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一种小麦ACCase突变型基因及其在植物抗除草剂中的应用

文献发布时间：2023-06-19 13:48:08

技术领域

本发明涉及一种小麦ACCase突变型基因及其在植物抗除草剂中的应用，属于植物基因工程和植物抗除草剂育种领域，该基因所编码的蛋白的氨基酸序列对应于野生型小麦ACCase的氨基酸序列存在以下任意一种或多种突变：对应于野生型小麦ACCase的氨基酸序列的第1708位发生突变、第1768位发生突变、第1769位发生突变、第1992位发生突变、第2015位发生突变、第2029位发生突变、第2066位发生突变、第2084位发生突变。

背景技术

乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)类抑制剂是超高效的除草剂，对禾本科杂草有优异的防除效果，而对双子叶植物高度安全，故目前在阔叶作物大田中使用最为普遍。但同时发现长期单一使用该类除草剂，其用量普遍都会逐年增加，药效降低，也就是说，敏感性杂草大量减少，而非敏感性的耐药性杂草逐渐上升演化为群落优势种，并易诱导抗药性杂草的产生。

ACCase同乙酰乳酸合成酶(ALS)和多酚氧化酶(PPO)一样是高效除草剂的靶标酶，针对该靶标的除草剂主要有芳氧苯氧基丙酸类(AOPP)和环己烯酮类(CHD)除草剂，它们对双子叶植物有高度的选择性，而且具有低的哺乳动物毒性和良好的环境特性，受到越来越多的关注。AOPP类除草剂是一类著名的防除禾本科杂草的高活性除草剂，也是一类发展比较迅速、不断开发出新品种的除草剂类型。该类除草剂最早是在20世纪60年代开始研究。目前商品化的AOPP类除草剂有禾草灵、稳杀得、高效盖草能、恶草醚等。该类除草剂存在立体异构，而且这种异构体中只有右旋体对ACCase有显著活性。当用盖草能处理后，植物脂肪氧合酶活性增高，不饱和脂肪酸氧化加剧，自由基对膜的伤害加深；施加各种外源脂氧合酶抑制剂和清除自由基物质可逆转禾草灵和盖草能的毒害作用，而且使禾草灵诱导乙烯形成的作用得到抑制。

由于化学除草剂的广泛使用，杂草抗性发生的速度如此之快、范围如此之广，不但增加了除草成本，也增加了环境压力。目前，对抗性杂草种群形成的原因有两种观点：一种认为杂草长期与除草剂接触，而使除草剂作用部位的编码基因发生突变或者基因表达发生改变，结果导致杂草对除草剂的解毒能力提高或者出现对除草剂具有耐药性或抗药性的种群。总的来说，杂草抗性的形成，基本上是一个抗性基因被选择的过程，抗药性基因的遗传是杂草产生抗药性的基础。之前的报道认为，抗药性的产生不仅是由于植物改变了对除草剂的吸收与转运或植物加速了除草剂的代谢，且主要是因为除草剂的作用部位发生了改变。目前，尚缺少可以有效利用的ACCase突变型基因，限制了抗除草剂植物材料的创制和该类除草剂的高效利用。

发明内容

技术问题：禾本科植物对ACCase抑制剂类除草剂高度敏感，本发明所要解决的技术问题是提供一种可以赋予植物抗除草剂抗性的突变型基因和突变型蛋白。进一步地，本发明所要解决的技术问题是提供一种可以赋予植物抗(耐)乙酰辅酶A羧化酶类除草剂抗性的小麦ACCase突变型基因和突变型蛋白。

