一种同时测定口服五维盐酸赖氨酸葡萄糖中多种成分含量的方法

技术领域

本发明涉及医药检测技术领域，具体涉及一种采用HPLC-多波长法同时测定口服五维盐酸赖氨酸葡萄糖中多种成分含量的方法。

背景技术

口服五维盐酸赖氨酸葡萄糖收载于《化学药品地方标准上升国家标准》第五册，主要成分为：葡萄糖、盐酸赖氨酸、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺、泛酸钙、蔗糖；根据收集的资料，各企业添加的辅料有：全酯乳粉、香草醛、羧甲纤维素钠、柠檬黄、蜂王浆、润湿剂（75%乙醇）。口服五维盐酸赖氨酸葡萄糖，适用于贫血、肝炎等慢性病所致的营养不良：葡萄糖是人体主要的热量来源之一，用于补充热量、治疗低血糖症；盐酸赖氨酸维持肌体氮平衡、促进蛋白质的合成和代谢、促进人体生长发育及智力发育；维生素B1是碳水化合物代谢所必需的辅酶，可维持心脏、神经及消化系统的正常功能；维生素B2为组织呼吸的重要辅酶，与维持红细胞完整性有关；维生素B6作为辅酶对蛋白质、碳水化合物、脂类的各种代谢功能起作用。

此外泛酸钙是人体和生物中辅酶A的组分，参与碳水化合物、脂肪、蛋白质的代谢作用，如不足，会引起代谢紊乱。烟酰胺与蛋白质的代谢及儿童智力发育关系密切，并在维持皮肤和消化器官正常功能中其重要作用。10-羟基-2-葵烯酸(10-HDA)为蜂王浆的重要主要成分，常作为蜂王浆的质量指标。香草醛是一种重要的合成香料，常用作定香剂和增味剂，由于香草醛的醛基易氧化而稳定性较差，故香草醛的含量分析具有实际意义。由于上述原因，控制各成分的含量具有重要意义。但是口服五维盐酸赖氨酸葡萄糖的现行质量标准未控制上述各成分，缺失关键性检测项目，无法有效控制本品各有效成分的含量，不能全面反映口服五维盐酸赖氨酸葡萄糖的质量情况，造成产品质量控制存在严重缺陷。而目前也未见有关于五维盐酸赖氨酸葡萄糖中多种成分含量测定方法的相关研究报道，因此，若研发出一种能够同时测定口服五维盐酸赖氨酸葡萄糖中多种成分含量的方法，就能更全面、准确的评价口服五维盐酸赖氨酸葡萄糖的质量，从而有效的对其进行质量控制，确保临床疗效。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足而提供的一种同时测定口服五维盐酸赖氨酸葡萄糖中多种成分含量的方法。该测定方法采用HPLC-多波长法同时对口服五维盐酸赖氨酸葡萄糖中8种成分的含量进行测定，方法简单、准确、结果可靠，可为全面有效的评价和控制口服五维盐酸赖氨酸葡萄糖的质量提供依据。

为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

一种同时测定口服五维盐酸赖氨酸葡萄糖中多种成分含量的方法，采用HPLC-多波长法同时对口服五维盐酸赖氨酸葡萄糖中的盐酸赖氨酸、泛酸钙、维生素B1、维生素B2、烟酰胺、香草醛、维生素B6以及10-羟基-2-葵烯酸8种成分的含量进行测定，具体包括如下步骤：

（1）色谱条件：以Alltima-C18，250 mm ×4.6 mm，5 μm为色谱柱，以用20%磷酸溶液调节pH值为2.5的5mmol/L庚烷磺酸钠溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱，流速为1ml/min，柱温为40℃，检测波长200nm（盐酸赖氨酸、泛酸钙）、211nm（10-HDA）、261nm（维生素B1、维生素B2、烟酰胺、香草醛）、290nm（维生素B6），进样量为20 μL；

