物未受精的成熟卵的鱼子酱或类鱼子酱产品，其特征在于，通过掺入的酪氨酸分子在卵膜中额外形成不可逆的交联。这种额外的不可逆交联位于鱼或甲壳类的活卵的内放射带和外放射带之间。不可逆的交联导致卵膜的额外结构的稳定。结合现有的弹性稳定层，它也可以用于处理特别大的或软的卵。可以根据本发明的实施方式制备鱼子酱或鱼子酱状产品，其中卵膜中的结构稳定度然后取决于钙暴露步骤中的钙暴露时间和钙阳离子浓度。在卵膜中具有相同性质的不可逆蛋白质交联的鱼子酱或类鱼子酱产品的其他制备方法也适用。本发明的方法和产品的其他实施方式可以在与示例性实施方式有关的以下特定描述部分中找到，但是绝不将本发明的范围限制于这样的示例性实施方式。

实施例

在下文中，通过实施例和附图进一步解释根据本发明的由水生动物的成熟活卵生产鱼子酱或类鱼子酱产品的方法及其产品以及有利变型，用于进一步理解本发明。从而显示了

图1A、B、C用于比较获得的处于未成熟状态和处于成熟状态的活卵的SEM图像(现有技术)，

图2处理西伯利亚鲟鱼的成熟活卵的过程中卵膜厚度的测量值的初始表格，

图3处理白鲸鲟鱼的成熟活卵的过程中卵膜厚度的测量值的第二表格，

图4A、B、C、D比较用钾和钙阳离子的双重处理、单独使用钙阳离子和用钾离子处理，鲟鱼的鲜活成熟卵经过不同处理的形成稳定层的处理系列的SEM图像，

图5A、B、C、D具有在内放射带(ZRE)和肺泡层(AL)之间形成新的稳定层(SS)的卵膜的层结构的TEM图像，

图6A、B、C、D未处理的和不同处理(仅经钾离子处理，经钾和钙阳离子双重处理，仅经钙阳离子处理)的鲟鱼成熟卵的皮质颗粒的TEM图像，

图7A、B、C、D来自西伯利亚鲟鱼的未处理的成熟活卵和来自西伯利亚鲟鱼的用钾离子处理过的成熟卵的光学显微镜图像，

图8A、B、C、D来自西伯利亚鲟鱼的用钙离子处理过的成熟活卵和用钾离子和钙阳离子处理过的成熟活卵的光学显微镜图像，以及

图9A、B用钾和钙阳离子处理成熟活卵后的白鲸鲟鱼卵膜结构的SEM和光学显微图像。

从对鲟鱼的体重和/或年龄与鱼子酱籽粒的大小或收获的鱼子酱的数量之间的关系的研究中可以知道，卵的直径和鱼子酱的质量会随着鲟鱼的体重和/或年龄而增加。此外，随着鲟鱼体重和年龄的增加，鱼子酱的收获量也随之增加，因此其经济效益也得到了提高。根据种类的不同，自然环境中的鲟鱼在12至26岁之前不会在性成熟。大多数鲟鱼度过生长发育期，直到它们在海中或河口首次繁殖，然后迁移到河流中以在淡水的石质地面上找到它们的产卵场。而且，在水产养殖中，鲟鱼需要大约5至16年的时间，具体取决于鲟鱼的种类，才能达到第一次性成熟并因此达到第一次鱼子酱收获。在水产养殖中，多年重复从活体雌鱼中捕捞鱼子酱的前提是，对动物的饲养要以最佳的饲喂和较低的放养密度为前提，并且由于其性成熟晚和寿命长，在经济和生态上总是合情合理的。从脱皮卵的收获和处理到鱼子酱的协调工作流程中，很容易就能生产出具有经济意义的吨级鱼子酱。根据鱼的年龄和与之相关的鱼子酱的数量，适当的放大措施可以使日产量达到80kg或更多。

本发明的一些实施方式使用预先用生理盐水溶液清洗过的成熟活卵。这些是排卵的卵子，由于它们的成熟阶段(排卵准备和受精阶段)，先前已被卵泡细胞的细肌纤维从性腺中挤出，这个过程被称为排卵。排卵的卵子被释放到鱼的输卵管和腹腔中，而没有细胞残留和其他残留。然后可以通过按摩腹部去除它们，而不会影响鱼的寿命。卵的表面完全清洁，不允许有任何细菌或真菌侵染的生态位或褶皱，从而延长了鱼子酱或类鱼子酱产品的保质期。不必使用诸如硼砂之类对人体健康有害的保护方法。图1A、B、C示出了活卵和排卵过程的现有技术扫描电子显微镜(SEM)图像。图1A显示了具有卵泡细胞的未成熟卵母细胞，例如在被杀死的鲟鱼的常规鱼子酱中发现的卵泡细胞。图1B显示了成熟卵细胞从周围卵泡细胞的原位排卵和释放。然后，图1C显示了鲜活成熟的鲟鱼卵，该卵显然完全光滑且干净。