技术方案：通过定点突变的方法得到ACCase基因突变型，利用分子生物学的方法克隆该ACCase突变型基因，然后将该基因用遗传转化的方法导入对除草剂敏感的受体植物基因组，表达ACCase突变型蛋白，使受体植物具有对ACCase抑制剂类除草剂的抗性。所述ACCase突变型基因编码蛋白的氨基酸序列存在如下突变：其对应于野生型小麦ACCase的氨基酸序列的第1708位发生突变、第1768位发生突变、第1769位发生突变、第1992位发生突变、第2015位发生突变、第2029位发生突变、第2066位发生突变、第2084位发生突变。野生型小麦ACCase的氨基酸序列的第1708位原为精氨酸，突变后可为除精氨酸之外的任意氨基酸；第1768位原为天冬酰胺，突变后可为除天冬酰胺之外的任意氨基酸；第1769位原为异亮氨酸，突变后可为除异亮氨酸之外的任意氨基酸；第1992位原为丙氨酸，突变后可为除丙氨酸之外的任意氨基酸；第2015位原为色氨酸，突变后可为除色氨酸之外的任意氨基酸；第2029位原为异亮氨酸，突变后可为除异亮氨酸之外的任意氨基酸；第2066位原为天冬氨酸，突变后可为除天冬氨酸之外的任意氨基酸；第2084位原为甘氨酸，突变后可为除甘氨酸之外的任意氨基酸。

所述小麦ACCase突变型基因表达的蛋白，包括：

(a)其氨基酸序列选自由SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16组成的组中；或

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且具有乙酰辅酶A羧化酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明还提供一种核酸或基因，其编码所述的蛋白。

本发明所述的核酸或基因，包括：

(i)编码所述的蛋白的核酸或基因；或

(ii)在严格条件下与(i)限定的核苷酸序列杂交且编码具有乙酰辅酶A羧化酶活性的蛋白质的核苷酸序列；或

(iii)其核苷酸序列选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15组成的组中。

所述严格条件为：在0.1×SSC、0.1％SDS的溶液中，65℃洗膜15分钟的高度严谨的杂交条件。

本发明的ACCase突变型基因发生突变的核苷酸包括但不仅限于以下几种突变，在以下位点突变成其他核苷酸的情况也在本发明的保护范围之内，例如：A突变为T、C、G；或C突变为T、A、G；或T突变为A、C、G；或G突变为T、C、A等等均在本发明的保护范围之内。

进一步地，根据本发明的小麦ACCase突变型基因，所述小麦ACCase基因存在以下一种或多种突变：只在小麦ACCase基因的第5122位核苷酸发生突变、只在小麦ACCase基因的第5303位核苷酸发生突变、只在小麦ACCase基因的第5309位核苷酸发生突变、只在小麦ACCase基因的第5975位核苷酸发生突变、只在小麦ACCase基因的第6045位核苷酸发生突变、只在小麦ACCase基因的第6085位核苷酸发生突变、只在小麦ACCase基因的第6197位核苷酸发生突变、只在小麦ACCase基因的第6250位核苷酸发生突变、或多个位点同时发生突变，例如第5122位核苷酸和第5303位核苷酸同时发生突变，第5122位核苷酸、第5303位核苷酸和第5309位核苷酸同时发生突变、第5122位核苷酸、第5303位核苷酸、第5309位核苷酸和第5975位核苷酸同时发生突变等。

作为优选，根据本发明的小麦ACCase突变型基因，所述小麦ACCase基因存在以下一种或多种突变：只在小麦ACCase基因的第5122位核苷酸由C突变为T、只在小麦ACCase基因的第5303位核苷酸由A突变为G、在小麦ACCase基因的第5309位核苷酸由A突变为T、在小麦ACCase基因的第5975位核苷酸由C突变为T、在小麦ACCase基因的第6045位核苷酸由G突变为T、在小麦ACCase基因的第6085位核苷酸由T突变为A、在小麦ACCase基因的第6197位核苷酸由A突变为G、在小麦ACCase基因的第6250位核苷酸由G突变为A，或多个位点同时发生突变。