（2）对照品溶液的制备：

①各对照品储备液（1）：精密称取盐酸赖氨酸对照品52.26mg、烟酰胺对照品10.56mg、香草醛对照品18.93mg、10-HDA对照品17.82mg置于同一50ml容量瓶中，加入0.1%磷酸溶液约30ml，超声并同时振摇使溶解，待用；

②各对照品储备液（2）：精密称取维生素B1对照品10.70mg、维生素B6对照品13.03mg、泛酸钙对照品10.11mg分别置于10ml容量瓶中，加入0.1%磷酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；维生素B2对照品10.89mg置于20ml量瓶中，加入水5ml，磷酸1ml，水浴加热振摇使溶解，取出，冷至室温，用水稀释至刻度，摇匀，即得；

③混合对照品储备液：分别精密量取维生素B1、维生素B6、泛酸钙、维生素B2对照品储备液各4、1、3、2ml同置于①项下对照品储备液（1）的50ml量瓶中，用0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得；

④混合对照品溶液的制备：精密量取③项下的混合对照品储备液2ml置于10ml量瓶中，用0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得；

（3）供试品溶液的制备：取本品10包的内容物，混匀，研细，称取2g，精密称定，置于10ml量瓶中，加入0.1%磷酸溶液6ml，超声并振摇使溶解，冷至室温，用0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即可得到；若供试液含全脂乳粉，需要先以9000rpm、0℃冷冻离心10 min后，取上清液趁冷用滤膜滤过，取续滤液，即得；

（4）测定：分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，照上述的色谱条件进行测定，记录色谱图、峰面积值，以峰面积计算样品中盐酸赖氨酸、泛酸钙、维生素B1、维生素B2、烟酰胺、香草醛、维生素B6以及10-羟基-2-葵烯酸8种成分的含量。

上述的同时测定口服五维盐酸赖氨酸葡萄糖中多种成分含量的方法，所述的步骤（1）色谱条件中，进行梯度洗脱的梯度洗脱程序为：0～45min，流动相A的体积百分比为95％～77％，流动相B的体积百分比为5％～23％；45～57min，流动相A的体积百分比为77％，流动相B的体积百分比为23％；57～58min，流动相A的体积百分比为77％～95％，流动相B的体积百分比为23％～5％；58～65min，流动相A的体积百分比为695％，流动相B的体积百分比为5％。

本发明的有益效果为：

本发明建立了HPLC-多波长法同时测定口服五维盐酸赖氨酸葡萄糖中8种成分含量的方法，采用该方法进行检测，各辅料对待测的8个成分均无干扰，各物质间的分离度均能达到基线分离，各物质在各自线性范围内线性线性均成立（r均为0.9999），精密度好（RSD为0.04%～0.30%），重现性良好（RSD为0.24%～1.89%），加样回收率高，供试品溶液在24小时内稳定。经检验，所建立的方法准确，专属性好。

本发明提供的一种同时测定口服五维盐酸赖氨酸葡萄糖中多种成分含量的方法能够准确、有效地同时测定口服五维赖氨酸葡萄糖中的盐酸赖氨酸、泛酸钙、维生素B1、维生素B2、烟酰胺、香草醛、维生素B6以及10-羟基-2-葵烯酸8种成分的含量，该方法简单、操作简便、准确、结果可靠，实用性高，稳定性好，可为全面有效的评价和控制口服五维盐酸赖氨酸葡萄糖的质量提供依据，有效的弥补口服五维赖氨酸葡萄糖现行质量标准的缺陷，可有效地用于该产品的质量控制。采用本发明方法能更全面、准确的评价口服五维盐酸赖氨酸葡萄糖的质量，从而有利于对其进行质量控制，确保临床疗效。

附图说明

图1空白辅料溶液图谱（200nm），图中，1、泛酸钙，2、烟酰胺，3、维生素B6，4、盐酸赖氨酸，5、维生素B2，6、香草醛，7、维生素B1，8、10-HDA；A、混合对照品溶液，B、全脂乳粉， C、葡萄糖，D、蔗糖，E、蜂乳，F、羧甲基纤维素钠，G、乙醇，H、柠檬黄；