在排卵后的成熟活卵的示例性实施方式中，下面通过一些可选的附加步骤更详细地解释根据本发明的实施方式的可能的方法工作流程：

·溶解胚泡后，在成熟阶段V将活体雌性鱼从活卵中剥离，

·将被剥离的活卵和卵巢液立即运输到鱼子酱实验室(在很大程度上避免了等待时间，不可避免的等待时间在冰上并在排除氧气的情况下通过用不透气的塑料膜覆盖卵巢液)，

·立即在0.9％的生理盐水中彻底冲洗活卵，直到完全清除卵巢液为止。

·执行钾暴露步骤：

·用在电导率为10μS/cm(在25℃)且极性温度范围为10℃的去离子水中的柠檬酸钾制备0.1至2毫摩尔的钾阳离子溶液，

·将成熟活卵引入该溶液中，钾暴露时间为10分钟，

·从该溶液中取出处理过的卵；和

·将经过上述处理的卵短暂浸入0.9％的生理盐水溶液中。

成熟卵的其他提取方法也是可能的。即使使用取自先前杀死的动物的成熟活卵，也必须冲洗掉血液和脂肪，或者甚至必须将卵从性腺中擦出，这可以通过使用优选的生理盐水溶液进行预处理来实现。通过浸渍，可以额外地控制稳定层的弹性和直径(也就是说，除了选择暴露时间的持续时间以外)。由于引入的钾离子的电影响，所描述的处理影响在卵膜外放射带和肺泡层之间的透明的弹性稳定层的形成。在正常状况和柔软度的卵中，用钾暴露步骤进行处理就足够了。但是，如果使用某些鲟鱼例如达氏鳇、高首鲟或小体鲟的特别大、柔软或敏感的卵，则也可以连接钙暴露步骤(或放在前面)：

·额外执行钙暴露步骤：

·用在电导率为10μS/cm(在25℃)且极性温度范围为10℃的去离子水中的氯化钙制备另一种0.5至2毫摩尔的钙阳离子溶液，

·将成熟活卵引入该溶液中，钾暴露时间为10分钟，

·从该溶液中取出处理过的卵；和

·将经过上述处理的卵短暂浸入0.9％的生理盐水溶液中。

除了来自钾暴露步骤的弹性稳定层之外，这还形成位于鱼和甲壳类动物中的卵膜的结构蛋白质交联，其已经存在于卵膜的内放射带和外放射带。通过酪氨酸残基的卵膜的这种额外的结构蛋白质交联还特别赋予了大而软或敏感的卵以塑性-除了来自钾暴露步骤的弹性外。此处还可以使用可选的浸渍功能，以实现额外的可控性。所得产品是来自成熟活卵的(正版)鱼子酱，然后可以按以下步骤进行进一步处理：

·将鱼子酱与干燥的(不含K

·在玻璃容器优选500g熟化玻璃中填充淡盐味的鱼子酱，并用螺帽和拉带将容器密封真空密封，

·将玻璃容器在-2℃的温度下存放2到4个月，以使鱼子酱进一步成熟和任选地

·根据客户要求，将新鲜鱼子酱或成熟的鱼子酱冷冻在-18℃的玻璃容器中。

由于处理，经过钾暴露步骤处理的成熟活卵形成了一个全新的区域：稳定层SS，它是有弹性的和透明的(凝胶状)。稳定层SS可以容易地着色以用于检测。它位于肺泡层AL和外放射带ZRE之间，迄今尚未在文献中进行描述。有关鱼类和甲壳类动物卵的结构设计，请参考带有相应Siddique词汇表的描述性介绍。

图2中的表格是基于西伯利亚鲟鱼成熟卵上的细胞外卵膜直径(以μm为单位)进行测量的，其使用计算机控制的图像分析(蔡司)，基于在不同处理方法的影响下恒定层厚度(10μm)的冷冻切片以稳定卵膜。该表显示了新的稳定层SS的形成以及卵膜中现有层(ZRI、ZRE、AL)的直径，这些膜分别在以根据本发明在各种暴露步骤中的以mmol/l的钾阳离子K