本发明还提供一种表达盒、重组载体或细胞，其含有所述的ACCase突变型基因。

所述除草剂是禾草灵和盖草能中的一种或多种。

本发明还提供获得具有除草剂抗性的植物的方法，包括如下步骤：

1)使植物包含所述核酸或基因；或

2)使植物表达所述小麦ACCase突变型蛋白。

进一步地，所述方法包括crispr基因编辑、转基因、杂交、回交或无性繁殖步骤。

本发明还提供一种鉴定植物的方法，其中所述植物是包含所述的核酸或基因的植物、表达所述的蛋白的植物或由所述的方法获得的植物，包括以下步骤：

1)测定所述植物是否包含所述的核酸或基因；或，

2)测定所述植物是否表达所述的蛋白。

本发明还提供一种除草剂的防护剂，该防护剂包括所述的小麦ACCase突变型蛋白。

本发明还提供一种控制杂草的方法，包括：对种植作物的大田施用有效剂量的除草剂，所述作物包含所述的核酸或基因或所述的表达盒、重组载体或细胞，所述除草剂为禾草灵和盖草能中的一种或多种。

本发明还提供一种用于保护植物免受由除草剂引起的损伤的方法，包括：对种植作物的大田施用有效剂量的除草剂，所述作物包含所述的核酸或基因或将所述的表达盒、重组载体导入植物，导入后的植物产生除草剂抗性蛋白，所述除草剂为禾草灵和盖草能中的一种或多种。

有益效果：本发明公开的来源于小麦的ACCase突变型基因及其应用方法可以赋予除草剂敏感植物对除草剂的抗性，籍此可以培育抗除草剂植物，从而实现农作物大田高效化学除草。所述小麦ACCase突变型基因还可以通过杂交、回交等传统育种方法向普通小麦品种转移，培育抗除草剂小麦新品种。

附图说明

图1示出了含有ACCase突变位点的转基因小麦抗除草剂的示意图。

图2示出了PCR扩增含有小麦ACCase突变位点的ACCase基因全长结果图；第1泳道为Marker；Marker分子量从上到下依次为15kb、8kb、5kb、3kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp，第2泳道为野生型徐麦33号的DNA，第3泳道为含有抗除草剂突变位点ACCase-1708的DNA，第4泳道为含有抗除草剂突变位点ACCase-1768的DNA，第5泳道为含有抗除草剂突变位点ACCase-1769的DNA，第6泳道为含有抗除草剂突变位点ACCase-1992的DNA，第7泳道为含有抗除草剂突变位点ACCase-2015的DNA，第8泳道为含有抗除草剂突变位点ACCase-2029的DNA，第9泳道为含有抗除草剂突变位点ACCase-2066的DNA，第10泳道为含有抗除草剂突变位点ACCase-2084的DNA。

图3示出了突变型ACCase基因转基因小麦PCR检测图；总共有8个泳道，第1泳道为Marker；Marker分子量从上到下依次为15kb、8kb、5kb、3kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp；第2泳道为非转基因野生型DNA，作为阴性对照，第3泳道为质粒DNA，作为阳性对照，第4泳道为转化含有ACCase-1708抗除草剂突变体ACCase基因的转基因植株DNA，第5泳道为转化含有ACCase-1768抗除草剂突变体ACCase基因的转基因植株DNA，第6泳道为转化含有ACCase-1769抗除草剂突变体ACCase基因的转基因植株DNA，第7泳道为转化含有ACCase-1992抗除草剂突变体ACCase基因的转基因植株DNA，第8泳道为转化含有ACCase-2015抗除草剂突变体ACCase基因的转基因植株DNA，第9泳道为转化含有ACCase-2029抗除草剂突变体ACCase基因的转基因植株DNA，第10泳道为转化含有ACCase-2066抗除草剂突变体ACCase基因的转基因植株DNA，第11泳道为转化含有ACCase-2084抗除草剂突变体ACCase基因的转基因植株DNA。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：小麦ACCase基因突变位点的确定