图2 对照品溶液不同波长下的图谱，图中，1、泛酸钙，2、烟酰胺，3、维生素B6，4、盐酸赖氨酸，5、维生素B2，6、香草醛，7、维生素B1，8、10-HDA；A、200 nm，B.211nm ，C、 261nm ，D、290 nm；

图3 混合对照品溶液和供试品溶液图谱（200nm），图中，1、泛酸钙，2、烟酰胺，3、维生素B6，4、盐酸赖氨酸，5、维生素B2，6、香草醛，7、维生素B1，8、10-HDA；A、混合对照品溶液，B、厂家1供试品溶液，C、厂家2供试品溶液，D、厂家3供试品溶液，E、厂家4供试品溶液。

具体实施方式

实施例1

1 材料

1.1主要仪器

LC-20AT型HPLC仪（日本岛津公司）、XS205型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；9983型超声仪（宁波海曙科生超声设备有限公司）、UNIVERSAL320 R离心机（德国Hettich科技有限公司）。

1.2主要药品与试剂

烟酰胺对照品（批号：100115-202005，按C

样品来自于2022年国家抽验性评价工作，4个企业各6批共24批。各企业处方表见表1。根据文献《中华人民共和国国家标准蜂王浆 GB9697-2008》蜂王浆合格品含10-HDA≥1.4%，优等品≥1.8%，故10-HDA的处方量按0.28g/1000g计算。

2方法与结果

2.1 色谱条件

以Alltima-C18( 250 mm ×4.6 mm，5 μm)为色谱柱，以5mmol/L庚烷磺酸钠溶液（用20%磷酸溶液调节pH值为2.5）为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表梯度洗脱(洗脱程序见表2)，流速为1ml/min，柱温为40℃，检测波长200nm（盐酸赖氨酸、泛酸钙）、211nm（10-HDA）、261nm（维生素B1、维生素B2、烟酰胺、香草醛）、290nm（维生素B6），进样量为20 μL。

2.2溶液的制备

2.2.1 各对照品储备液（1）

精密称取盐酸赖氨酸对照品52.26mg、烟酰胺对照品10.56mg、香草醛对照品18.93mg、10-HDA对照品17.82mg置于同一50ml容量瓶中，加入0.1%磷酸溶液约30ml，超声并同时振摇使溶解，待用。

2.2.2各对照品储备液（2）

精密称取维生素B1对照品10.70mg、维生素B6对照品13.03mg、泛酸钙对照品10.11mg分别置于10ml容量瓶中，加入0.1%磷酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即可；维生素B2对照品10.89mg置于20ml量瓶中，加入水5ml，磷酸1ml，水浴加热振摇使溶解，取出，冷至室温，用水稀释至刻度，摇匀，即可。

2.2.3 混合对照品储备液

分别精密量取维生素B1、维生素B6、泛酸钙、维生素B2对照品储备液各4、1、3、2ml同置于“2.2.1 项下对照品储备液（1）”的50ml量瓶中，用0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，即可。

2.2.4 混合对照品溶液的制备

精密量取“2.2.3”项下混合对照品储备液2ml置于10ml量瓶中，用0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，即可。

2.2.5供试品溶液

取本品10包的内容物，混匀，研细，称取约2g，精密称定，置于10ml量瓶中，加入0.1%磷酸溶液约6ml，超声并振摇使溶解，冷至室温，用0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即可。（如供试液含全脂乳粉，需要先以9000rpm、0℃冷冻离心10 min后，取上清液趁冷用滤膜滤过，取续滤液，即可）。

2.3 专属性实验

按照各企业提供的处方配制了各组分溶液测定，结果各辅料对待测的8个成分均无干扰，各物质间的分离度均能达到基线分离，色谱图见图1～3（由于各物质在200nm均有吸收，较为清楚，图1、3使用200nm作为代表）。

