一种用于同时检测牛疱疹病毒4、5型的引物、探针和试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学病毒检测技术领域，更具体的说是涉及一种用于同时检测牛疱疹病毒4、5型的引物、探针和试剂盒。

背景技术

牛疱疹病毒4型(Bovine herpesvirus virus，BHV4)是丙型疱疹病毒科。非洲水牛是BHV4的自然宿主,病畜及带毒病畜为主要传染源。流行无明显的季节性。牛感染本病后,自然条件下可不定期排除病毒,这与本病的传播流行有密切关系,本病通过直接接触和间接接触传播,接触病畜的分泌物、排泄物等可经消化道感染,呼吸道、眼结膜、子宫内均可感染本病,人工受精也是其传播的潜在途径。感染后主要呈隐性经过,但合并感染、应激因素、社会因素、发情以及分娩等可能与本病发作有关。这种病毒亦有不同的临床征兆,例如结膜炎、肺炎和上呼吸道炎症、皮肤病损、乳房皮炎、肠炎、产后子宫炎、慢性子宫炎的牛身上分离到。另外,BHV4还与流产相关,在流产胎儿中发现。研究发现睾丸炎中的BHV4也有通过精液传播的可能性。而该病多为牛的隐性感染,合并其他病原后,可能使临床症状加剧,且表现多样化,给诊断和治疗带来较大困难,对养牛业构成严重威胁。

牛疱疹病毒5型(Bovineherpesvirusvirus，BHV5)属于α疱疹病毒科、疱疹疹病毒亚科、水痘病毒属。该病毒能够引起牛致命性的脑膜脑炎。能进入中枢神经系统,引起小牛严重的致死性的脑膜脑炎,引起成年牛亚临床症状。自然宿主是牛,其中对六个月内的小牛易感,感染迅速且是致命的,成年牛相对不易感。而潜伏感染的动物体内带毒,再激活时可以感染易感动物。绵羊和山羊也可以感染。给养牛业造成很大的损失。

随着养牛业的发展，大规模和集约化的饲养增加了牛与牛之间的身体接触，从而加速传染病的传播，目前国内外尚无针对BHV4和BHV5感染治疗的特效药物，奶业发达国家应用灭活疫苗或减毒疫苗预防本病，而我国尚无相关商品化疫苗。国内针对BHV4、BHV5病原荧光定量PCR检测方法少有报道。

因此，能否提供一种用于同时检测牛疱疹病毒4、5型的引物、探针和试剂盒是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种用于同时检测牛疱疹病毒4、5型的引物、探针和试剂盒。建立了快速敏感的检测方法，以便及时采取更有效的针对性措施进行防控，以减少该病毒对养牛业造成的经济损失。综合光谱技术、传统的PCR技术和计算机技术，其灵敏度高，特异性强，并且可以监测PCR扩增的所有过程，还能对样品准确定量，可同时检测2种病毒感染情况，省时省力

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于同时检测牛疱疹病毒4、5型的引物、探针组合，包括：用于检测牛疱疹病毒4型的上游引物BHV4-F、下游引物BHV4-R、探针BHV4-P；用于检测牛疱疹病毒5型的上游引物BHV5-F、下游引物BHV5-R、探针BHV5-P；

上游引物BHV4-F的核苷酸序列，如SEQ ID NO:1所示；

下游引物BHV4-R的核苷酸序列，如SEQ ID NO:2所示；

探针BHV4-P的核苷酸序列，如SEQ ID NO:3所示；

上游引物BHV5-F的核苷酸序列，如SEQ ID NO:4所示；

下游引物BHV5-R的核苷酸序列，如SEQ ID NO:5所示；

探针BHV5-P的核苷酸序列，如SEQ ID NO:6所示。

优选的：探针的5’端连接有荧光基团，3’端连接有荧光淬灭基团。

优选的：探针BHV4-P的荧光基团：FAM，荧光淬灭基团：TAMRA；探针BHV5-P的荧光基团：ROX，荧光淬灭基团：BHQ2。

本发明还提供了基于上述任一组合的检测试剂盒。

优选的：还包括还含有2×ChamQ Geno-SNP Probe MasterMix、参考品、阴性对照和阳性对照。

优选的：参考品为一组含有不同浓度的参考品，每个浓度的参考品包括2种相同浓度的重组质粒混合物的试剂，2种重组质粒：BHV4重组质粒、BHV5重组质粒；

BHV4重组质粒的构建方法：

参考现有基因序列合同BHV4 gB基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，PCR扩增，纯化，再与pUC57 Vector载体连接；