我们将小麦的ACCase序列(Genbank XM_015783727.2)作为参考序列，与小麦基因组进行同源比对，发现与小麦基因组的ACCase基因(AF029895.1)的同源性最高。根据专利(US15715547、CN201811176178.6)中提到的水稻ACCase可以抗除草剂的氨基酸突变位点，分别是1731(精氨酸突变为半胱氨酸)、1791(天冬酰胺突变为丝氨酸)、1792(异亮氨酸变为亮氨酸)、2015(丙氨酸变为缬氨酸)、2038(色氨酸变为半胱氨酸)、2052(异亮氨酸变为天冬酰胺)、2089(天冬氨酸变为甘氨酸)、2107(甘氨酸变为丝氨酸)作为参考，通过同源比对的方法，确定在小麦中ACCase基因突变的氨基酸位点分别为1708(精氨酸突变为半胱氨酸)、1768(天冬酰胺突变为丝氨酸)、1769(异亮氨酸变为亮氨酸)、1992(丙氨酸变为缬氨酸)、2015(色氨酸变为半胱氨酸)、2029(异亮氨酸变为天冬酰胺)、2066(天冬氨酸变为甘氨酸)、2084(甘氨酸变为丝氨酸)。根据氨基酸密码子对照表，确定对应核苷酸位点分别为5122(C变为T)、5303(A变为G)、5309(A变为T)、5975(C变为T)、6045(G变为T)、6085(T变为A)、6197(A变为G)、6250(G变为A)。

实施例2：小麦徐麦33号野生型ACCase全长基因的获得

选取徐麦33号野生型植株的叶片，提取基因组DNA，根据NCBI中小麦ACCase基因(NCBI Genbank：AF029895)设计引物进行扩增，采用KOD DNA polymerase聚合酶(购自Toyobo公司)扩增ACCase基因，其反应体系如下：

PCR扩增反应程序采用两步法，退火和延伸合为一起，采用68度。

程序如下：预变性：94℃3min；35个循环：变性94℃10sec；延伸68℃10min；保温：72℃10min。

取2μl PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，发现有预期大小的片段后(图2)，剩余的PCR产物经PCR清洁试剂盒(购自Axygen公司)清洁回收后，克隆至pMD19-T载体(购自Takara公司)，然后转化大肠杆菌。每个转化随机挑取12个大肠杆菌单克隆进行PCR检测，取PCR结果呈阳性的6个单克隆，送南京一道生物科技有限公司测序，获得突变ACCase基因序列，该基因片段长度为13127bp，通过去除内含子后获得基因全长6936bp，徐麦33号野生型ACCase序列全长基因片段的测序结果如SEQ ID No:17所示。

实施例3：小麦ACCase基因突变位点基因序列的获得

利用点突变试剂盒扩增小麦ACCase基因的突变位点序列。首先，利用引物ACC-CF和ACC-CR，以徐麦33号cDNA为模板，克隆ACCase全长cDNA，连入TK007载体(南京擎科生物科技有限公司)，转化大肠杆菌TOP10菌株感受态细胞，挑选阳性转化子测序验证，获得正确单克隆，质粒命名为TK007-ACCase；第二，利用突变引物ACC-MutF和ACC-MutR，以TK007-ACCase为模版，进行PCR扩增，扩增产物限制性内切酶DpnI消化后，转入大肠杆菌DMT菌株感受态细胞，挑选阳性转化子测序验证，获得ACCase目标位点突变的质粒。

利用突变引物ACC1708-MutF和ACC1708-MutR扩增ACCase-1708突变位点，其核苷酸序列的第5122位由C突变为T，导致其编码的氨基酸序列的第1708位由精氨酸变为半胱氨酸，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示；

利用突变引物ACC1768-MutF和ACC1768-MutR扩增ACCase-1768突变位点，其核苷酸序列的第5303位由A突变为G，导致其编码的氨基酸序列的第1768位由天冬酰胺变为丝氨酸，其核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No:4所示；

利用突变引物ACC1769-MutF和ACC1769-MutR扩增ACCase-1769突变位点，其核苷酸序列的第5309位由A突变为T，导致其编码的氨基酸序列的第1769位由异亮氨酸变为亮氨酸，其核苷酸序列如SEQ ID No:5所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No:6所示；