处理后的质量控制表明，仅在1mmo/l和1.5mmol/l钾阳离子的浓度下，卵膜的厚度才能达到至少12μm，并且形成了中间产物，该中间产物已经失去粘性并且足够稳定用于鱼子酱的进一步加工。此外，表明优选持续10分钟的处理时间是合理的，以使溶液中的所有活卵都发生代谢反应。在处理单元中可以达到2.5千克鱼子酱的处理量(约25升溶液)。根据本发明的用钾离子处理后的鱼子酱的感官测试显示，西伯利亚鲟鱼的鱼子酱的弹性质地在1mmol/l和1.5mmol/l的浓度变化之间没有显示出任何差异。另一方面，用一种钾离子浓度较低的溶液处理过的卵的质地不同，只有少数卵是稳定的，而未经处理的卵非常柔软且易碎。根据进行的感官测试，用两个暴露步骤(钾和钙阳离子)进行处理会产生固态的珍珠状产品，在西伯利亚鲟鱼卵的情况下也称为“超级扑通”。

图3中的表显示了来自白鲸鲟鱼达氏鳇的鲜活大卵的根据本发明的不同处理的细胞外卵膜层的存在和直径(以μm计)。在用钾阳离子(来自柠檬酸钾)处理鱼子酱的过程中，还观察到在细胞外卵膜中新的嗜酸性稳定层SS的形成，该膜也位于ZRE和AL之间。在白鲸鲟鱼的大卵上进行的感官测试表明，用钾和钙离子进行双重处理可以使脆弱的成熟活卵的质地达到最佳效果。

图4A、B、C、D示出了成熟活卵的细胞外卵膜结构变化的SEM图像，例如在各种处理下的西伯利亚鲟鱼。显示了两个放大倍率：左6000x和右(切口)12000x。始终对活卵进行处理，将其在-80℃的己烷中瞬间冷冻，以产生保持其天然状态的组织冷冻切片。

图4A在未处理的成熟卵中，卵膜的区域彼此之间没有清楚的分离(现有技术)。

图4B在0.5mmol/l钾的影响下，在外放射带ZRE和肺泡层AL之间已经形成了新的稳定层SS，而内放射带ZRI和外放射带ZRE则显示出不变的疏松蛋白结构如未处理的卵中。

图4C用钾和钙阳离子对卵进行的连续两次处理在SEM中显示了特征性的形态特征，即通过钾处理形成的稳定层SS以及内放射带ZRI和外放射带ZRE中蛋白链的扭曲和交联，其对于钙处理是特征性的，相比于图4D。

图4D单独的钙处理导致内放射带ZRI和外放射带ZRE中疏松蛋白链的扭曲和交联(现有技术)，相比于没有经钙处理的图4A和图4B。

图5A、B、C、D示出了用1.0mmol/l钾离子处理期间的成熟鲟鱼卵的卵膜的多层结构的透射电子显微镜图像(TEM，放大3000倍)。图5A示出了通过外延层EP与外放射带ZRE分离的具有疏松的浑浊纤维的内放射带ZRI(现象只能识别为超结构)。外放射带ZRE的特征在于细长的原纤维的丝状网络。图5B示出了具有细粒状结构的新的稳定层SS的超结构形成，其直接位于外放射带ZRE和-根据图5C-肺泡层AL之间，其渗透到卵膜外围-根据图5D-通过小管(小导管，通道)。超结构分析证实，根据本发明的某些实施方式的用钾离子(1.0mmol/l)处理导致形成了以前未知的具有无定形结构的新稳定层SS，并定位在鱼类和甲壳类动物中外放射带ZRE和肺泡层AL之间。

图6A、B、C、D示出了成熟卵的质膜内的外围卵浆中的皮质颗粒CG的TEM图像(3000倍放大)，其中图6A示出了未经处理的卵(现有技术)，图6B示出了用钾阳离子处理的卵，图6C示出了用钾和钙阳离子处理过的卵，图6D示出了仅用钙阳离子处理的卵(现有技术)。

皮质颗粒是卵中发现的分泌细胞器(结构可界定的区域)，与受精事件密切相关。皮质颗粒含有酶如过氧化物酶和用于内放射带ZRI和外放射带ZRE酪氨酸交联的结构元件。如通过TEM在各种处理的影响下分析的，皮质反应和其内容物的释放由钙离子处理触发。在自然受精过程中，卵子质膜中精子诱导的钙波也会发生相同的过程。在未经处理的卵(图6A)中，带有酶的皮质颗粒CG可以清晰地识别为外周卵浆中又大又圆的囊泡(气泡)，其中也含有结构成分。同样地，在单独根据本发明的钾处理期间，皮质颗粒CG仍保持不变(图6B)。但是，可以在卵膜上观察到从卵浆到非细胞卵膜的强力嚢泡转运。在图6A和图6B中，卵黄用D标记。在钾离子和钙离子的双重处理中(图6C)，皮质颗粒CG的内容物的排出(箭头)和新的稳定层SS的形成都发生了。单独使用钙离子处理(图6D)只会导致皮层反应，其中的内容物被排出到非细胞卵膜中，并且酪氨酸残基触发了内放射带ZRI和外放射带ZRE的酶交联。空液泡V留在卵浆中。