BHV5重组质粒的构建方法：参考现有基因序列合同BHV5 gC基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，PCR扩增，纯化，再与pUC57 Vector载体连接。

优选的：上游引物BHV4-F的浓度为200nmol/L、下游引物BHV4-R的浓度为200nmol/L、探针BHV4-P的浓度为200nmol/L；上游引物BHV5-F的浓度为200nmol/L、下游引物BHV5-R的浓度为200nmol/L、探针BHV5-P的浓度为300nmol/L；

连接：向0.2ml EP管中依次加入pUC57 Simple Vector 1μl，4μl PCR扩增产物，加无菌水至总体积为10μl，轻轻吹打混合均匀后，25℃孵育30min；2种相同浓度的重组质粒的具体浓度分别均为：1×10

优选的：阴性对照：工艺用水；阳性对照：混合的BHV4重组质粒、BHV5重组质粒，每种重组质粒浓度为1×10

本发明还提供了一种基于上述任一的试剂盒的非诊断治疗目的定性、定量检测的方法，包括以下步骤：

1)荧光定量PCR标准曲线的建立；

2)提取待测样品的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板进行双重实时荧光定量PCR；

3)结果判断：用得到的Cq值或荧光信号的变化对BHV4型和/或BHV5型牛进行定性检测，出现“S”型扩增曲线表明待测样品中含有BHV4型和/或BHV5型；再根据荧光信号的强度和步骤1)中的标准曲线，得出待测样品中所含BHV4型和/或BHV5型的拷贝数，实现定量检测；

双重实时荧光定量PCR反应体系，其包括：模板2μL，实时荧光定量2×ChamQ Geno-SNP Probe MasterMix 12.5_μL，10μmol/L BHV4型上游引物0.5μL，10μmol/L BHV4型下游引物0.5μL，10μmol/L BHV4型探针1μL，10μmol/L BHV5型上游引物0.5μL，10_μmol/L BHV5下游引物0.5μL，10μmol/L BHV5探针0.75μL，RNase-Free ddH

步骤3)具体判定方法：

①若待测样品只在FAM通道中的扩增曲线为标准的S型曲线，且CT值≤37，则结果判定为BHV4病毒核酸阳性；

②若待测样品只在ROX通道中的扩增曲线为标准的S型曲线，且CT值≤37，则结果判定为BHV5病毒核酸阳性；

③若待测样品在FAM和ROX两个通道中的扩增曲线均为标准的S型曲线，CT值≤37，则结果判定为BHV4和BHV5病毒核酸阳性；

④若待测样品37＜CT值≤40，出现“S”型扩增曲线，则结果判定为可疑，即该样品需要进行复检；

⑤若待测样品CT值＞40，则结果判定为阴性。

本发明还提供了上述3任一组合，或上述任一试剂盒，或方法在畜牧养殖中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种用于同时检测牛疱疹病毒4、5型的引物、探针和试剂盒，取得的技术效果为本发明的试剂盒具有操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性好，可以同时实现对BHV4和BHV5的定性检测和准确定量的技术优势。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明提供的实施例3中双重荧光定量PCR标准曲线。

图2附图为本发明提供的实施例4中BHV4双重荧光定量PCR敏感性检测结果图，其中，1-7：1×10

图3附图为本发明提供的实施例4中BHV5双重荧光定量PCR敏感性检测结果图，其中，1-7：1×10

图4附图为本发明提供的实施例5的特异性检测结果图，其中，1：BHV4阳性质粒；2：BHV5阳性质粒；3：阴性对照和其他病毒核酸。

图5附图为本发明提供的实施例6中双重荧光定量PCR试验结果图，其中左图：BHV4和BHV5双重荧光定量PCR的组内重复性试验试验结果；右图：组间重复性试验试验结果。

图6附图为本发明提供的整体技术流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了一种用于同时检测牛疱疹病毒4、5型的引物、探针和试剂盒。

实施例中，未提及的原料、试剂均为市售获得，例如：ChamQ Geno-SNP ProbeMasterMix、RNase-Free ddH

未提及的实验操作工艺为常规实验步骤，在此不再一一赘述。

技术流程参见图6。

实施例1

实施例参考GenBank上发表的BHV4 oocyte_h3分离株(KP209031.1)、4864/V99分离株(AJ617688.1)、YL分离株(GQ375280.1)、TR2011-TGVS550分离株(MK543551.)、KAS24-LOK-TR2017分离株(MG181945.1)的gB基因序列，利用Lasergener软件中MegAlign程序进行多序列比对，选取gB基因片段上的保守序列分别设计合成了一对特异性引物和一个探针。上下游引物和探针分别命名为BHV4-F、BHV4-R和BHV4-P，探针5'端的荧光报告集团为FAM，3'端的荧光淬灭集团为TAMRA。