利用突变引物ACC1992-MutF和ACC1992-MutR扩增ACCase-1992突变位点，其核苷酸序列的第5975位由C突变为T，导致其编码的氨基酸序列的第1992位由丙氨酸变为缬氨酸，其核苷酸序列如SEQ ID No:7所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No:8所示；

利用突变引物ACC2015-MutF和ACC2015-MutR扩增ACCase-2015突变位点，其核苷酸序列第6045位由G突变为T，导致其编码的氨基酸序列的第2010位由色氨酸变为半胱氨酸，其核苷酸序列如SEQ ID No:9所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No:10所示。

利用突变引物ACC2029-MutF和ACC2029-MutR扩增ACCase-2029突变位点，其核苷酸序列的第6085位由T突变为A，导致其编码的氨基酸序列的第2029位由异亮氨酸变为天冬酰胺，其核苷酸序列如SEQ ID No:11所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No:12所示。

利用突变引物ACC2066-MutF和ACC2066-MutR扩增ACCase-2066突变位点，其核苷酸序列的第6197位由A突变为G，导致其编码的氨基酸序列第2066位由天冬氨酸变为甘氨酸，其核苷酸序列如SEQ ID No:13所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No:14所示。

利用突变引物ACC2084-MutF和ACC2084-MutR扩增ACCase2084突变位点，其核苷酸序列第6250位由G突变为A，导致其编码的氨基酸序列第2084位由甘氨酸变为丙氨酸，其核苷酸序列如SEQ ID No:15所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No:16所示。

实施例4 ACCase转基因小麦的获得及其抗除草剂验证

通过Infuison反应，将突变的ACCase片段连入含有花椰菜花叶病毒35S启动子和35S终止子的植物表达载体中，分别转化野生型小麦。获得纯合并稳定表达含有ACCase突变位点的转基因小麦，并对转基因小麦检测除草剂的耐受性。

将转基因小麦和野生型小麦分别播种，待小麦长至三叶期时，分别喷施乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂喹禾灵(喷施浓度为施用1.5mL喹禾灵/L水(2倍推荐使用浓度))、吡氟氯禾灵(喷施浓度为施用1.5mL吡氟氯禾灵/L水(1倍推荐使用浓度))、烯草酮(喷施浓度为施用1.5mL烯草酮/L水(1倍推荐使用浓度))、吡氟禾草灵(喷施浓度为施用1.5mL吡氟禾草灵/L水(1倍推荐使用浓度))，喷施一个月后调查枯死情况，发现野生型对照在喷施和以上同样浓度的乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂喹禾灵、烯草酮、吡氟禾草灵后，几乎停止生长，新长出来的叶片完全枯黄，并逐渐枯死。而含有ACCase突变位点的转基因小麦则全部对乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂表现出抗的表型，其正常的生长发育几乎没有受到影响，最终正常拔节抽穗。表1中显示本发明转基因小麦对ACCase抑制性除草剂的抗性比野生型要高，伤害百分比要低60％以上。这表明我们获得的携带有ACCase突变位点的转基因小麦确实能够稳定遗传的获得抗乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂的抗性。

表1乙酰辅酶A羧化酶类除草剂对野生型和转基因小麦的伤害比率

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些均在本发明的保护范围内。本发明的全部范围由所附专利要求极其任何等同物给出。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种小麦ACCase突变型基因及其在植物抗除草剂中的应用

<160> 36

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6936

<212> DNA

<213> 徐麦33号(Triticum aestivum L.ACCase-1708突变核苷酸序列)