2.4线性关系实验

精密量取“2.2.3”项下混合对照品储备液0.2、0.5、0.7、1.0、1.6、2.0、3.0、4.0ml分别置于10ml量瓶中，用0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为标准曲线溶液1～8，测定，结果各成分的线性关系均成立，结果见表3。

2.5精密度实验

2.5.1仪器精密度：取“2.4 线性关系实验”项下标准曲线溶液6按“2.1”项下色谱条件连续进样测定，记录峰面积，结果见表4，结果表明仪器精密度良好。

2.5.2重复性：取企业2、3各1批样品按“2.2.5”项下方法制备含量测定供试品溶液，平行制备6份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，结果重复性良好，结果见表5。

2.6 回收率实验

按照各企业处方配制不含待测成分的混合空白辅料，称取2g，分别置于10ml量瓶中，精密加入“2.2.3”项下混合对照品储备液2ml，按照”2.2.5“项下供试品溶液配置回收率供试液并测定，结果见表6，结果表明回收率良好。

2.7 溶液稳定性实验

取回收率供试品溶液分别于0、4、8、16、14小时测定，结果各物质在24小时内稳定，见表7。

2.8 检出限、定量限实验

取“2.4 线性关系实验”项下标准曲线溶液1稀释后按“2.1”项下色谱条件进样测定，分别按照1:3、1:10的信噪比计算检出限、定量限，结果见表8。

2.9样品测定

分别取4个厂家共12批样品按照本发明方法测定，计算各成分的标示量百分含量，结果见表9。

3.讨论

3.1色谱条件选择及优化

实验开始时，比较了未调节流动相pH值（pH值7.2）、调节流动相pH值分别为4.2、3.1、2.5，发现各物质的峰形和分离效果受pH值的影响：pH7.2时，各峰为帆状，泛酸钙保留时间仅为2.8分钟；在pH值由4.2→3.1→2.5的过程中，各峰对称性变好，泛酸钙保留时间延长，维生素B6和维生素B2出峰顺序发生变化（pH4.2、2.5时维生素B6在前，pH3.1时维生素B2在前）；当pH为2.5时，各峰峰形及分离度均最优，故最终选择了流动相pH值为2.5。经比较多种不同的梯度洗脱方式，本发明所用梯度最佳，建立了本发明所用色谱条件。

3.2波长选择

经使用二极管阵列检测器采集混合对照品溶液色谱图后，提取各物质的紫外图谱，结果盐酸赖氨酸、泛酸钙无最大吸收，烟酰胺、维生素B6、维生素B2、香草醛、维生素B1、10-羟基-2-葵烯酸的最大吸收波长分别为261、290、267、279、246、212nm，由于各物质的浓度及响应均相差较大，为了更好的能够同时测定该8种物质，故综合考虑，使用了“2.1色谱条件”项下的测定波长。

3.3本品多个成分含量偏低

24批样品测定结果中，烟酰胺、维生素B2含量较高，维生素B1次之；盐酸赖氨酸、泛酸钙、维生素B6、香草醛、10-羟基-2-葵烯酸含量较差，均存在低于标示量70%的情况，其中盐酸赖氨酸含量严重偏低，且批号与含量之间存在一定的关联：旧批号产品含量普遍低于新批号产品，提示本品产品质量存在严重的问题，急需重视。

3.4含量偏低原因分析

本品处方复杂，含有大量的还原性糖葡萄糖及盐酸赖氨酸、泛酸钙、烟酰胺等含有氨基的化合物。根据现有文献可知，葡萄糖可以在湿热的条件下与含有氨基的化合物发生美拉德反应，导致此类化合物含量下降并生成大量的褐色类物质；泛酸钙吸湿性高且化学稳定性差，对水、热、酸、碱敏感，与其他酸性维生素如抗坏血酸、硫胺素和盐酸吡多辛等混合使用时，会导致泛酸钙降解，丧失活性；香草醛由于香草醛的醛基易氧化而稳定性较差。本品生产工艺为湿法制粒、热风干燥为美拉德反应提供了条件，结合加速稳定性、原辅料相容性研究结果，基本可以判定为本品成分含量下降的原因为生产及存储过程中成分间相互发生了美拉德反应，导致含量下降。