参考GenBank上发表的BHV5 TX89分离株(U35883.1)、UruguaiT4分离株(KJ143571.1)、瑞士分离株(Z49224.1)、EVI-190分离株(AY052396.1)的gC全基因序列，利用Lasergener软件中MegAlign程序进行多序列比对，选取gC基因片段上的保守序列分别设计合成了一对特异性引物和一个探针。上下游引物和探针分别命名为BHV5-F、BHV5-R和BHV5-P，探针5'端的荧光报告集团为ROX，3'端的荧光淬灭集团为BHQ2。具体的，引物和探针序列如表1所示：

表1

实施例2

基于上述引物、探针用于同时检测牛疱疹病毒4、5型的试剂盒，试剂盒包括核酸扩增试剂：用于检测牛疱疹病毒4型的上游引物BHV4-F的浓度为200nmol/L、下游引物BHV4-R的浓度为200nmol/L、探针BHV4-P的浓度为200nmol/L；

用于检测牛疱疹病毒5型的，上游引物BHV5-F的浓度为200nmol/L、下游引物BHV5-R的浓度为200nmol/L、探针BHV5-P的浓度为300nmol/L。

可选的，核酸扩增试剂中还含有2×ChamQ Geno-SNP Probe MasterMix。

可选的，试剂盒中含有用于定量的参考品，参考品中含有2种重组质粒：BHV4重组质粒、BHV5重组质粒；

其中，BHV4重组质粒(pUC57-BHV4)的合成：

参考GenBank上发表的BHV4 oocyte_h3分离株(KP209031.1)、4864/V99分离株(AJ617688.1)、YL分离株(GQ375280.1)、TR2011-TGVS550分离株(MK543551.)、KAS24-LOK-TR2017分离株(MG181945.1)的gB基因序列，合成一段全长430bp的BHV4 gB基因序列(TCGCTCTAATTAAGGTATGCAGTTTCAACCAGACCACTACACANTCAACCACAACCTCACCAAGTATTTCATCAACCACCTCTTCCACAACAACATCAACAAGCCAGCCATCAAACACAACCTCAACAAATAGTTCATTAGCTGCCTCTCCCCAGAACACGTCAACAAGCAAGCCATCCACTGATAATCAGGGTACCAGTACCCCCACTATTCCAACTGTTACTGATGACACAGCCAGTAAAAATTTTTATAAATACAGAGTATGCAGTGCATCATCTTCCTCTGGAGAACTATTCAGATTTGACCTTGATCAGACATGTCCAGATACAAAAGATAAAAAACATGTGGAAGGCATCCTGCTGGTACTAAAAAAGAATATTGTCCCATACATCTTCAAAGTGAGGAAATATAGAAAAATTGCCACCTCAGT，如SEQ ID NO:7所示)，并将序列连接到pUC57Vector克隆载体上，获得重组质粒。

BHV5重组质粒(pUC57-BHV5)的合成：

参考GenBank上发表的BHV5 TX89分离株(U35883.1)、UruguaiT4分离株(KJ143571.1)、瑞士分离株(Z49224.1)、EVI-190分离株(AY052396.1)的gC基因序列，合成一段全长418bp的BHV5 gC基因序列(AGCTGGGCGGCAACTACATCTTCCCCTCGCCCGCCGACCCCGGCAGACTGCCCCTGACCGTGCGCTCCCTGACCGCCGCAGACGAGGGCGTGTACACCTGGCGCCGCGACGCGGGCGCCAAGTCGCAGCGCAAGGTCGTGACCGTCACGACGTACCGCGCACCCGCCGTCTCCGTCGAGCCCCGGCCGACGCTGGAGGGCGCCGGCTACGCGGCCGTGTGCCGCGCCGCCGAGTACTACCCGCCGCGCTCCACGCGCCTGCGCTGGTTCCGCAACGGCTACCCCGTGGAGGCTCGGCACGCGCGCGACGTCTTTACGGTCGACGACTCCGGGCTCTTTTCGCGCACGTCCGTCCTCACGCTCGAGGACGCGACGCCAACCGCCCACCCGCCCAACCTGCGCTGCGAGGTTTCCTGGTT，如SEQID NO:8所示)，并将序列连接到pUC57Vector克隆载体上，获得重组质粒。