<400> 1

atgggatcca cacatttgcc cattgtcggc cttaatgcct cgacaacacc atcgctatcc 60

actattcgcc cggtaaattc agccggtgct gcattccaac catctgcccc ttctagaacc 120

tccaagaaga aaagtcgtcg tgttcagtca ttaagggatg gaggcgatgg aggcgtgtca 180

gaccctaacc agtctattcg ccaaggtctt gccggcatca ttgacctccc aaaggagggc 240

acatcagctc cggaagtgga tatttcacat gggtccgaag aacccagggg ctcctaccaa 300

atgaatggga tactgaatga agcacataat gggaggcatg cttcgctgtc taaggttgtc 360

gaattttgta tggcattggg cggcaaaaca ccaattcaca gtgtattagt tgcgaacaat 420

ggaatggcag cagctaagtt catgcggagt gtccgaacat gggctaatga aacatttggg 480

tcagagaagg caattcagtt gatagctatg gctactccag aagacatgag gataaatgca 540

gagcacatta gaattgctga tcaatttgtt gaagtacccg gtggaacaaa caataacaac 600

tatgcaaatg tccaactcat agtggagata gcagtgagaa ccggtgtttc tgctgtttgg 660

cctggttggg gccatgcatc tgagaatcct gaacttccag atgcactaaa tgcaaacgga 720

attgtttttc ttgggccacc atcatcatca atgaacgcac taggtgacaa ggttggttca 780

gctctcattg ctcaagcagc aggggttccg actcttcctt ggagtggatc acaggtggaa 840

attccattag aagtttgttt ggactcgata cccgcggaga tgtataggaa agcttgtgtt 900

agtactacgg aggaagcact tgcgagttgt cagatgattg ggtatcccgc catgattaaa 960

gcatcatggg gtggtggtgg taaagggatc cgaaaggtta ataatgacga tgatgtcaga 1020

gcactgttta agcaagtgca aggtgaagtt cctggctccc caatatttat catgagactt 1080

gcatctcaga gtcgacatct tgaagttcag ttgctttgtg atcaatatgg caatgtagct 1140

gcgcttcaca gtcgtgactg cagtgtgcaa cggcgacacc aaaagattat tgaggaagga 1200

ccagttactg ttgctcctcg cgagacagtg aaagagctag agcaagcagc aaggaggctt 1260

gctaaggctg tgggttatgt tggtgctgct actgttgaat atctctacag catggagact 1320

ggtgaatact attttctgga acttaatcca cggttgcagg ttgagcatcc agtcaccgag 1380

tggatagctg aagtaaactt gcctgcagct caagttgcag ttggaatggg tatacccctt 1440

tggcaggttc cagagatcag acgtttctat ggaatggaca atggaggagg ctatgacatt 1500

tggaggaaaa cagcagctct tgctactcca tttaacttcg atgaagtgga ttctcaatgg 1560

ccaaagggtc attgtgtagc agttaggata accagtgagg atccagatga cggattcaag 1620

cctaccggtg gaaaagtaaa ggagatcagt tttaaaagca agccaaatgt ttgggcctat 1680

ttctctgtta agtccggtgg aggcattcat gaatttgctg attctcagtt tggacatgtt 1740

tttgcatatg gagtgtctag agcagcagca ataaccaaca tgtctcttgc gctaaaagag 1800

attcaaattc gtggagaaat tcattcaaat gttgattaca cagttgatct cttgaatgcc 1860

tcagacttca aagaaaacag gattcatact ggctggctgg ataacagaat agcaatgcga 1920

gtccaagctg agagacctcc gtggtatatt tcagtggttg gaggagctct atataaaaca 1980

ataacgagca acacagacac tgtttctgaa tatgttagct atctcgtcaa gggtcagatt 2040

ccaccgaagc atatatccct tgtccattca actgtttctt tgaatataga ggaaagcaaa 2100

tatacaattg aaactataag gagcggacag ggtagctaca gattgcgaat gaatggatca 2160

gttattgaag caaatgtcca aacattatgt gatggtggac ttttaatgca gttggatgga 2220

aacagccatg taatttatgc tgaagaagag gccggtggta cacggcttct aattgatgga 2280