为了在本发明中对冷冻切片的钾效应进行诊断性筛选，图7A和图7B示出了现有技术中西伯利亚鲟Acipenser baerii未处理的活卵的光学显微镜图像(400倍放大)。图7A左图为HE染色(苏木精-伊红染色)，图7B右图为阿利新蓝染色。该试验对糖胺聚糖GAG、透明质酸和纤维蛋白染色。可以看到，阿利新蓝在卵膜的各层中缺失，但在卵质OP中明显存在。各层根据上述实施例方式进行特征描述，并以双箭头标记其厚度。

另一方面，图7C和图7D显示了使用本发明所要求保护的钾暴露步骤法处理的西伯利亚鲟鲟Acipenser baerii排卵状态的鲜活成熟卵子的冷冻切片照片。用1.5mmol/l的钾离子(来自柠檬酸钾)处理卵。在卵胞外膜的外放射带ZRE和肺泡层AL之间出现的新的稳定层SS是明显的。从图7C的左图显示，新的稳定层SS经伊红染色后特别嗜酸性。根据图7D的右图显示，新的稳定层SS经阿利新蓝染色后，尤其富含GAG。由此可以得到新型稳定层SS的特别有利的弹性。

为了确定单独钙的作用以及钾和钙离子的双重处理的作用，对冰冻切片进行诊断性筛查，图8A和图8B显示了现有技术中用按照WO 2007/045233 A1的方法处理的西伯利亚鲟鱼Acipenser baerii成熟卵的冰冻切片的照片，放大了400倍。根据图8A左图显示HE染色(苏木精-伊红染色)，根据图8B右图显示阿尔辛蓝染色。处理了西伯利亚鲟鱼的排卵的卵子。根据图8A左图的HE染色显示了在内放射带ZRI和外放射带ZRE中酪氨酸分子交联的蛋白链。可以看到两个区域之间明显的分隔。交联导致卵膜的结构稳定。在根据图8B的右图，用阿尔辛蓝染色，可以看到内放射带ZRI和外放射带ZRE仅被非常弱地染色，这导致了很少的GAG和较低的弹性，而在卵质OP中，强烈的染色表明非常多的GAG。

在图8C和图8D中，示出了采用所要求保护的方法处理的活排卵的卵子的冷冻切片的照片，这些卵已经在额外的钙暴露步骤中用根据WO 2007/045233 A1的方法进行了处理。在钾暴露步骤中用1.5mmol/l钾离子(来自柠檬酸钾)、在钙暴露步骤中用1.6mmol/l钙离子(来自氯化钙)处理西伯利亚鲟鱼Acipenser baerii的成熟排卵的卵子。除了固化图8A和图8B所示照片中的卵膜交联外，现在还可以在根据图8C和图8D的照片中看到卵膜中具有稳定功能的新型透明膜稳定层SS。因此，经过处理的西伯利亚鲟鱼的成熟活卵在弹性上(通过GAG)和结构上(通过蛋白质交联)稳定，并形成完美的鱼子酱。

图9A显示了在根据本发明的双重处理之后，来自白鲸鲟鱼达氏鳇的鲜活成熟的排卵的卵子的卵膜的特征性SEM图像(放大12000倍)。图9B显示了在根据本发明的双重处理之后，来自白鲸鲟鱼达氏鳇的鲜活成熟的排卵的卵子的卵膜的光学显微镜图像(放大了400倍)。这两个图像均显示了新的稳定层SS和内放射带ZRI和外放射带ZRE的交联。此外，值得注意的是，达氏鳇的卵具有非常独特的肺泡层AL，其带有较大的液泡V。通过H&E染色对冷冻切片进行的筛查证实了通过钾离子暴露步骤形成了新的弹性稳定层SS，通过钾和钙离子的暴露在卵膜中形成了的额外蛋白质交联。

标记符号清单

AL 肺泡层

Ca

CG 皮质颗粒

CYT 细胞质(OP)

D 卵黄

EP 表层

K

Mv 平均值

OP 卵母细胞浆(卵浆)

pAL 肺泡层(朝向卵膜的边缘)

PO 卵母细胞(卵细胞)的质膜

SS 稳定层

Std 标准偏差

V 液泡

ZRI 内放射带

ZRE 外放射带