重组质粒提取及鉴定

(1)委托生工生物工程(上海)股份有限公司具体处理：

将PCR扩增完毕，电泳检测产物，采用PCR产物纯化试剂盒纯化后用于连接。

BHV4 PCR扩增反应：向0.2ml EP管中依次加入如下试剂Taq PCR Master Mix(2×,blue dye)25μl，上游引物(TCGCTCTAATTAAGGTATGCA GTT)2μl、下游引物(ACCACCCTCTGTAAACTGTCA)2μl，加入含目的序列合成的DNA 1μl，加无菌水至总体积为50μl，轻轻吹打混合均匀。扩增程序如下预变性94℃，4min；94℃，30s，54℃，30s，72℃，30s，进行32个循环；终延伸72℃，10min；4℃保存。

BHV5 PCR扩增反应：向0.2ml EP管中依次加入如下试剂2×High GC PCR Buffer(with Mg

(2)连接反应：向0.2ml EP管中依次加入如下试剂pUC57 Simple Vector 1μl，4μl回收产物，加无菌水至总体积为10μl，轻轻吹打混合均匀后，室温(25℃)孵育30min。

取5～10μl上一步骤的反应样品加入到50～100μl DH5a等感受态细胞中(注意所加入的DNA样品体积不要超过感受态体积的1/10)，轻轻混匀，将该混合物置于冰上30min。42℃水浴中90s进行热激，然后迅速放回冰浴中，静置3～5min。加入500μl不含抗生素的SOC或LB培养液，轻轻混匀，37℃震荡培养1h。将菌液5000rpm离心1min以沉淀菌体。吸去大部分培养液，剩余约50～100μl的培养液，重悬菌体。然后全部均匀涂布到含适当抗生素的LB平板上，37℃培养箱中培养过夜。第二天挑取平板上的克隆进行菌落PCR或者提取质粒进行酶切鉴定，BHV4型重组质粒酶切位点为XbaI/BamHI；BHV5型重组质粒酶切位点为XbaI/BamHI。

BHV4或BHV5菌落鉴定PCR反应：向0.2ml EP管中依次加入如下试剂Taq PCRMaster Mix(2×,blue dye)12.5μl，M13通用上游引物(CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC)1μl、M13通用下游引物(AGCGGATAACAATTTCACACAGGA)1μl，加入菌落DNA 1μl，加无菌水至总体积为25μl，轻轻吹打混合均匀。扩增程序如下预变性95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，30s，进行35个循环；终延伸72℃，7min；4℃保存。

(3)将生工生物工程(上海)股份有限公司合成的重组质粒转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中，制备成重组大肠杆菌pUC57-BHV4-JM109株和pUC57-BHV45-JM109株，扩培，提取质粒DNA，使用Nanodrop测定浓度，得到重组质粒，分别命名为BHV4重组质粒和BHV5重组质粒。

质粒提取试剂盒初次使用前，将全部的RNase A加入到Resuspension Solution中，置于4℃保存(可使用6个月)。Wash Solution在使用前加入指定体积的无水乙醇(35mL)，Lysis Solution和Neutralization Solution检查是否出现沉淀，若有沉淀则放置于37℃温浴溶解，待冷却至室温后再使用。

具体提取过程如下：

(1)取5～8mL在氨苄抗性的液体LB培养基中培养过夜的菌液，8000g离心5min，弃尽上清液。

(2)加250μL Resuspension Solution，悬浮均匀后转移至洁净1.5mLEP管中。

(3)加250μL Lysis Solution，将离心管上下翻转4～6次混匀，使菌体裂解为透亮的溶液。此步骤不宜超过5min。

(4)加入350μL Neutralization Solution，温和翻转充分混合4～6次，13000rpm离心5min。

(5)步骤(4)中离心的上清液转移至2mL制备管中，13000rpm离心1min，弃滤液。

(6)将制备管放回离心管中，加500μL Wash Solution，13000rpm离心1min，弃滤液。

(7)重复步骤(6)。

(8)将制备管置回离心管，13000rpm离心1min。

(9)将制备管放于新的1.5mLEP管中，在制备膜中央加入50μL Elution Buffer，室温静置2min，13000rpm离心2min，丢弃柱并将纯化质粒DNA储存在-20℃。