aagacatgct tgttacagaa tgatcacgat ccttcaaggt tattagctga gacaccctgc 2340

aaacttcttc gtttcttggt tgccgatggt gctcatgttg aagctgatgt accatatgcg 2400

gaagttgagg ttatgaagat gtgcatgccc ctcttgtcac ctgctgctgg tgtcattaat 2460

gttttgttgt ctgagggcca gcctatgcag gctggtgatc ttatagcaag acttgatctt 2520

gatgaccctt ctgctgtgaa gagagctgag ccatttaacg gatctttccc agaaatgagc 2580

cttcctattg ctgcttctgg ccaagttcac aaaagatgtg ccacaagctt gaatgctgct 2640

cggatggtcc ttgcaggata tgatcacccg atcaacaaag ttgtacaaga tctggtatcc 2700

tgtctagatg ctcctgagct tcctttccta caatgggaag agcttatgtc tgttttagca 2760

actagacttc caaggcttct taagagcgag ttggagggta aatacagtga atataagtta 2820

aatgttggcc atgggaagag caaggatttc ccttccaaga tgctaagaga gataatcgag 2880

gaaaatcttg cacatggttc tgagaaggaa attgctacaa atgagaggct tgttgagcct 2940

cttatgagcc tactgaagtc atatgagggt ggcagagaaa gccatgcaca ctttattgtg 3000

aagtcccttt tcgaggacta tctctcggtt gaggaactat tcagtgatgg cattcagtct 3060

gatgtgattg aacgcctgcg ccaacaacat agtaaagatc tccagaaggt tgtagacatt 3120

gtgttgtctc accagggtgt gagaaacaaa actaagctga tactaacact catggagaaa 3180

ctggtctatc caaaccctgc tgtctacaag gatcagttga ctcgcttttc ctccctcaat 3240

cacaaaagat attataagtt ggcccttaaa gctagcgagc ttcttgaaca aaccaagctt 3300

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aggacggcca ttagtgagat catgggagat ttagtgactg ccccactgcc agttgaagat 3420

gcactggttt ctttgtttga ttgtagtgat caaactcttc agcagagggt gatcgagacg 3480

tacatatctc gattatacca gcctcatctt gtcaaggata gtatccagct gaaatatcag 3540

gaatctggtg ttattgcttt atgggaattc gctgaagcgc attcagagaa gagattgggt 3600

gctatggtta ttgtgaagtc gttagaatct gtatcagcag caattggagc tgcactaaag 3660

ggtacatcac gctatgcaag ctctgagggt aacataatgc atattgcttt attgggtgct 3720

gataatcaaa tgcatggaac tgaagacagt ggtgataacg atcaagctca agtcaggata 3780

gacaaacttt ctgcgacact ggaacaaaat actgtcacag ctgatctccg tgctgctggt 3840

gtgaaggtta ttagttgcat tgttcaaagg gatggagcac tcatgcctat gcgccatacc 3900

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cctcctcttt ctgctcttct tgagttgggt aagttgaaag tgaaaggata caatgaggtg 4020

aagtatacac cgtcacgtga tcgtcagtgg aacatataca cacttagaaa tacagagaac 4080

cccaaaatgt tgcacagggt gtttttccga actcttgtca ggcaacccgg tgcttccaac 4140

aaattcacat caggcaacat cagtgatgtt gaagtgggag gagctgagga atctctttca 4200

tttacatcga gcagcatatt aagatcgctg atgactgcta tagaagagtt ggagcttcac 4260

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gatcttgttc ccgtttcagg gaacaaagtt gtggatattg gccaagatga agctactgca 4380

tgcttgcttc tgaaagaaat ggctctacag atacatgaac ttgtgggtgc aaggatgcat 4440

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aaacgttgct ccgctagaaa taacagaact acatactgct atgattttcc gttggcattt 4740

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actgggttct ctgccttgaa caagcttctt ggccgggaag tttacagctc ccacatgcag 5520

