一种非洲猪瘟PCR检测方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟PCR检测方法。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(African swinefever virus，ASFV)感染引起的急性、热性、烈性、接触性传染病，猪感染后，主要临床症状表现为高热、食欲废绝、皮肤发绀，剖检后会发现淋巴结、肾、胃肠黏膜等出血，毒力强的毒株感染猪后，造成的病死率可高达100％，其传染性强、发病快、致死率高，对生猪养殖危害巨大，是需要高度防范的传染病，是世界动物卫生组织要求法定报告的动物疫病，同时也是《中华人民共和国动物防疫法》规定的一类疫病。

非洲猪瘟病毒是具有囊膜的双链DNA病毒，病毒基因组长度在170-190kb之间，编码大概150-200种蛋白质，ASFV的p30蛋白是一种很重要的结构蛋白，由CP204L基因编码，有很强的免疫原性，能诱导机体产生中和抗体，为病毒的早期蛋白，在感染后4h胞浆内即可检测到。

2018年之前，中国没有非洲猪瘟，此次非洲猪瘟爆发，在我国已形成较大污染面，受其影响，我国生猪、能繁母猪存栏量快速下降，猪肉价格全国普涨，对我国居民的生活质量造成很大影响，PCR检测具有检测特异性高、灵敏度强、操作简单、可大批量检测等特点，ASFV的p30序列保守，针对p30序列设计出具有高度保守引物序列的PCR检测方法，可以更好应对非洲猪瘟变异。

发明内容

本发明的目的在于提供一种非洲猪瘟PCR检测方法，该方法针对ASFV p30保守序列，可以检测多种变异非洲猪瘟病毒。

为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

1.从NCBI上获得非洲猪瘟p30序列，利用NCBI引物设计功能，设计高度保守的引物序列，设计的引物序列为：Primer F:5’-TGCAGGGCAAGGGTATACTG-3’(Seq ID No.1)，R:5’-CCTCTGATGAGGGCTCTTGC-3’(Seq ID No.2)，长度185bp；

2.一种非洲猪瘟病毒PCR检测方法，包括以下步骤：

1)从样品中提取病毒DNA；

2)以提取的DNA为模板，用设计好的引物对进行PCR扩增；

进一步的，扩增体系如下：10×Ex Taq Buffer 2.0μl、1U/μl Ex Taq Hot-startDNA聚合酶0.3μl、10μM引物1μl、2.5mM dNTPs 2.0μl、20mM MgCl

进一步的，PCR扩增程序为：95℃5min、(95℃30s、55℃30s、72℃30s)35个循环，72℃10min、4℃∞；

3)对扩增产物进行分析，如果扩增产物出现185bp大小的条带，说明待测样品中含有非洲猪瘟病毒。

本发明的有益效果是：

本发明基于ASFV p30基因的高度保守区域设计引物，该序列具有灵敏度高、特异性好、适用度高的优点。

附图说明

图1特异性检验结果图

图2敏感性检验结果图

图3不同来源非洲猪瘟病毒检测

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

实施例1

1.主要试剂

Ex Taq Buffer、Ex Taq Hot-start DNA聚合酶、MgCl

2.主要仪器

Sigma 3K-15高速冷冻离心机、SW-CJ-IBU超净工作台、PTC-200型PCR扩增仪、TAZ-C型恒温摇床、DYY-6D核酸电泳仪、UV2450紫外凝胶成像系统；

3.从NCBI上获得非洲猪瘟p30序列，利用NCBI引物设计功能，设计高度保守的引物序列，设计的引物序列为：Primer F:5’-TGCAGGGCAAGGGTATACTG-3’(Seq ID No.1)，R:5’-CCTCTGATGAGGGCTCTTGC-3(Seq ID No.2)，长度185bp，序列保守对比见序列表；

4.样品DNA

ASFV p30 DNA序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，连接于pGEM-T载体，转化大肠杆菌DH5α，扩大培养，抽提质粒DNA；

5.PCR扩增

以ASFV DNA为模板，PCR体系为：10×Ex Taq Buffer 2.0μl、1U/μl Ex Taq Hot-start DNA聚合酶0.3μl、10μM引物1μl、2.5mM dNTPs 2.0μl、20mM MgCl

6.对扩增产物进行分析，如果扩增产物出现185bp大小的条带，说明待测样品中含有非洲猪瘟病毒。

实验一特异性检验

1.主要病毒株

猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV，疫苗株)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪细小病毒(PPV)DNA样品由广东省动物疫病预防控制中心提取；

2.以上述DNA为模板，用设计的引物PCR扩增，观察结果，结果见图1。

由实验结果可以看出，以PRV、CSFV、PCV2、PRRSV、JEV、PPV DNA为模板，不能扩增出特异条带，本试剂盒有很好的特异性。

实验二：敏感性检验

将初始浓度为300ng/μl的ASFV DNA分别按1：10、1：20、1：30、1：40、1：50、1：60、1：70、1：80、1：90、1：100稀释，从每个稀释度各取3μl用本方法进行检验，观察结果，实验结果见图2。

结果显示1％稀释的ASFV DNA模板也能用本方法检测出来。

实验三：不同来源非洲猪瘟病毒检测能力

1.ASFV 97/Ot/2012、72407/Ss/2005、26/Ss/2004、56/Ca/1978、OURT 88/3、Benin97/1DNA、47/Ss/200、NHV、CMR/yde76c/2012、CMR/kssri60b/2010、CMR/yde54c/2013、CMR/gra18b/2010序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，连接于pUC57载体；

2.以上述ASFV DNA为模板，用本发明方法扩增，实验结果见图3。

1泳道为97/Ot/2012、2泳道为72407/Ss/2005、3泳道为26/Ss/2004、4泳道为56/Ca/1978、5泳道为OURT 88/3、6泳道为Benin 97/1、7泳道为47/Ss/200、8泳道为NHV、9泳道为CMR/yde76c/2012、10泳道为CMR/kssri60b/2010、11泳道为CMR/yde54c/2013、12泳道为CMR/gra18b/2010，以上模板均扩增出了目的条带，说明本发明方法具有非常好的检测不同毒株非洲猪瘟病毒的能力，具有很好的适用性。

序列表

<110> 广州博识生物科技有限公司

<120> 一种非洲猪瘟PCR检测方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgcagggcaa gggtatactg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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