拷贝数的计算及稀释

测定2个重组质粒的浓度，并通过计算公式：质粒拷贝数(copies/μL)＝6.02×(重组质粒浓度ng/μL×10

BHV4重组质粒浓度为270ng/μL，通过相应的公式可算出质粒拷贝数为7.84×10

BHV5重组质粒浓度为100ng/μL，通过相应的公式可算出质粒拷贝数为5.87×10

可选的，参考品为一组含有不同浓度的上述2种重组质粒(BHV4重组质粒和BHV5重组质粒)混合物的试剂，每种重组质粒的具体浓度分别为：1×10

可选的，试剂盒中含有阴性对照和阳性对照，阴性对照为工艺用水，阳性对照中含有上述2种重组质粒(BHV4重组质粒和BHV5重组质粒)的混合物，阳性对照中相同拷贝数的2种重组质粒等体积混合。

具体如表2：

表2

/>

实施例3

基于实施例提供的试剂盒，同时检测牛疱疹病毒4型和牛疱疹病毒5型的非疾病诊断目的定性、定量检测方法。

1)荧光定量PCR标准曲线的建立：

将浓度为1x10

各重组质粒的实时荧光定量PCR扩增曲线如图1所示，从图1中得出的BHV4的标准曲线回归方程为y

2)样本处理：

进行核酸提取(推荐使用商业化的试剂盒来提取DNA)，阴性对照与标本同时处理。提取完的核酸建议立即进行检测，否则请于-20℃以下保存。

扩增试剂准备：

双重荧光定量PCR反应液体系每头份1均按如下配制：12.5μL 2×ChamQ Geno-SNPProbe Master Mix+0.5μL BHV4上下游引物(10μmol/L)+0.5μL BHV5上下游引物(10μmol/L)+0.5μL BHV4探针(10μmol/L)+0.75μL BHV5探针(10μmol/L)+7.25μL RNase-FreeddH

加样：

取出试剂盒中对照品、参考品以及样本处理液，室温融化并混匀后，1500rpm离心15s。分别加2μL至装有上述PCR预混液的PCR管中。每个反应体系的总体积为25μL。盖紧PCR管盖，1500rpm离心15s后，将其移至检测扩增区。

双重荧光定量PCR扩增：双重荧光定量PCR扩增的条件具体如表3所示：

表3

双重荧光定量PCR 25μL反应体系如表4所示：

表4

3)检测结果判定标准：

用得到的CT值或荧光信号的变化实现对BHV4和BHV5定性检测，不同荧光通道出现标准的“S”型扩增曲线，表明待测样品中含有BHV4和/或BHV5病毒，再根据荧光信号的强度和上文提供的标准曲线，得出待测样品中所含有BHV4和/或BHV5病毒的拷贝数，实现定量检测。

具体判定方法：

①若待测样品只在FAM通道中的扩增曲线为标准的S型曲线，且CT值≤37，则结果判定为BHV4病毒核酸阳性；

②若待测样品只在ROX通道中的扩增曲线为标准的S型曲线，且CT值≤37，则结果判定为BHV5病毒核酸阳性；

③若待测样品在FAM和ROX两个通道中的扩增曲线均为标准的S型曲线，CT值≤37，则结果判定为BHV4和BHV5病毒核酸阳性；

④若待测样品37＜CT值≤40，出现“S”型扩增曲线，则结果判定为可疑，即该样品需要进行复检；

⑤若待测样品CT值＞40，则结果判定为阴性。

实施例4

双重荧光定量PCR的敏感性试验

模板为1×10

得到的实验结果如图2和图3所示。

根据图2、3可知，建立的BHV4和BHV5定量PCR敏感性最低检检测限均为1×10

双重荧光定量PCR的特异性试验

为了确定该方法的特异性，分别以牛传染性鼻气管炎病毒(牛疱疹病毒I型)、牛副流感病毒、魏氏梭菌A型、B型和C型、D型、牛巴氏杆菌A型和B型的核酸为模板，阳性对照分别为BHV4和BHV5的阳性质粒，阴性对照为ddH

从图4可看出，除了BHV4和BHV5的阳性质粒产生了扩增曲线，其他病毒的核酸未产生扩增曲线。

双重荧光定量PCR的重复性试验

选用三个不同拷贝数的混合标准品，即1×10

从表5和图5中可看出，同一模板CT值差异小，扩增曲线聚拢；同一浓度的阳性混合质粒检测CT值组内组间重复变异系数均小于2％，

表明本发明实施例的方法的重复性和稳定性良好。

表5

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。