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cctcttccta ttacaaaatc tttggaccca cctgacagac ccgttgctta catccctgag 5700

aatacatgcg atcctcgtgc tgccatcagt ggcattgatg atagccaagg gaaatggttg 5760

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gcttgggtcg tgattgatag caagataaat ccagatcgca ttgagttcta tgctgagagg 6240

actgcaaagg gcaatgttct cgaacctcaa gggttgatcg agatcaagtt caggtcagag 6300

gaactccaag agtgcatggg taggcttgat ccagaattga taaatctgaa ggcaaagctc 6360

cagggagtaa agcatgaaaa tggaagtcta cctgagtcag aatcccttca gaagagcata 6420

gaagcccgga agaaacagtt gttgcctttg tatactcaaa ttgcggtacg gttcgctgaa 6480

ttgcatgaca cttcccttag aatggctgct aagggtgtga ttaagaaggt tgtagactgg 6540

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<212> PRT

<213> 徐麦33号(Triticum aestivum L.ACCase-1708突变氨基酸序列)

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Gln Pro Ser Ala Pro Ser Arg Thr Ser Lys Lys Lys Ser Arg Arg Val

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Gln Ser Leu Arg Asp Gly Gly Asp Gly Gly Val Ser Asp Pro Asn Gln

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Ser Ile Arg Gln Gly Leu Ala Gly Ile Ile Asp Leu Pro Lys Glu Gly

65 70 75 80

Thr Ser Ala Pro Glu Val Asp Ile Ser His Gly Ser Glu Glu Pro Arg

85 90 95

Gly Ser Tyr Gln Met Asn Gly Ile Leu Asn Glu Ala His Asn Gly Arg

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His Ala Ser Leu Ser Lys Val Val Glu Phe Cys Met Ala Leu Gly Gly

115 120 125

Lys Thr Pro Ile His Ser Val Leu Val Ala Asn Asn Gly Met Ala Ala

130 135 140

Ala Lys Phe Met Arg Ser Val Arg Thr Trp Ala Asn Glu Thr Phe Gly

145 150 155 160

Ser Glu Lys Ala Ile Gln Leu Ile Ala Met Ala Thr Pro Glu Asp Met

165 170 175

Arg Ile Asn Ala Glu His Ile Arg Ile Ala Asp Gln Phe Val Glu Val

180 185 190

Pro Gly Gly Thr Asn Asn Asn Asn Tyr Ala Asn Val Gln Leu Ile Val

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His Ala Ser Glu Asn Pro Glu Leu Pro Asp Ala Leu Asn Ala Asn Gly

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Ile Val Phe Leu Gly Pro Pro Ser Ser Ser Met Asn Ala Leu Gly Asp

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Lys Val Gly Ser Ala Leu Ile Ala Gln Ala Ala Gly Val Pro Thr Leu

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Ala Ser Trp Gly Gly Gly Gly Lys Gly Ile Arg Lys Val Asn Asn Asp

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Asp Asp Val Arg Ala Leu Phe Lys Gln Val Gln Gly Glu Val Pro Gly

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Ser Pro Ile Phe Ile Met Arg Leu Ala Ser Gln Ser Arg His Leu Glu

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Pro Val Thr Val Ala Pro Arg Glu Thr Val Lys Glu Leu Glu Gln Ala

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Trp Gln Val Pro Glu Ile Arg Arg Phe Tyr Gly Met Asp Asn Gly Gly

485 490 495

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Arg Ile Thr Ser Glu Asp Pro Asp Asp Gly Phe Lys Pro Thr Gly Gly

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Lys Val Lys Glu Ile Ser Phe Lys Ser Lys Pro Asn Val Trp Ala Tyr

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Phe Ser Val Lys Ser Gly Gly Gly Ile His Glu Phe Ala Asp Ser Gln

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Phe Gly His Val Phe Ala Tyr Gly Val Ser Arg Ala Ala Ala Ile Thr

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Asn Met Ser Leu Ala Leu Lys Glu Ile Gln Ile Arg Gly Glu Ile His

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Arg Met Val Leu Ala Gly Tyr Asp His Pro Ile Asn Lys Val Val Gln

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Gly Ala Ser Asn Lys Phe Thr Ser Gly Asn Ile Ser Asp Val Glu Val

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Glu Ala Thr Ala Cys Leu Leu Leu Lys Glu Met Ala Leu Gln Ile His

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Pro Val Ile Pro Met Glu Arg Pro Ala Gly Leu Asn Asp Ile Gly Met

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