此外本品现行质量标准缺失关键性检测项目，无法有效控制本品各有效成分的含量。生产企业也未关注产品中除葡萄糖之外的其他主成分含量，一直沿用该标准进行检验，造成产品质量控制存在严重缺陷。

3.4小结

综上，本发明所建立的HPLC-DAD法能有效地同时测定口服五维赖氨酸葡萄糖颗粒中的8种成分。经检验，多个成分含量偏低，所建立的方法准确，专属性好，有效的弥补了现行质量标准的缺陷，可有效地用于该产品的质量控制。

实施例2

一种同时测定口服五维盐酸赖氨酸葡萄糖中多种成分含量的方法，采用HPLC-多波长法同时对口服五维盐酸赖氨酸葡萄糖中的盐酸赖氨酸、泛酸钙、维生素B1、维生素B2、烟酰胺、香草醛、维生素B6以及10-羟基-2-葵烯酸8种成分的含量进行测定，具体包括如下步骤：

（1）色谱条件：以Alltima-C18( 250 mm ×4.6 mm，5 μm)为色谱柱，以5mmol/L庚烷磺酸钠溶液（用20%磷酸溶液调节pH值为2.5）为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为：0～45min，流动相A的体积百分比为95％～77％，流动相B的体积百分比为5％～23％；45～57min，流动相A的体积百分比为77％，流动相B的体积百分比为23％；57～58min，流动相A的体积百分比为77％～95％，流动相B的体积百分比为23％～5％；58～65min，流动相A的体积百分比为695％，流动相B的体积百分比为5％；流速为1ml/min，柱温为40℃，检测波长200nm（盐酸赖氨酸、泛酸钙）、211nm（10-HDA）、261nm（维生素B1、维生素B2、烟酰胺、香草醛）、290nm（维生素B6），进样量为20 μL；

（2）对照品溶液的制备：

①各对照品储备液（1）：精密称取盐酸赖氨酸对照品52.26mg、烟酰胺对照品10.56mg、香草醛对照品18.93mg、10-HDA对照品17.82mg置于同一50ml容量瓶中，加入0.1%磷酸溶液约30ml，超声并同时振摇使溶解，待用；

②各对照品储备液（2）：精密称取维生素B1对照品10.70mg、维生素B6对照品13.03mg、泛酸钙对照品10.11mg分别置于10ml容量瓶中，加入0.1%磷酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；维生素B2对照品10.89mg置于20ml量瓶中，加入水5ml，磷酸1ml，水浴加热振摇使溶解，取出，冷至室温，用水稀释至刻度，摇匀，即得；

③混合对照品储备液：分别精密量取维生素B1、维生素B6、泛酸钙、维生素B2对照品储备液各4、1、3、2ml同置于①项下对照品储备液（1）的50ml量瓶中，用0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得；

④混合对照品溶液的制备：精密量取③项下的混合对照品储备液2ml置于10ml量瓶中，用0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得；

（3）供试品溶液的制备：

取本品10包的内容物，混匀，研细，称取2g，精密称定，置于10ml量瓶中，加入0.1%磷酸溶液6ml，超声并振摇使溶解，冷至室温，用0.1%磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即可得到；若供试液含全脂乳粉，需要先以9000rpm、0℃冷冻离心10 min后，取上清液趁冷用滤膜滤过，取续滤液，即得；

（4）测定：分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，照上述的色谱条件进行测定，记录色谱图、峰面积值，以峰面积计算样品中盐酸赖氨酸、泛酸钙、维生素B1、维生素B2、烟酰胺、香草醛、维生素B6以及10-羟基-2-葵烯酸8种成分的含量。